Общие принципы лабораторной диагностики наследственных болезней обмена веществ

На клиническом уровне диагноз НБО может быть только заподозрен, и дальнейшая диагностика целиком зависит от применения необычайно широкого спектра биохимических и молекулярно-генетических методов. В большинстве случаев только сочетанная интерпретация всех полученных результатов дает возможность точно определить форму заболевания.

Стратегия достоверной диагностики НБО включает несколько этапов: 1. Выявление дефектного звена метаболического пути посредством анализа (количественного, полуколичественного или качественного) соответствующих метаболитов; 2. Выявление дисфункции белка посредством оценки его количества и/или активности; 3. Выяснение природы мутации, т.е. характеристика мутантного аллеля на уровне гена.

Такая стратегия используется не только для решения научных проблем, касающихся изучения нормального метаболизма, молекулярных механизмов патогенеза НБО, выявления гено-фенотипических корреляций, она необходима прежде всего для практической диагностики НБО. Верифицировать диагноз на уровне белка и мутантного гена необходимо как для проведения пренатальной диагностики, медико-генетического консультирования отягощенных семей, так и в ряде случаев для назначения адекватной терапии. Например, при недостаточности дигидроптеридинредуктазы клинический фенотип и уровни фенилаланина будут неотличимы от классической формы ФКУ, но подходы к терапии этих заболеваний принципиально отличаются. Важность локусной дифференциации НБО для медико-генетического консультирования может быть продемонстрирована на примере мукополисахаридоза II типа (болезнь Хантера). По спектру экскретируемых гликозаминогликанов невозможно дифференцировать между собой мукополисахаридозы II, I и VII типов, но из этих заболеваний только болезнь Хантера наследуется по Х-сцепленному рецессивному типу, что имеет принципиальное значение для прогноза потомства в отягощенной семье. Безусловна приоритетность молекулярно-генетических методов при установлении гетерозиготного носительства, а также в пренатальной диагностике заболеваний, при которых мутантный фермент не экспрессируется в клетках ворсин хориона.

Этап исследования метаболитов

Оценка метаболитов в биологических жидкостях - необходимый этап диагностики аминоацидопатий, органических ацидурий, мукополисахаридозов, митохондриальных и пероксисомных болезней, дефектов метаболизма пуринов и пиримидинов и т.д. Хроматографические методы анализа играют важнейшую роль в диагностике НБО. Это обусловлено тем, что современный арсенал хроматографических технологий чрезвычайно широк и позволяет эффективно и информативно разделять сложные многокомпонентные смеси, к которым в том числе относится и биологический материал. Для селективного скрининга НБО успешно используется тонкослойная хроматография, позволяющая получать информацию на качественном уровне. Этот метод хроматографии применим для разделения аминокислот, пуринов и пиримидинов, углеводов, олигосахаридов. Для количественного анализа маркеров-метаболитов НБО успешно применяются такие хроматографические методы как газовая и высокоэффективная жидкостная хроматографии, а также хроматомасс-спектрометрия (ГХ, ВЭЖХ и ХМС соответственно). ГХ и ВЭЖХ являются универсальными методами разделения сложных смесей соединений, отличаются высокой чувствительностью и воспроизводимостью. В обоих случаях разделение осуществляется в результате различного взаимодействия компонентов смеси с неподвижной и подвижной фазами хроматографической колонки. Для ГХ подвижной фазой является газ-носитель, для ВЭЖХ - жидкость (элюент). Выход каждого соединения фиксируется детектором прибора, сигнал которого преобразуется в пики на хроматограмме. Каждый пик характеризуется временем удерживания и площадью. Следует отметить, что ГХ проводится, как правило, при высокотемпературном режиме, поэтому ограничением для ее применения является термическая неустойчивость соединений. Для ВЭЖХ не существует подобных ограничений, т.к. в этом случае анализ проводится в мягких условиях. ХМС представляет собой комбинированную систему ГХ или ВЭЖХ с масс-селективным детектором, что позволяет получать не только количественную, но и качественную информацию, т.е. дополнительно определяется структура соединений в анализируемой смеси.

Одним из перспективных направлений в развитии программ диагностики НБО является применение методов, позволяющих количественно определять множество метаболитов, являющихся маркерами разных групп НБО. К таким методам относится тандемная масс-спектрометрия (ТМС). ТМС позволяет охарактеризовать структуру, молекулярную массу и провести количественную оценку 3000 соединений одновременно. При этом не требуется длительной подготовки проб для проведения анализа (как, например, для ГХ), а время исследования занимает несколько секунд.

Этап исследования мутантных белков

Исследование мутантных белков может проводиться с помощью различных методов:

1. Определение активности фермента с применением естественных субстратов;
2. Определение активности фермента с использованием искусственных субстратов;
3. Нагрузка культивируемых фибробластов накапливаемыми субстратами;
4. Измерение концентрации белка с помощью иммунохимических методов.

Материалом для измерения активности ферментов при НБО являются прежде всего лейкоциты периферической крови: практически при всех лизосомных болезнях накопления, метилмалоновой ацидурии, некоторых гликогенозах. Для диагностики GM2-ганглиозидозов, недостаточности биотинидазы используют плазму или сыворотку крови. В некоторых случаях объектами исследования являются мышечная или печеночная ткань: ферменты дыхательной цепи митохондрий, гликогенозы. Также широко используется для диагностики культура кожных фибробластов.

Этап исследования мутантных генов

Развитие методов молекулярной биологии явилось настоящей революцией в области клинической биохимии. Разработка стандартных протоколов молекулярных исследований и автоматизация используемых методов являются сегодня законченным комплексом диагностических подходов и становятся наряду с биохимическими методами рутинной процедурой в клинических лабораториях. Быстрое развитие исследований в области расшифровки генома человека и определение ДНК- последовательности генов делает сейчас возможным ДНК-диагностику различных наследственных заболеваний. Методы ДНК-диагностики и анализа структуры нормальных генов и их мутантных аналогов при наследственных болезнях обмена начали использоваться в течение последнего десятилетия.

Для ДНК-диагностики наследственных заболеваний используются два основных подхода - прямая и косвенная ДНК-диагностика. Прямая ДНК-диагностика представляет собой исследование первичной структуры поврежденного гена и выделение мутаций, ведущих к заболеванию. Для детекции молекулярных повреждений в генах, обуславливающих наследственные болезни, используется стандартный арсенал методов молекулярной биологии. В зависимости от характеристики и типов мутаций, частот их встречаемости при различных наследственных заболеваниях, те или иные методы являются наиболее предпочтительными.

Для диагностики НБО в тех случаях, когда биохимический дефект точно известен, легко и достоверно определяем с использованием биохимических методик, ДНК-методы вряд ли займут приоритетное место. В этих случаях применение ДНК-анализа является скорее научно-исследовательским, а не диагностическим подходом. Однако после точно установленного диагноза методы ДНК-анализа будут полезны для последующей пренатальной диагностики, идентификации гетерозиготных носителей в семье и прогноза заболевания у гомозигот, а также для отбора больных с целью проведения казуальной терапии в будущем (фермент-заместительной и генотерапии). Также в случаях, когда биохимический дефект точно не известен, биохимическая диагностика затруднена, недостаточно достоверна или требует инвазивных методов исследования, методы ДНК-диагностики являются единственными и незаменимыми для точной постановки диагноза.

В общем виде тактика проведения диагностики НБО в каждом конкретном случае должна планироваться совместно с врачом-биохимиком и врачом-генетиком. Необходимыми условиями успешной и быстрой диагностики является понимание этиологии, механизмов патогенеза заболевания, знание специфических биохимических маркеров.

Лаборатория наследственных болезней обмена веществ была создана в Медико-генетическом научном Центре более 30 лет назад. Первые работы в лаборатории были связаны с разработкой тестов для выявления фенилкетонурии и программ селективного скрининга наследственные болезни обмена веществ (НБО). Постепенно лаборатория перешла к применению сложных биохимических и молекулярно-генетических методов точной диагностики наследственных заболеваний. Именно здесь под руководством профессора Ксении Дмитриевны Краснопольской были разработаны подходы к биохимической диагностике болезней клеточных органелл. Сегодня это единственная в России лаборатория, где проводится постнатальная и пренатальная диагностика подавляющего большинства заболеваний из этой группы.

Одним из научных направлений работы подразделения является поиск новых биохимических маркеров для наследственных болезней, разработка новых методов их эффективной диагностики.

Спектр биохимических методов, используемых в лаборатории, исключительно широк и включает: электорофорез гликозаминогликанов мочи, изоэлектрофокусирование трансферинов, хромато-масс-спектрометрию, высокоэффективную жидкостную хроматографию, анализ активности лизосомных и митохондриальных ферментов с применением хромогенных и флуорогенных субстратов, окисграфии. Некоторые из форм НБО, ранее не выявляемые в нашей стране, в лаборатории были диагностированы впервые.

Существенным прорывом в диагностике НБО стало внедрение метода тандемной масс-спектрометрии, который позволяет в микроколичествах биологического материала (пятно высушенной крови или плазмы) выявлять около 30 форм наследственных заболеваний из групп самых распространенных НБО: аминоацидопатий, органическиих ацидурий и дефектов митохондриального β-окисления.

Последние годы в лаборатории активно развиваются имолекулярно-генетические методы. Для некоторых заболеваний из группы НБО созданы протоколы ДНК-диагностики, позволяющие сократить время установления диагноза и избежать применения трудоемких и инвазивных биохимических методов. С 2015 года в лаборатории применяют секвениование нового поколения для одновременного анализа множества генов. Такие панели разработаны для митохондриальных заболеваний, наследственных болезней с преимущественным поражением печени, лейкодистрофий/ лейкоэнцефалопатий.

На сегодняшний день используемые биохимические и молекулярно-генетические методы позволяют диагностировать более 200 различных форм наследственных болезней обмена веществ.

В лаборатории ведется работа по характеристике спектра и частоты мутаций при наследственных мукополисахаридозах, сфинголипидозах, нейрональных цероидных липофусцинозах, разрабатываются алгоритмы диагностики заболеваний, протекающих с поражением белого вещества головного мозга, а также других наследственных нейрометаболических нарушений.

Оказывая медицинские услуги, врачи должны в первую очередь оставаться людьми. Найдя лаборатория наследственных болезней обмена у нас, не забывайте оставлять мнения.

Лечение должно быть профессиональным, Лаборатория наследственных болезней обмена веществ - здесь врачи окажут качественные услуги и лечение без последствий. Запись на прием в считанные минуты, свежие отзывы.

В вашем городе есть Лаборатория наследственных болезней обмена веществ отзывы, пользуйтесь услугами больниц и клиник, врачей по проверенным данным. Запись на прием к врачам из Лаборатория наследственных болезней обмена веществ Москва, через наш сайт стала еще проще!

Медико-генетический научный центр РАМН. Сайт лаборатории наследственных болезней обмена содержит информацию о лабораторной диагностике редких наследственных заболеваний, их клинических проявлениях и возможностях лечения. На сайте: тандемная масс-спектрометрия / заболевания, выявляемые с помощью ТМС / показания для проведения анализа ТМС / лизосомные болезни накопления / правила забора крови / прейскурант / образец направления на анализ / как к нам проехать / полезные ссылки

Как доехать

Поможем найти лучшие медицинские предложения и в какую больницу москвы везут с заболеванием хпн2 с адреса катукова19 для своих родных и близких.

Схема проезда до анализ тмс без пробок, на метро или собственном автомобиле.

Отзывы и вопросы

Анна Мигненко, 01.09.2015

Здравствуйте. Мы из Ставрополя. Ребенку 3,5 года. Обращались за консультацией к генетику в СКККДЦ по поводу задержки психомоторного развития с утратой раннее приобретенных навыков неясного генеза и атаксии неясного генеза.
Были проведенены след. обследования:
-цитогенетическое исследование (кариотип):46,ХХ
-анализ крови на ФА - 0,7 мг%
-ТСХ аминокислот и углеводов крови - без патологии
-ТСХ аминокислот в моче: генерализованная гипераминоацидурия!
-уринализис: лейкоциты ++; тест на ксантуреновую кислоту - слабоположительный.
В условиях лаборатории НБО выполнены:
- анализ крови методом ТМС - данных за за наследственные аминоацидопатии, органические ацидурии и дефекты митохондриального бета-окисления не выявлено;
- энзимодиагностика на 6 болезней накопления - отклонений не выявлено.
Нам была рекомендована консультация Захаровой Екатерины Юрьевны. Подскажите, пожалуйста, как мы можем с ней связаться и записаться на прием?

-- [ Страница 2 ] --

Материалы диссертации применяются в учебном процессе на кафедре медицинской генетики с курсом пренатальной диагностики Государственного бюджетного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации, а также при подготовке клинических ординаторов в ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН.

Личное участие диссертанта.

Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора. Автором были сформулированы цель и задачи исследования, разработаны методические подходы к диагностике различных классов НБО. Сбор первичных данных и проведение лабораторных исследований проведены лично автором или при его непосредственном участии, обработка, анализ и обобщение полученных результатов при написании и оформлении рукописи выполнены лично автором.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 64 научные работы, в том числе 43 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ, методические рекомендации для врачей, патент «Биочип для определения мутаций в гене галактоза-1-фосфат-уридил трансферазы, вызывающих поражение печени у новорожденных детей» № 2423521 от 27.10.2009, 1 руководство для врачей, 2 главы в «Педиатрия: национальное руководство», 1 глава в «Неврология: национальное руководство», 3 главы в «Наследственные болезни: национальное руководство», 1 глава в «Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство».

Структура и объем работы.

Диссертационная работа изложена на 254 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав с описанием методики и результатов исследова­ния, заключения, выводов, библиографии из 288 источников (в том числе 30 на русском и 258 на иностранном языках) и 4 приложений. Работа содержит 40 рисунков и 52 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика выборок и материала для исследований.

В основу работы положены результаты исследований, проведенных в лаборатории наследственных болезней обмена веществ в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (лаб.НБО ФГБУ «МГНЦ» РАМН). Для оценки нозологической структуры группы ЛБН, проведен анализ 902 случаев ЛБН, которые были диагностированы в лаборатории с 1992 - 2009гг. Характеристика относительной частоты подклассов НБО проведена на выборке из 370 пациентов, выявленных при обследовании 9875 пациентов, направленных с подозрением на НБО научно-консультативного отдела ФГБУ «МГНЦ» РАМН, отделений неврологии и эндокринологии ФГБУ «Российская детская клиническая больница» Министерства Здравоохранения РФ, Клиники нервных болезней им. А.Я.Кожевникова Московского Государственного Медицинского Университета им. И.М. Сеченова, ФГБУ «Эндокринологический научный центр Министерства Здравоохранения РФ», ФГБУ «Научный Центр здоровья детей и подростков» РАМН, ФГБУ "Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава России", региональных медико-генетических консультаций.

Частота ЛБН в Центральном Федеральном округе России, рассчитана по числу новых случаев заболеваний диагностированных в лаборатории НБО ФГБУ «МГНЦ» РАМН за период 2000-2009гг. Данные по числу живых новорожденных за этот период по регионам Российской федерации получены по данным Росстата на сайте: (http://gks.ru/wps/wcm/connect/rosstat/). Для расчета частоты применен метод, описанный Poorthuis B.J. с соавт. (1999). Частота рассчитывалась как общее число диагностированных пациентов по отношению к общему числу новорожденных в этот же период (при этом период рождения являлся интервалом между годом рождения старшего пациента и годом рождения младшего пациента в выборке). Если за указанный период был выявлен только один пациент, то учитывалось общее число новорожденных за эти годы.

Образцы пятен крови (n=113), а также данные по концентрации тотальной галактозы в крови у новорожденных с подозрением на галактоземию предоставлены Московским центром неонатального скрининга. Для селективного скрининга на НБО методом МС/МС проанализированы 500 образцов пятен новорожденных из Московского Центра неонатального скрининга и 5205 пациентов из психо-неврологических отделений крупных детских клинических стационаров: ФГБУ «Российская детская клиническая больница» Министерства Здравоохранения РФ, ФГБУ «Научный Центр здоровья детей и подростков» РАМН. Для отбора пациентов на селективный скрининг применены общепринятые критерии, разработанные ранее (Краснопольская К.Д., 2000).

Материалом для биохимической диагностики являлись плазма гепаринизированной венозной крови и/или образцы утренней мочи.

В качестве материала для молекулярно-генетических исследований использованы образцы ДНК, выделенные из цельной крови или пятен высушенной крови на фильтрах.

Экспериментальные методы.

Анализ аминокислот и ацилкарнитинов проведен на квадрупольном тандемном масс-спектрометре PE Sciex API 2000 (PE Sciex, Онтарио, Канада) с положительной ионизацией в электроспрее. Пробоподготовка для анализа аминокислот и ацилкарнитинов методом МС/МС проведена с помощью набора «NeoGram Amino Acids and Acylcarnitines Tandem Mass Spectrometry Kit» (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Wallac OY, Finland).

Газовая хроматография – масс-спектрометрия выполнена на приборе HP5972A, колонка HP-5MS (30м*0,25мм*4 мкм). Концентрация органических кислот в моче определяли в виде триметилсилиловых эфиров.

Для определения активности фермента Г-1-ФУТ использован модифицированный флюориметрический тест Бутлера (Beutler E., 1968).

Для молекулярно-генетического анализа геномную ДНК из цельной крови и пятен крови на фильтрах выделяли, используя набор реактивов Diatom DNA Prep (ООО Биоком, Россия) по методике, рекомендованной изготовителем. Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере “МС2” (АО “ДНК-Технология”, Москва).

Для каждой пары праймеров подобраны условия, отличающиеся необходимой температурой отжига и концентрацией MgCl2. Анализ частых мутаций проводили методами ПЦР, рестрикционного анализа, гель-электрофореза, используя олигонуклеотидный праймеры, последовательности которых подобраны на основании нуклеотидной последовательности генов, опубликованных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Поиск мутаций в генах проведен методом автоматического секвенирования фрагментов ДНК согласно протоколу фирмы производителя на приборе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems).

Статистическая обработка результатов исследований

Оценка статистической значимости результатов проведена с использованием методов параметрической и непараметрической статистики для множественных сравнений. Анализу данных предшествовала проверка распределений значений показателей на соответствие их критериям «нормальности». В случае нормального распределения применен однофакторный дисперсионный анализ ANOVA или ANOVA для повторных измерений, в противном случае – критерий Крускала-Уоллиса и/или критерий Ньюмана-Кейлса. Обработка результатов осуществлена с помощью программного обеспечения Excel 2000, Statistica 6.0

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Спектр и относительные частоты отдельных подклассов НБО

В общей совокупности в лаборатории НБО проводится диагностика 157 различных форм заболеваний, что составляет около 30% от всех известных НБО. За период 2004-2009гг обследовано 9875 пациентов с подозрением на НБО, выявлено 48 различных нозологических форм из 10 различных подклассов НБО у 370 пациентов.

Результаты проведенного анализа показали, что наиболее распространенными формами НБО в обследуемой выборке являются ЛБН (n=177 – 48%) и МБ (n=69 – 19%), которые в совокупности составляют более половины всех случаев (рис. 1).

Болезни, связанные с нарушением обмена аминокислот, органических кислот и дефектами митохондриального -окисления составляют 2%, 7%, 4%, соответственно (в расчет не включены случаи фенилкетонурии).

По данным зарубежных лабораторий относительные доли заболеваний этих классов более существенны, чем в нашей выборке, что указывает на необходимость совершенствования методов их диагностики.

Рис 1. Относительные частоты отдельных подклассов НБО в исследуемой выборке.

Примечание: МБ-митохондриальные болезни, ОА- органические ацидурии, АА-аминоацидопатии, УГ-нарушения обмена углеводов, ЛБН-лизосомные болезни накопления, ПБ-пероксисомные болезни,в-окисление- дефекты митохондриального -окисления жирных кислот

Анализ нозологической структуры наиболее представленных подклассов НБО

Для оценки нозологической структуры группы ЛБН, проведен анализ 902 случаев ЛБН, которые были диагностированы в лаборатории с 1992 гг- 2009гг. За этот период было установлено 25 различных форм ЛБН. Проведенный анализ показывает, что самыми частыми являются мукополисахаридозы и липидозы (сфинголипидозы и ганглиозидозы), которые составляют существенную долю всех диагностированных случаев ЛБН. В группе сфинголипидозов самой частой формой заболевания является болезнь Гоше (рис. 2). Сходная тенденция наблюдается и в других странах Европы – Чехии, Австралии и Германии.

Для оценки нозологической структуры группы МБ, проведен анализ 176 случаев МБ, которые диагностированы в лаборатории с 2004 -2009гг. Выбранный временной интервал соответствует началу диагностики данных заболеваний в лаборатории НБО ФГБУ «МГНЦ» РАМН. В группе МБ наиболее часто встречаются заболевания, связанные с мутациями мтДНК, среди них превалируют мутации, приводящие к синдрому Лебера (n=62).

Рис. 2. Относительная частота нозологических форм в выборке больных с ЛБН

Примечание: Б.Гоше- болезнь Гоше, МЛД- метахроматическая лейкодистрофия, МПС- мукополисахаридоз, НЦЛ2- нейрональный цероидный липофусциноз тип 2, МЛII/III- муколипидоз II/III типа, Б.Краббе- болезнь Краббе

В нашем исследовании было зарегистрировано большое число случаев (n=34), связанных с мутациями гена SURF1, что приводит к недостаточности цитохром с оксидазы (IV комплекса дыхательной цепи митохондрий). Мутации этого гена являются причиной одной из частых форм МБ, дебютирующих в детском возрасте - синдрома Ли.

Частота заболеваний из группы лизосомных болезней накопления в России (Центральный федеральный округ)

ЛБН - одна из наиболее многообразных и хорошо изученных групп НБО, которая включает более 45 различных нозологических форм. Подтверждающей лабораторной диагностикой ЛБН лаборатории НБО ФГБУ «МГНЦ» РАМН занимается с 1982 года и является единственной в РФ лабораторией, осуществляющей точную диагностику большинства ЛБН. В лабораторию поступают образцы из всех регионов РФ, но в настоящем исследовании учтены только больные, проживающие в Центральном Федеральном округе (ЦФО), которым был установлен диагноз в лаборатории в период с 2000 по 2009гг (табл. 1). Это связанно с географической близостью к г. Москве и достаточно высоким уровнем медико-генетической помощи в данном регионе.

Суммарная частота заболеваний группы ЛБН определена в разных странах Европы и составляет от 7,6 до 25 на 100 000 новорожденных (Meikle P.J. et al., 1999; Poorthuis B.J. et al., 1999; Applegarth D.A. et al., 2000; Dionisi-Vici С. et al., 2002; Pinto R. et al., 2004). В РФ подобные исследования не проводились.

Проведенный анализ показывает, что суммарная частота ЛБН в РФ (ЦФО) составляет 5,22: 100 000 новорожденных (1:19937), в других странах Европы значение примерно в 2-3 раза выше, однако следует учитывать, что все эти заболевания чрезвычайно редкие и случайная вариация в оценке их частоты очень высока, что отражает минимальное и максимальное пороговое значение при 95% доверительном интервале а также различные подходы к расчету.

Наибольшая частота показана для следующих нозологических форм: болезнь Гоше -0,93 (95% ДИ 0,790-1,070), МПС I типа - 0,82 (95% ДИ 0,552-1,089), МПС II типа -0,74 (95% ДИ 0,478-1,075), GM1-ганглиозидоз -0,58 (95% ДИ 0,117-1,052). Следует отметить, что в отличие от других стран в РФ диагностированы лишь единичные случаи болезни Ниманна-Пика тип С (n=3), болезни Помпе (n=5), что в совокупности также влияет на общую частоту ЛБН. В группе МПС наблюдается меньшее число случаев МПС III типа, по сравнению с другими странами.

Таблица 1. Частота некоторых форм ЛБН на 100 000 новорожденных.

Заболевание			Германия	Австралия	Нидерланды
МПС (общее)
Болезнь Гоше
GM1-ганглиозидоз
Болезнь Краббе
Сфинголипидозы
ЛБН (общее)

Описание

Подготовка

Показания

Интерпретация результатов

Документы к заполнению

Описание

Метод определения

Тандемная масс-спектрометрия с ионизацией в электроспрее.

Исследуемый материал Капиллярная кровь, собранная на специальную карточку-фильтр №903

Анализ спектра аминокислот и ацилкарнитинов методом тандемной масс-спектрометрии (ТМС)

Что такое нарушения метаболизма? Наследственные нарушения метаболизма или по-другому обмена веществ - это около 500 различных заболеваний, которые обусловлены нарушением работы особых биохимических катализаторов - ферментов. Ферменты обеспечивают процессы расщепления аминокислот, органических кислот, жирных кислот и других биомолекул. Многие ошибочно считают, что поскольку заболевания этой группы встречаются крайне редко, то и исключать их нужно в последнюю очередь. Однако по данным литературы*, наследственными нарушениями метаболизма страдает один из 3000 новорождённых!

Особое место среди этих заболеваний занимают болезни, которые начинаются в раннем детском возрасте. Эти заболевания часто сочетаются с тяжёлой неонатальной патологией и/или протекают под маской таких состояний как сепсис, перинатальное поражение нервной системы, внутриутробная инфекция. Позднее выявление заболеваний этой группы может привести к тяжёлой инвалидности или даже летальному исходу. Установлено, что 5%** всех случаев «синдрома внезапной смерти младенцев» - следствие наследственных нарушений метаболизма. Однако некоторые из этих заболеваний эффективно лечатся при своевременной диагностике. Одним из современных методов диагностики нарушений метаболизма является тандемная масс-спектрометрия (ТМС). Этот метод позволяет определить в небольшом количестве биологического материала (капля высушенной крови) , что позволяет с определённой вероятностью заподозрить наследственное заболевание. В некоторых странах этим методом проводится обследование всех новорождённых на 10-30 наследственных нарушений метаболизма. Другими словами, все новорождённые подвергаются специальному биохимическому исследованию называемому скрининг. * Vilarinho L, Rocha H, Sousa C, Marcão A, Fonseca H, Bogas M, Osório RV. Four years of expanded newborn screening in Portugal with tandem mass spectrometry. J Inherit Metab Dis. 2010 Feb 23 ** Olpin SE The metabolic investigation of sudden infant death. Ann Clin Biochem, 2004, Jul 41 (Pt4), 282-293 **Opdal SH, Rognum TO The sudden Infant Death Syndrome Gene: Does It Exist? Pediatrics, 2004, V.114, N.4, pp. e506-e512 Что такое скрининг? Скрининг (от англ. Screening – просеивание) — это массовое обследование пациентов для выявления различных заболеваний, ранняя диагностика которых позволяет предотвратить развитие тяжёлых осложнений и инвалидности. На какие заболевания проводится обязательное скрининговое обследование новорождённых в нашей стране? В России существует государственная программа, которая включает в себя обязательное обследование (скрининг) всех новорождённых только на 5 наследственных заболеваний: фенилкетонурии (ФКУ), муковисцидоза, галактоземии, адреногенитального синдрома и врождённого гипотиреоза.

Обращаем Ваше внимание на то, что из этого перечня в состав исследования «ПЯТОЧКА» входит только скрининг на фенилкетонурию (полный перечень выявляемых наследственных болезней обмена веществ при помощи скринига «ПЯТОЧКА» см. ниже по тексту).

На какие заболевания можно обследовать ребёнка дополнительно? Скрининга новорождённых, направленного на диагностику нарушений метаболизма методом ТМС, в России на настоящий момент не проводится. В России это исследование пока проводится по назначению врача при наличии подозрений на наследственные болезни обмена веществ, хотя многие из заболеваний этой группы проявляют себя не сразу после рождения, но при этом уже есть у новорождённого. Однако, уже упомянутым ранее методом тандемной масс-спектрометрии (ТМС) можно дополнительно обследовать новорождённого ребенка на исключение 37 различных наследственных заболеваний, которые относятся к нарушениям обмена аминокислот, органических кислот и дефектам ß -окисления жирных кислот. Аминоацидопатии Аминоацидопатии развиваются вследствие недостатка специфических ферментов, необходимых для метаболизма аминокислот. Это приводит к аномально высокому уровню аминокислот и их производных в крови и моче, которые оказывают токсическое действие на клетки и ткани организма. Основные симптомы: задержка развития, судороги, коматозные состояния, рвота, диарея, необычный запах мочи, нарушения зрения и слуха. Лечение заключается в назначении специальной диеты и витаминов. Эффективность терапии зависит от того, насколько рано и точно установлен диагноз. К сожалению, некоторые заболевания из этой группы не поддаются лечению. Органические ацидурии/ацидемии Органические ацидурии/ацидемии являются результатом нарушения химического расщепления аминокислот вследствие недостаточной активности ферментов. Их клинические проявления схожи с проявлениями аминоацидопатий. Лечение заключается в назначении специальной диеты и/или витаминов. К сожалению, некоторые заболевания из этой группы не поддаются лечению. Дефекты ß-окисления жирных кислот ß-окисление жирных кислот – многоступенчатый процесс их расщепления, в результате которого образуется энергия, необходимая для жизнедеятельности клетки. Каждый шаг процесса окисления производится под действием специфических ферментов. При отсутствии одного из ферментов процесс нарушается. Симптомы: сонливость, кома, рвота, низкий уровень сахара в крови, поражение печени, сердца, мышц. Лечение заключается в назначении низкожировой диеты с частым и дробным кормлением, других специализированных диетических продуктов, а также, левокарнитина. Полный перечень выявляемых наследственных болезней обмена веществ

1. Болезнь с запахом кленового сиропа мочи (лейциноз).
2. Цитрулинемия тип 1, неонатальная цитрулинемия.
3. Аргининосукциновая ацидурия (АСА)/ недостаточность аргининосукцинат лиазы лиазы.
4. Недостаточность орнитин транскарбамилазы.
5. Недостаточность карбамилфосфат синтазы.
6. Недостаточность N-ацетилглютамат синтазы.
7. Некетотическая гиперглицинемия.
8. Тирозинемия тип 1.
9. Тирозинемия тип 2.
10. Гомоцистинурия/недостаточность цистатионин бета-синтетазы.
11. Фенилкетонурия.
12. Аргининемия/недостаточность аргиназы.
13. Пропионовая ацидемия (недостаточность пропионил КоА карбоксилазы).
14. Метилмалоновая ацидемия.
15. Изовалериановая ацидемия (недостаточность изовалерил КоА дегидрогеназы).
16. Недостаточность 2-метилбутирил КоА дегидрогеназы.
17. Недостаточность изобутирил КоА дегидрогеназы.
18. Глутаровая ацидемия тип 1 (недостаточность глутарил КоА дегидрогеназы тип 1).
19. Недостаточность 3-метилкротонил КоА карбоксилазы.
20. Множественная карбоксилазная недостаточность.
21. Недостаточность биотинидазы.
22. Малоновая ацидемия (недостаточность малонил КоА декарбоксилазы).
23. Недостаточность митохондриальной ацетоацетил КоА тиолазы.
24. Недостаточность 2-метил-3-гидроксибутирил КоА дегидрогеназы.
25. Недостаточность 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА лиазы.
26. Недостаточность 3-метилглутаконил КоА гидратазы.
27. Недостаточность среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы.
28. Недостаточность очень длинноцепочечной ацил-КоА дегидрогеназы.
29. Недостаточность короткоцепочечной ацил-КоА дегидрогеназы.
30. Недостаточность длинноцепочечной 3-гидроксиацил-КоА дегидрогеназы (дефект трифункционального белка).
31. Глутаровая ацидемия тип II (недостаточность глутарил КоА дегидрогеназы тип II), множественная недостаточность ацил-КоА дегидрогеназ.
32. Нарушение транспорта карнитина.
33. Недостаточность карнитин палмитоил трансферазы тип I.
34. Недостаточность карнитин палмитоил трансферазы тип II.
35. Недостаточность карнитин/ацилкарнитин транслоказы.
36. Недостаточность 2,4-диеноил КоА редуктазы.
37. Недостаточность среднецепочечной 3-кетоацил-КоА тиолазы.
38. Недостаточность средне-/короткоцепочечной ацил-КоА дегидрогеназы.

Материал для исследования: капиллярная кровь, собранная на специальную карточку-фильтр №903.

Литература

1. Chace D.H., Kalas T.A., Naylor E.W. The application of tandem mass spectrometry to neonatal screening for inherited disorders of intermediary metabolism. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2002; vol. 3; p. 17-45.
2. Leonard J.V., Dezateux C. Screening for inherited metabolic disease in newborn infants using tandem mass spectrometry. BMJ. 2002; vol. 324(7328); p. 4-5.
3. Millington D., Kodo N., Terada N., Roe D., Chace D. The analysis of diagnostic markers of genetic disorders in human blood and urine using tandem mass spectrometry with liquid secondary ion mass spectrometry.1991 Int.J.Mass Spectr.Ion Process. 111:211-28.
4. Chace D.H. Mass spectrometry in the clinical laboratory. Chem Rev. 2001 Feb;101(2):445-77.
5. Duran M., Ketting D., Dorland L., Wadman S.K. The identification of acylcarnitines by desorption chemical ionization mass spectrometry. J Inherit Metab Dis. 1985;8 Suppl 2:143-4.
6. Millington D.S., Kodo N., Norwood D.L., Roe C.R. Tandem mass spectrometry: a new method for acylcarnitine profiling with potential for neonatal screening for inborn errors of metabolism. J Inherit Metab Dis. 1990;13(3):321-4.
7. Chace D.H., DiPerna J.C., Mitchell B.L., Sgroi B., Hofman L.F., Naylor E.W.. Electrospray tandem mass spectrometry for analysis of acylcarnitines in dried postmortem blood specimens collected at autopsy from infants with unexplained cause of death. Clin Chem. 2001;47(7):1166-82.
8. Rashed M.S., Bucknall M.P., Little D., Awad A., Jacob M., Alamoudi M., Alwattar M., Ozand P.T. Screening blood spots for inborn errors of metabolism by electrospray tandem mass spectrometry with a microplate batch process and a computer algorithm for automated flagging of abnormal profiles. Clin Chem. 1997 Jul; 43(7):1129-41.
9. Millington D.S., Terada N., Chace D.H., Chen Y.T., Ding J.H., Kodo N., Roe C.R. The role of tandem mass spectrometry in the diagnosis of fatty acid oxidation disorders. Prog Clin Biol Res. 1992; 375:339-54.
10. Rashed M.S., Ozan P.T., Harrison M.E., Watkins P.J.F., Evans S. 1994. Electrospray tandem mass spectrometry in the analysis of organic acidemias. Rapid Commun. Mass Spectrom. 8:122-33
11. Vreken P., van Lint A.E., Bootsma A.H., Overmars H., Wanders R.J., van Gennip A.H. Rapid diagnosis of organic acidemias and fatty-acid oxidation defects by quantitative electrospray tandem-MS acyl-carnitine analysis in plasma. Adv Exp Med Biol. 1999; 466:327-37.
12. Griffiths W.J., Jonsson A..P, Liu S., Rai D.K., Wang Y. Electrospray and tandem mass spectrometry in biochemistry. Biochem J. 2001 May 1; 355(Pt 3):545-61.
13. Dooley K.C. Tandem mass spectrometry in the clinical chemistry laboratory. Clin Biochem. 2003 Sep; 36(6):471-81.
14. Михайлова С.В., Ильина Е.С., Захарова Е.Ю., Байдакова Г.В., Бембеева Р.Ц., Шехтер О.В., Захаров С.Ф. «Множественная карбоксилазная недостаточность, обусловленная мутациями в гене биотинидазы// Медицинская генетика. - 2005. - №2. - C. 633-638.
15. Байдакова Г.В., Букина А.М., Гончаров В.М., Шехтер О.В., Букина Т.М., Покровская А.Я., Захарова Е.Ю., Михайлова С.В., Федонюк И.Д., Колпакчи Л.М., Семыкина Л.И., Ильина Е.С. Диагностика наследственных болезней обмена веществ на основе сочетания методов тандемной масс-спектрометрии и энзимодиагностики, Медицинская генетика, 2005, т. 4, №1, с. 28-33.
16. Захарова Е.Ю., Ильина Е.С., Букина А.М., Букина Т.М., Захаров С.Ф., Михайлова С.Ф., Федонюк И.Д., Байдакова Г.В., Семыкина Л.И., Колпакчи Л.М., Зайцева М.Н. «Результаты проведения селективного скрининга на наследственные болезни обмена веществ среди пациентов психоневрологических отделений». Второй Всероссийский Конгресс, «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», Материалы Конгресса, стр. 141-142.
17. Baidakova G.V., Boukina A.M., Boukina T.M., Shechter O.V., Michaylova S.V. I’lina E.S, Zakharova E.Yu Combination of tandem mass spectrometry and lysosomal enzymes analysis - effective tool for selective screening for IEM in neurological clinic. SSIEM 41st Annual Symposium, Amsterdam, August 31- September 3, 2004.
18. Mikhaylova S.V., Baydakova G.V., Zakharova E.Y., Il’ina E.S. First cases of biotinidase deficiency in Russia. European Journal of Human Genetics Vol.13-Supplement1-May, 2005, p. 386.
19. Байдакова Г.В., Захарова Е.Ю., Зинченко Р.А. Недостаточность среднецепочечной ацил-КоА-дегидрогеназы жирных кислот. Материалы V съезда Российского общества медицинских генетиков, Уфа, май 2005, Медицинская Генетика, т. 4, № 4, с. 153.
20. Захарова Е.Ю., Байдакова Г.В., Шехтер О.В., Ильина Е.С., Михайлова С.В. Тандемная масс-спектрометрия – новый подход диагностики наследственных нарушений обмена веществ, Материалы V съезда Российского общества медицинских генетиков, Уфа, май 2005, Медицинская Генетика, т. 4, №4, с.188.
21. Mikhaylova S.V., Zakharova E.Y, Baidakova G.V., Shehter O.V., Ilina E.S Clinical outcome of glutaric aciduria type I in Russia. J.Inherit. Metab.Dis 2007, v. 30, p. 38 22. Baydakova GV, Tsygankova PG. Diagnosis of mitochondrial β-oxidation defects in Russia. J Inherit Metab Dis (2008) 31 (Suppl 1) p.39

Подготовка

Что делать, если необходимо обследовать ребёнка на наследственные нарушения метаболизма?

• По назначению врача или самостоятельно в любом медицинском офисе ИНВИТРО необходимо заранее приобрести набор для проведения исследования, в который входит:

Подготовка к исследованию и правила взятия крови у новорождённых

1. Взятие образцов крови у новорождённых детей осуществляется в родовспомогательных учреждениях специально подготовленным сотрудником, а в случае ранней выписки новорождённого (до 4 дня жизни) - специально подготовленной патронажной сестрой.
2. При обследовании новорождённых взятие пробы крови следует проводить не ранее 4-х суток у доношенных и 7-х суток у недоношенных детей. У новорождённых кровь берут из пяточки, у детей старше 3 мес - из пальца.
3. У новорождённых от начала полного грудного или искусственного вскармливания до взятия крови должно пройти не менее 4-х суток. Взятие крови проводят через 3 часа после кормления (у новорождённых - перед очередным кормлением).
4. Перед взятием крови у новорождённого стопу ребёнка необходимо тщательно вымыть мылом, протереть стерильным тампоном, смоченным 70% спиртом, а затем обработанное место промокнуть стерильной сухой салфеткой!
5. Прокол делают одноразовым стерильным скарификатором на глубину 2,0 мм (зоны прокола изображены на ). Первую каплю крови удаляют стерильным сухим тампоном.
6. Мягким надавливанием на пятку способствуют накоплению второй капли крови, к которой перпендикулярно прикладывают специальную карточку из фильтровальной бумаги и пропитывают полностью и насквозь 5 зон, очерченных круговой линией. Пятна крови должны быть не меньше указанного на бланке размера, вид пятен должен быть одинаков с обеих сторон , . Никогда не используйте противоположную сторону фильтровальной бумаги для заполнения окружностей.
7. После взятия крови осушите зону прокола стерильным тампоном и наклейте бактерицидный пластырь на участок прокола. Внимание! От качества взятия крови зависит точность и достоверность исследования!
8. Специальную карточку из фильтровальной бумаги высушивают не менее 2 - 4 часов при комнатной температуре. Избегайте попадания прямых солнечных лучей! Для этого отведите внешний клапан карточки и подведите его край под противоположную поверхность фильтра (где не обозначены окружности), . После полного высыхания капель крови переместите клапан карточки над поверхностью фильтра. Подпишите Фамилию И. О. ребёнка внизу карточки (Name) и укажите дату взятия крови (Date), . Карточку поместите в маленький конверт и вложите его в предварительно подписанный большой конверт. Заполните направительный бланк заказа и также вложите его в большой конверт.
9. Передайте большой конверт в ближайший медицинский офис ИНВИТРО (конверт не запечатывается). Сотрудник ИНВИТРО в вашем присутствии проверит содержимое конверта и правильность заполнения бланка заказа.

Хранение и транспортировка: до и после взятия крови набор хранить при комнатной температуре в сухом месте; избегать контакта с системами отопления; избегать попадания прямых солнечных лучей; при транспортировке упаковать набор (наборы) в полиэтиленовый герметично закрывающийся пакет.

Показания к назначению

• Сходные случаи заболевания в семье.
• Случаи внезапной смерти ребёнка в раннем возрасте в семье.
• Резкое ухудшение состояния ребёнка после кратковременного периода нормального развития (бессимптомный промежуток может составлять от нескольких часов до нескольких недель).
• Необычный запах тела и/или мочи («сладкий», «мышиный», «варёной капусты», «потных ног» и др.).
• Неврологические нарушения - нарушения сознания (летаргия, кома), различные типы судорожных приступов, изменение мышечного тонуса (мышечная гипотония или спастический тетрапарез).
• Нарушения ритма дыхания (брадипноэ, тахипноэ, апноэ).
• Нарушения со стороны других органов и систем (поражение печени, гепатоспленомегалия, кардиомиопатия, ретинопатия).
• Изменения лабораторных показателей крови и мочи - нейтропения, анемия, метаболический ацидоз/алкалоз, гипогликемия/гипергликемия, повышение активности печёночных ферментов и уровня креатинфосфокиназы, кетонурия.
• Дополнительная диагностика 37 наследственных болезней обмена веществ наряду с обязательной государственной программой выявления 5-ти наследственных заболеваний: скрининг новорождённых: «ПЯТОЧКА».

Интерпретация результатов

Интерпретация результатов исследований содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т.д.

Единицы измерения в лаборатории ИНВИТРО: мкмоль/литр. Референсные значения для определяемых параметров (детализированная интерпретация результатов)

Общая интерпретация результата

Наследственные заболевания обмена веществ	Изменение концентрации метаболитов
Болезнь «с запахом кленового сиропа мочи» (лейциноз)	Лейцин Валин
Цитрулинемия тип 1, неонатальная цитрулинемия	Цитрулин
Аргининосукциновая ацидурия (АСА)/ недостаточность аргининосукцинат лиазы лиазы	Цитрулин
Недостаточность орнитин транскарбамилазы	Цитрулин
Недостаточность карбамилфосфат синтазы	Цитрулин
Недостаточность N-ацетилглютамат синтазы	Цитрулин
Некетотическая гиперглицинемия	Глицин
Тирозинемия тип 1	Тирозин
Тирозинемия тип 2	Тирозин
Гомоцистинурия/недостаточность цистатионин бета-синтетазы	Метионин
Фенилкетонурия	Фенилаланин
Аргининемия/недостаточность аргиназы	Аргинин
Пропионовая ацидемия (недостаточность пропионил КоА карбоксилазы)	С3
Метилмалоновая ацидемия	С3 (С4DC )
Изовалериановая ацидемия (недостаточность изовалерил КоА дегидрогеназы)	С5
Недостаточность 2-метилбутирил КоА дегидрогеназы	С5
Недостаточность изобутирил КоА дегидрогеназы	С4
Глутаровая ацидемия тип 1 (недостаточность глутарил КоА дегидрогеназы тип 1)	С5DC
Недостаточность 3-метилкротонил КоА карбоксилазы	С5ОН
Множественная карбоксилазная недостаточность	С5ОН С3
Недостаточность биотинидазы	С5ОН
Малоновая ацидемия (недостаточность малонил КоА декарбоксилазы)	С3DC
Недостаточность митохондриальной ацетоацетил КоА тиолазы	С5:1 С5ОН
Недостаточность 2-метил-3-гидроксибутирил КоА дегидрогеназы	С5:1 С5ОН
Недостаточность 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА лиазы	С5ОН С6DC
Недостаточность 3-метилглутаконил КоА гидратазы	С6DC
Недостаточность среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы	С6 С8 С10 С10:1
Недостаточность очень длинноцепочечной ацил-КоА дегидрогеназы	С14 С14:1 С14:2 С16:1
Недостаточность короткоцепочечной ацил-КоА дегидрогеназы	С4
Недостаточность длинноцепочечной 3-гидроксиацил-КоА дегидрогеназы (дефект трифункционального белка)	С16OH С18ОН С18:1OH С18:2OH
Глутаровая ацидемия тип II (недостаточность глутарил КоА дегидрогеназы тип II), множественная недостаточность ацил-КоА дегидрогеназ	С4 С5 С6 С8 С10 С12 С14 С16 С18
Нарушение транспорта карнитина	C0 ↓ тотальное снижение ацилкарнитинов
Недостаточность карнитин палмитоил трансферазы тип I	С0 С16 ↓ С18:1 ↓ С18:2 ↓
Недостаточность карнитин палмитоил трансферазы тип II	C0 ↓ С16 С18:1 С18:2
Недостаточность карнитин/ацилкарнитин транслоказы	C0 ↓ С16 С18:1 С18:2
Недостаточность 2,4-диеноил КоА редуктазы	С10:2
Недостаточность среднецепочечной 3-кетоацил-КоА тиолазы	С6DC С8DC
недостаточность средне-/короткоцепочечной ацил-КоА дегидрогеназы	С4ОН С6ОН

Что делать, если в результате исследования выявлено изменение показателей? Необходимо понимать, что изменения, выявленные при ТМС, полностью не подтверждают заболевание, а в ряде случаев, необходимо пройти дополнительные тесты, (см. список дополнительных тестов и ) чтобы убедиться в достоверности выявленных нарушений. Рекомендуется консультация врача-генетика и педиатра, чтобы выработать тактику совместных действий. Используемая литература (референсные значения)

1. Wiley V., Carpenter K., Wilcken B. Newborn screening with tandem mass spectrometry: 12 months’ experience in NSW Australia. Acta Paediatrica 1999; 88 (Suppl):48-51.
2. Rashed MS, Rahbeeni Z, Ozand PT. Application of electrospray tandem mass spectrometry to neonatal screening. Semin Perinatol 1999; 23:183–93.
3. Schulze A., Lindner M., Kohlmüller D., Olgemöller K., Mayatepek E., Hoffmann G.F. Expanded Newborn Screening for Inborn Errors of Metabolism by Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry: Results, Outcome, and Implications, Pediatrics, 2003; 111; 1399-1406.
4. Hoffman G., Litsheim T., Laessig R. Implementation of tandem mass spectrometry in Wisconsin’s newborn screening program. MMWR Morb MortalWkly Rep 2001; 50 (RR-3): 26–7.
5. Lin W.D., Wu J.Y., Lai C.C., Tsai F.J., Tsai C.H., Lin S.P., Niu D.M. A pilot study of neonatal screening by electrospray ionization tandem mass spectrometry in Taiwan. Acta Paediatr Taiwan 2001; 42:224–30.
6. Zytkovicz T.H., Fitzgerald E.F., Marsden D., Larson C.A., Shih V.E., Johnson D.M., et al. Tandem mass spectrometric analysis for amino, organic, and fatty acid disorders in newborn dried blood spots: a two year summary from the New England Newborn Screening Program. Clin Chem 2001;47:1945–55.