Генетические рекомбинации у эукариот - это образование индивидуумов с новым сочетанием признаков в результате полового процесса. Новая особь получает несколько генов от одного родителя и несколько от другого, генетически отличающегося родителя. Благодаря процессу рекомбинации увеличивается число наследственных изменений, на которые может воздействовать отбор.
У прокариот генетическая рекомбинация относится к так называемым парасексуальным процессам. У этих организмов известны три процесса, посредством которых генетический материал от двух различных родителей может рекомбинироваться. Это трансформация, конъюгация и трансдукция. Однако ни в одном из этих процессов не происходит истинного слияния клеток или полного слияния нуклеоидов. Лишь часть генетического материала клетки-донора передается клетке-реципиенту. Реципиент, таким образом, становится диплоидным, потому что часть его генетического материала дополняется генетическим материалом донора.
В такой неполной зиготе, называемой мерозиготой, сформированной в результате переноса генов, генетический материал реципиентной клетки называется эндогенным, а генетический фрагмент, переданный из донора,- экзогенным. Обычно экзогенная и эндогенная части соединяются и обмениваются сегментами немедленно после переноса.
Трансформация - это процесс переноса генов, при котором часть ДНК клетки-донора, полученная либо эстрагированием, либо при естественном лизисе клеток, может проникать в родственную (одного и того же вида или близкородственных видов) бактериальную клетку-реципиент. В результате происходит включение в ДНК реципиента фрагментов хромосомы ДНК донора, что обусловливает изменение признаков бактерии-реципиента.
Процесс трансформации можно подразделить на несколько стадий: 1 - контакт ДНК с поверхностью клетки; 2 - проникновение ДНК в клетку; 3 - соединение трансформирующей ДНК с соответствующим фрагментом хромосомы реципиента. Дальнейший процесс связан с рекомбинацией части экзогенной молекулы трансформирующей ДНК с реципиентной эндогенной хромосомной ДНК. Последняя стадия - репликация включенной в хромосому новой информации.
В лабораторных условиях трансформация осуществляется следующим образом. ДНК определенного штамма бактерий извлекают, очищают и смешивают с клетками бактерий другого штамма, отличающегося от первого одним или несколькими наследственными свойствами. Культуру подопытного микроорганизма оставляют расти. Среди потомства можно обнаружить небольшое количество клеток с некоторыми свойствами штамма, из которого была извлечена ДНК.
Очень редко бывает, что единичная бактериальная клетка приобретает в результате трансформации более чем одно новое свойство. Передача через ДНК большего числа признаков наблюдается лишь в том случае, если культура микроба-донора генетически близка к клеткам микроба-реципиента.
С помощью трансформирующей ДНК могут передаваться такие признаки, как капсулообразование, синтез необходимых клетке веществ, ферментативная активность, устойчивость к ядам, антибиотикам и другим лекарственным веществам.
Трансформацию наблюдали у многих бактерий, в частности у представителей родов Bacillus, Rhizobium, Streptococcus и др.
Конъюгация - процесс, при котором сблизившиеся родительские клетки соединяются обычно с помощью конъюгационных мостиков, через последние происходит обмен генетическим материалам. Конъюгацию исследовали у различных бактерий (Escherichia, Shigella, Salmonella, Pseudomonas), в частности она хорошо изучена у Escherichia coli.
Возможность клетки стать донором определяется специфическим половым фактором F (от англ. fertility - плодовитость), который при конъюгации переносится из одной бактериальной клетки в другую. Эти клетки были названы F+-клетками. Клетки бактерий, не имеющие F-фактора, являются реципиентами генетического материала и обозначаются F - Половой фактор F относится к числу конъюгативных плазмид и представляет собой циркулярно замкнутую молекулу ДНК с молекулярной массой 64х106 а. е.м. F-плазмида обусловливает образование на поверхности клетки одной или двух так называемых половых фимбрий, или F-pili, способствующих соединению клеток-доноров с клетками - реципиентами, а также независимую от хромосомы репликацию собственной ДНК и образование продуктов, которые обеспечивают перенос генетического материала как самой F-плазмиды, так и хромосомы клетки. F-плазмида располагается в цитоплазме автономно, вне бактериальной хромосомы. Однако она обладает способностью включаться (иитегрировать) в определенные места бактериальной хромосомы и становиться ее частью.
В результате интеграции F-плазмиды в состав бактериальной хромосомы образуется так называемый Hfr-штамм (High frequency of recombination - высокая частота рекомбинации). Когда происходит скрещивание Hfr-штамма с F - - бактериями, то, как правило, F - фактор не
Передается, а гены хромосомы бактерий передаются с довольно высокой частотой. В начале процесса конъюгации клетки-доноры F+ или Hfr соединяются с клетками-реципиентами (благодаря наличию у доноров F-pili). Впоследствии между клетками образуется конъюгационный мостик и через него, из клетки-донора в клетку-реципиент, передается генетический материал или F-плазмиды, или хромосомы. Обычно при конъюгации передается только одна цепь ДНК-донора, а вторая цепь (комплементарная) достраивается в клетке реципиента. Перенос, как правило, начинается с одного конца хромосомы и продолжается с последующим переносом других участков ее (рис. 21).
Переносу генетического материала можно препятствовать в любое время, разделяя конъюгирующие пары с помощью сильного встряхивания суспензии микроорганизмов, находящихся в жидкой среде. В этом случае только некоторые свойства мужских клеток переносятся в женскую клетку и могут проявиться в потомстве. Рано или поздно перенос прекращается в большинстве конъюгирующих пар и тогда, когда их искусственно не разделяют. Это происходит потому, что конъюгационный мостик непрочен и легко разрушается, не влияя на жизнеспособность клеток.
Таким образом, в результате конъюгации реципиентная клетка F - превращается в мерозиготу, содержащую из-за самопроизвольного прерывания переноса генетического материала только часть хромосомы-донора F+ в дополнение к собственной хромосоме. В результате процесса кроссинговера (перекрест хромосом, при котором гены меняются местами), наблюдающегося и у других организмов, образуется новая комбинация генетического материала. В зависимости от места расположения подвергающегося обмену генетического материала в потомстве могут возникнуть рекомбинанты разного типа.
Трансдукция - процесс переноса генетического материала от одной бактериальной клетки к другой посредством бактериофага. Другими словами, фаг при этом играет как бы роль гаметы, перенося в клетку - реципиент фрагмент ДНК клетки-донора. Трансдукция происходит при участии умеренных фагов.
Известны три главных типа трансдукции: общая (неспецифическая), локализованная (специфическая) и абортивная. При неспецифической трансдукции происходит передача различных фрагментов ДНК от бактерий-доноров к бактериям - реципиентам с помощью умеренных трансдуцирующих фагов. При этом принесенный фагом фрагмент ДНК донора способен включаться в гомологическую область ДНК клетки - реципиента путем рекомбинации.
Специфическая трансдукция характеризуется способностью фага переносить от бактерий - доноров к бактериям - реципиентам только определенные гены. Это обусловлено тем, что образование трансдуцирующего фага происходит в результате соединения его ДНК со строго определенными бактериальными генами, расположенными на хромосоме клетки-донора. Считают, что каждая частица фага переносит или только один бактериальный ген, или несколько близколежащих генов.
При Абортивной трансдукции принесенный фагом фрагмент хромосомы клетки - донора не включается в хромосому клетки-реципиента, а располагается в ее цитоплазме автономно и в таком виде может функционировать. В процессе деления клетки - реципиента трансдуцированный фрагмент ДНК - донора может передаваться только одной из двух дочерних клеток, то есть наследуется однолинейно, в связи, с чем утрачивается в потомстве.
При трансдукции возможен перенос генов, контролирующих питательные особенности бактерий, их устойчивость к лекарственным веществам, ферментативную активность, двигательный аппарат (жгутики) и другие свойства.
Перенос признаков с помощью процесса трансдукции обнаружен у представителей родов Bacillus, Pseudomonas, Salmonella, Escherichia и др.
Прокариотам несвойственно половое размножение . Рекомбинация у них происходит в результате внутригеномных перестроек, заключающихся в изменении локализации генов в пределах хромосомы, или при проникновении в клетку реципиента части ДНК донора.
В результате рекомбинаций образуется только один рекомбинант, генотип которого представлен в основном генотипом реципиента с включенным в него фрагментом ДНК донора.
Генетические рекомбинации происходят при участии ряда ферментов в пределах отдельных генов или групп сцепленных генов. Существуют специальные гес-гены, детерминирующие рекомбинационную способность бактерий. Передача генетического материала (хромосомных генов) от одних бактерий к другим происходит путем трансформации, трансдукции и конъюгации. Передача плазмидных генов - путем трансдукции и конъюгации.
Трансформация - изменение одного типа клеток при действии активного начала из другого типа клеток. Феномен открыл Гриффит у Streptococcus pneumoniae (1928); позднее Эвери, Маклеод и Мак Карти (1944) выделили трансформирующее начало пневмококков в форме молекулы ДНК. Это и явилось первым прямым доказательством того, что носителем генетической информации является ДНК.
Погибшие бактерии постоянно высвобождают ДНК, которая может быть воспринята другими бактериями. Традиционно, любая чужеродная ДНК, попадающая в бактериальную клетку, расщепляется эндонуклеазами. При некоторых условиях такая ДНК интегрируется в геном бактерий и изменяет его. Встраивание плазмидной ДНК может менять вирулентность бактерий. В обмене генетической информацией трансформация играет незначительную роль.
Трансдукция - перенос фрагмента ДНК от одной клетки (донора) к другой (реципиенту) с помощью бактериофага. Явление открыл Ледерберг и Циндер (1952). Выделяют 3 типа трансдукции:
неспецифическая (общая) - в клетке, инфицированной бактериофагом, в ходе сборки дочерней популяции в головки некоторых фагов вместе с вирусной ДНК может проникнуть любой фрагмент бактериальной ДНК или плазмиды. В этом случае, фаг утрачивает часть своего генома, становиться дефектным и способен вызвать трансдукцию. При такой форме трансдукции в клетки-реципиенты могут быть внесены практически любые гены.
специфическая характеризуется способностью фага переносить определенные гены от бактерии-донора к бактерии-реципиенту. Это связано с тем, что образование трансдуцирующего бактериофага происходит путем выщепления профага из бактериальной хромосомы вместе с генами, расположенными на хромосоме в клетке-донора рядом с профагом. При взаимодействии трансдуцирующих фагов клетками реципиентного штамма происходит включение гена бактерии-донора вместе с ДНК дефектного фага в хромосому бактерии-реципиента. Бактерии, лизогенированные дефектным фагом, невосприимчивы, как и все лизогенные клетки, к последующему заражению гомологичным вирулентным фагом.
абортивная. Принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора не включается в хромосому бактерии-реципиента, а располагается в ее цитоплазме и может в таком виде функционировать. Во время деления бактериальной клетки трансдуцированный фрагмент ДНК-донора может передаваться только одной из двух дочерних клеток, т. е. наследоваться однолинейно и постепенно утрачиваться.
Конъюгация - перенос генетического материала их клетки-донора в клетку-реципиента при их скрещивании. Процесс конъюгации у бактерий впервые обнаружен Д. Ледербергом и Э. Тейтумом в 1946 г.Позднее выяснилось, что донорами генетического материала являются клетки, несущие F-плазмиду (половой фактор). При скрещивании F + с F" клеткой половой фактор передается независимо от хромосомы донора, если плазмида находится в автономном состоянии. При этом почти все реципиентные клетки получают F плазмиду и становятся F + клетками.
Этапы коньюгации:
прикрепление клетки-донора к реципиентной клетке с помощью половых ворсинок (sex pili).
образуется конъюгационный мостик, через который из клетки-донора в клетку-реципиент могут передаваться F-фактор и другие плазмиды, находящиеся в цитоплазме бактерии-донора в автономном состоянии.
Интеграция F-плазмиды в состав бактериальной хромосомы приводит к разрыву одной из нитей ДНК, что обеспечивает возможность переноса в реципиентную клетку.
Постановка опыта трансдукции
Умеренный фаг, полученный при фильтровании из культуры E.coli в объеме 1 мл вносят в стерильную пробирку, затем в эту пробирку вносят 1 мл бульонной культуры E.coli, не способной расщеплять лактозу. Опытную пробирку выдерживают в термостате 40 мин. Затем делают высевы на сектора чашки со средой Эндо: умеренный фаг; E.coli lac-; из опытной пробирки.
Постановка опыта конъюгации
В отдельную стерильную пробирку вносят бульонную культуру донора и бульонную культуру реципиента в объеме по 1 мл. Опытную пробирку выдерживают в термостате 40 мин. Затем производят высевы культуры донора, реципиента и смесь донора с реципиентом на отдельные сектора минимальной питательной среды. Инкубируют 24 часа 37°С.
Рекомбинация у прокариот. Трансформация. Конъюгация. Трансдукция. Особенности построения генетических карт у прокариот.
Генетическая рекомбинация
Генотипическая изменчивость прокариот наблюдается в результате рекомбинации генетт-го материала за счет частичного объединения геномов двух клеток и проявляется в фенотипе бактерий. К рекомбинативной изменчивости генетт-го материала прокариот приводят трансформация, трансдукция и конъюгация.
В отличие от эукариот, у которых при половом процессе происходит образование истинной зиготы, объединяющей генетт.материал обоих родителей, у прокариот при всех трех вышеуказанных процессах наблюдается лишь частичный перенос генет-го материала из клетки-донора в клетку-реципиент, что приводит к обр-ию неполноценной зиготы – мерозиготы . Т.о., прокариотная клетка-реципиент становится частично диплоидной, сохраняя в основном генотип клетки-реципиента и приобретая лишь отдельные свойства клетки-донора.
Ответственность за рекомбинации несут специальные гены клетки-реципиента, получившие название rec-генов
. Механизм рекомбинаций включает ряд последовательных стадий:
1) разрыв нитей ДНК клетки-реципиента;
2) встраивание фрагментов ДНК, привнесенных из клетки-донора в геном клетки-реципиента;
3) репликация рекомбинативной ДНК, дающей начало потомству клеток с измененным геномом.
Доказательства вышеуказанного механизма рекомбинации были экспериментально получены при изучении процесса конъюгации кишечной палочки (E.coli) с использованием меченных по фосфору (Р 32) клеток-доноров.
Трансформация (от лат.– преобразование) – изменение генома и свойств бактерий в рез-те переноса информации при проникновении фрагмента свободной ДНК из среды в кл-ку. При трансформации не требуется непосредственного контакта м/у клеткой-донором и клеткой-реципиентом. Источником трансформирующей ДНК может служить свежеубитая культура бактерий или чистые препараты ДНК, экстрагированной из нее.
Явление трансформации у бактерий впервые наблюдал Ф. Гриффитс в 1928 г. Он обнаружил, что при совместном ведении в организм мышей убитого вирулентного капсульного пневмококка S-типа с живым авирулентным бескапсульным пневмококком R-типа все животные погибают. При этом из крови погибших мышей наряду с бескапсульными пневмококками R-типа выделяются вирулентные капсульные пневмококки S-типа. Гриффитс не сумел объяснить явление трансформации. Лишь в 1944 г. О. Эвери, К. Мак-Леод и М. Мак-Карти выделили трансформирующее вещество из убитых клеток капсульных пневмококков и показали, что им является ДНК, чувствительная к ДНК-полимеразе.
Процесс трансформации проходит в несколько этапов
:
1) адсорбция трансформирующей ДНК на поверхности компетентной клетки-реципиента;
2) ферментативное расщепление трансформирующей ДНК с образованием фрагментов со средней молекулярной массой (4-5)·10 6 ;
3) проникновение фрагментов ДНК в клетку-реципиент, сопровождающееся деградацией одной из цепей ДНК и образованием одноцепочечных фрагментов;
4) интеграция – включение фрагментов трансформирующей ДНК в ДНК клетки-реципиента путем генетт-го обмена;
5) экспрессия – интенсивное размножение трансформированных клеток, потомство которых будет иметь измененный ген в молекуле ДНК.
Трансформирующий фрагмент ДНК обычно соответствует 0,3% бактериальной хромосомы, или примерно 15 генам. В клетку-реципиент проникает очень малый фрагмент ДНК, что обуславливает трансформацию только одного признака и редко двух. Путем трансформации из одной клетки в другую могут быть перенесены такие признаки бактерий, как устойчивость к лекарств.препаратам, способность к синтезу капсульных полисахаридов, ферментов, определенных метаболитов и т.д. При трансформации не происходит добавления качественно нового наследственного признака, наблюдается лишь замена одного признака другим.
Трансдукция заключается в переносе генетт-го материала из клетки-донора в клетку-реципиент умеренным бактериофагом. Явление трансдукции в 1952 г. открыли Н. Циндер и Дж. Ледерберг на примере двух штаммов сальмонелл.
По механизму взаимодействия с бактериальной клеткой фаги подразделяются на вирулентные и умеренные. Вирулентные фаги, проникая в клетку, обусловливают формирование новых фагов и лизис бактерий. Заражение клеток умеренными фагами не всегда сопровождается лизисом бактерий, часть их выживает и становится лизогенными. В лизогенных бактериях ДНК-фага включается в ДНК-клетки и умеренный фаг превращается в профаг, утрачивая при этом способность лизировать бактериальную клетку. Профаг ведет себя как часть бактериальной хромосомы и репродуцируется в ее составе в течение ряда поколений. Освобождение умеренных фагов из клеток лизогенных бактерий происходит спонтанно либо под действием лизогенных бактерий происходит спонтанно либо под действием индуцированных агентов – ультрафиолетовых лучей, ионизирующей радиации и химических мутагенов.
В процессе репродукции некоторых умеренных фагов небольшой фрагмент бактериальной хромосомы, включается в геном фага. Трансдуцирующий фаг переносит фрагмент ДНК предыдущего хозяина в новую чувствительную к нему бактериальную клетку. Т.о., бактериальная клетка-реципиент становится частичной зиготой.
У бактерий различают 3 типа трансдукции : специализированную, общую и абортивную.
Специализированная - в геном фага включаются строго определенные гены ДНК бактерии-донора, расположенные на хромосоме бактерии непосредственно рядом с профагом. Прилегающие к профагу гены выщепляются из бактер-ой хромосомы, а часть генов профага остается в ее составе. Освобождающиеся из клетки-донора трансдуцирующие дефектные фаги вызывают лизогенезацию клетки-реципиента. ДНК дефектного фага включается в состав хромосомы клетки-реципиента, привнося в нее и гены бактерии-донора.
Общая - отличается от специализ-ой тем, что в состав ДНК фага включается любой фрагмент ДНК бактерии-донора. Т.о., при общей трансдукции трансдуцирующие фаги переносят из хромосомы бактерии-донора любые гены, контролирующие различные признаки, в клетку бактерии-реципиента.
Абортивная - фрагмент хромосомы клетки-донора, привнесенный трансдуцирующим фагом в клетку-реципиент, не включается в ее хромосому, а локализуется в цитоплазме и при делении клетки-реципиента передается только одной из образующихся клеток.
Трансдукция в эксперименте показана на кишечных бактериях, псевдомонадах, стафилококках, бациллах и актиномицетах. Трансдукция определяет появление разновидностей бактерий с новыми свойствами, устойчивость к лекарственным препаратам, синтез ферментов, аминокислот и др.
В экспериментах по генной инженерии трансдукция открывает не только широкие возможности межвидовой гибридизации бактерий, но и возможность получения гибридов среди разных групп прокариот.
Конъюгация происходит при непосредственном контакте бактер-ых кл-ок и предусматривает направленный перенос генетт-го материала из клетки-донора в клетку-реципиент. Феномен конъюгации в 1946 г. описали Дж. Ледерберг и Э. Тейтум на примере кишеч.палочки (E.coli) штамма К 12 .
Способность бактерий к конъюгации связана с наличием у них полового F-фактора, относящегося к числу конъюгативных плазмид. Клетки, несущие F-фактор, обозначаются F + ; клетки, лишенные F-фактора, - F ¯ . F-фактор (F-плазмида) в клетках F + обычно находится в изолированном состоянии от бактериальной хр-мы и является цитоплазматической структурой. Бактер-ые клетки, содержащие F-фактор, отличаются от остальных клеток рядом свойств: измененным поверхностным зарядом и способностью синтезировать дополнительные поверхностные структуры F-пили.
Процесс конъюгации начинается с прикрепления конца F-пили клетки-донора к клетке-реципиенту. В теч.неск-их минут клетка-донор и клетка-реципиент сближаются, возможно, за счет сокращения F-пили и вступают в непосредственный контакт. Ч/з цитоплазматический мостик по каналу F-пили, менее чем за 5 мин, происходит передача полового F-фактора, независимо от бактериальной хромосомы, из цитоплазмы клетки-донора F + в цитоплазму клетки-реципиента F ¯ . При этом клетка-донор не теряет своей донорной способности, так как в ней остаются копии F-фактора.
Среди популяции клеток F + имеются бактерии, способные при конъюгации передавать не F-фактор, а фрагмент бактериальной хромосомы. Эти клетки бактерий и образованные ими штаммы обозначаются Hfr (high frequency of recombination), что означает бактерии с высокой частотой рекомбинации. Рекомбинации м/у кл-ми Hfr и кл-ми F ¯ происходят в тысячу раз чаще, чем между клетками F + и F ¯ . Отличие клеток Hfr от клеток F + заключается в том, что половой F-фактор у них включён в бактериальную хромосому. Во время конъюгации в клетке-доноре Hfr идет процесс репликации ДНК. При этом одна из реплицирующихся цепей ДНК ч/з конъюгационный мостик проникает в клетку-реципиент F ¯ , вторая остается в клетке-доноре Hfr, затем каждая из этих цепей достраивается комплементарной нитью. Конъюгационный мостик непрочен, он легко разрывается, поэтому из клетки-донора Hfr в клетку-реципиент F ¯ передается не вся хромосома, а лишь ее фрагмент.
М/у перенесенным из клетки Hfr фрагментом хромосомы и гомологичным участком хромосомы клетки F ¯ происходит генет-ий обмен. В результате часть донорной ДНК встраивается в ДНК реципиента, а соответствующая часть реципиентной ДНК исключается из нее. Эффективность включения донорной ДНК в хромосому реципиента высока и составляет примерно 0,5.
Конъюгацию прокариот не следует отождествлять с половым процессом эукариот, т.к.при конъюгации в клетку F ¯ передается только часть генет-го материала клетки F + , в результате чего образуется неполноценная мерозигота. Основу последней составляет геном клетки-реципиента с привнесенной частью генома клетки-донора.
Наряду со стабильностью и точностью наследственных свойств генетический аппарат прокариот характеризуется изменчивостью, которая проявляется в форме мутаций и рекомбинаций.
Спонтанные мутации прокариот следует считать начальным видом изменчивости, возникшим параллельно началу функционирования их ДНК как генетической структуры. Возможно, что на протяжении миллионов лет мутации были единственным механизмом изменчивости прокариот.
Скачком в эволюции прокариот явилось появление рекомбинативной изменчивости, заключающейся в частичном объединении генет-ой информации двух прокариотных клеток донора и реципиента. Т.о. возник новый дополнительный материал для естеств.отбора, ускоряющий процесс эволюции. Из трех вышерассмотренных рекомбинативных процессов наиболее совершенным является конъюгация, т.к.она обеспечивает более полный обмен генетической информации м/у двумя клетками. Известны случаи, когда при длительной конъюгации (90 мин) двух клеток E.coli наблюдается вхождение всей хромосомы клетки-донора в клетку-реципиент.
Эффективность генет-их рекомбинаций оказывается высокой только для близкородственных бактерий, имеющих родство в пределах вида.
Особенности построения генетических карт у прокариот
Для построения генетт.карт у прокариот используется явление конъюгации – переноса генетт-го материала из одной клетки в другую с помощью спец.кольцевых молекул ДНК (плазмид, в частности, с помощью F–плазмиды).
Вероятность переноса определенного гена в клетку–реципиент зависит от его удаления от F–плазмидной ДНК, а точнее, от точки О, в которой начинается репликация F–плазмидной ДНК. Чем больше время конъюгации, тем выше вероятность переноса данного гена. Это дает возможность составить генетическую карту бактерий в минутах конъюгации. Например, у кишечной палочки ген thr (оперон из трех генов, контролирующих биосинтез треонина) находится в нулевой точке (то есть непосредственно рядом с F–плазмидной ДНК), ген lac переносится через 8 мин, ген recE – через 30 мин, ген argR – через 70 мин и т.д.
Рекомбинация – совокупность процессов, связанных с замещением участка исходной нуклеиновой кислоты на гомологичный (сходный) участок.
При этом степень гомологии может быть различной: от полной идентичности исходной и новой нуклеотидных последовательностей до заметных расхождений, приводящих к изменению фенотипа. В результате рекомбинации образуются новые сочетания аллелей, например: AB + ab → Ab + aB.
У прокариот существует три способа включения в геном чужеродной ДНК: трансформация, конъюгация и трансдукция.
Трансформация
Трансформацией называется перенос чистой ДНК из одних клеток в другие. Трансформация была открыта бактериологом Ф. Гриффитсом в 1928 г. в опытах с пневмококками. У пневмококков известно два типа штаммов: S– и R–формы.
S–форма характеризуется наличием полисахаридной капсулы, благодаря чему при искусственном культивировании она образует гладкие блестящие колонии; эта форма патогенна для мышей. R–форма не имеет капсулы, при искусственном культивировании она образует шероховатые колонии; эта форма непатогенна для мышей. Но если мышам одновременно ввести убитые S-клетки и живые R-клетки, то мыши погибают. Следовательно, генетические свойства одного штамма влияют на генетические свойства другого штамма.
В 1944 г. О. Эвери, К. МакЛеод и М. МакКарти доказали, что изменение наследственных свойств клеток связано с переносом ДНК.
Способность клетки к трансформации возможна при особом ее состоянии, которое называется компетентностью. У компетентных клеток изменяется состав клеточной стенки и плазмалеммы: стенка становится пористой, плазмалемма образует многочисленные впячивания, а на внешней поверхности появляются особые антигены – факторы компетентности (в частности, специфические белки с низкой молекулярной массой).
В природных условиях внеклеточная чистая ДНК образуется при гибели (лизисе) прокариот.
Как правило, трансформация происходит в пределах одного вида прокариот, но при наличии гомологичных генов наблюдается и межвидовая трансформация.
Процесс трансформации включает следующие стадии:
1. Присоединение трансформирующей двунитевой ДНК к рецепторам на поверхности клетки–реципиента.
2. Превращение двунитевой ДНК в однонитевую.
3. Проникновение однонитевой ДНК в клетку.
4. Интеграция трансформирующей ДНК в хромосому реципиента и рекомбинация генетического материала.
Длина трансформирующей ДНК должна быть от 500 до 200 тысяч пн. Энергия, выделяющаяся при деградации одной из нитей ДНК, используется для активного транспорта оставшейся нити вовнутрь клетки.
Первые три стадии трансформации не зависят от нуклеотидного состава ДНК. Однако процесс интеграции трансформирующей ДНК в хромосому реципиента более вероятен при высокой гомологичности этой ДНК по отношению к ДНК реципиента.
Процесс трансформации изображен на схеме. Каждый отрезок прямой соответствует одной цепи ДНК. Трансформирующая ДНК обозначена черным цветом, а ДНК клетки–реципиента – серым цветом.
На первой стадии трансформирующая ДНК присоединяется к рецепторным сайтам на поверхности клетки–реципиента.
На втором этапе двунитевая ДНК на поверхности клетки превращается в однонитевую за счет расщепления одной из нитей бактериальными нуклеазами.
На третьем этапе оставшаяся нить ДНК транспортируется через мембрану в цитоплазму. При этом используется энергия, выделившаяся при деградации комплементарной цепи.
При репликации бактериальной хромосомы трансформирующая нить ДНК присоединяется к гомологичному (частично комплементарному) участку ДНК клетки–реципиента. При этом из-за отсутствия полной комплементарности образуется гетеродуплекс («молекулярная гетерозигота») – участок двунитевой ДНК, на котором не во всех нуклеотидных парах азотистые основания связаны водородными связями. Остальная часть ДНК реплицируется нормальным образом.
После окончания репликации ДНК клетка–реципиент делится с образованием двух клеток: частично трансформированной клетки с хромосомой, включающей гетеродуплексный участок ДНК, и нетрансформированной клетки. При репликации ДНК в частично трансформированной клетке на обеих цепях ДНК происходит достраивание комплементарных цепей. Одна цепь сохраняет исходные последовательности нуклеотидов, а другая становится полностью трансформированной. После деления частично трансформированной клетки образуется одна нетрансформированная клетка и одна полностью трансформированная, у которой исходная последовательность нуклеотидов замещена на последовательность нуклеотидов трансформирующей ДНК.
Таким образом, при трансформации происходит замещение генов реципиента на гомологичные нуклеотидные последовательности. Чем выше степень гомологии, тем успешнее протекает трансформация.
Частота трансформации у прокариот зависит от свойств трансформирующей ДНК, от ее концентрации, от состояния клетки–реципиента, от вида бактерий. Максимальная частота трансформированных клеток не превышает 1 на 100 клеток.
Трансформация известна и для эукариот. Однако на поверхности эукариотических клеток отсутствуют рецепторные сайты, и трансформирующую ДНК вводят в клетки искусственно. Например, в яйцеклетки животных ДНК вводят путем прямой микроинъекции, а в яйцеклетки растений – путем микроинъекции в пыльцевую трубку. Широко используются методы биобаллистики (биолистики), позволяющие вводить любые фрагменты ДНК в культуры тканей растении.
Конъюгация
Конъюгацией у прокариот называется прямой контакт двух разнокачественных клеток, сопровождаемый хотя бы частичным переносом генетического материала от клетки-донора к клетке-реципиенту. (Процесс конъюгации был открыт в 1946 г. Дж. Ледербергом и Э. Татумом).
У кишечной палочки клетка-донор («мужская») имеет продолговатую форму, клетка-реципиент («женская») – изодиаметрическую. Клетка-донор образует половые ворсинки (пили), которые притягивают ее к клетке-реципиенту и образуют цитоплазматические каналы. По этим каналам ДНК из клетки-донора переходит в клетку-реципиент. Существует три типа клеток-доноров: F + (эф–плюс), Hfr (эйч–эф–а) и F ′ (эф–прим).
F + -доноры содержат в цитоплазме половой фактор – специфическую F–плазмиду.
F–плазмида – это автономный репликон длиной около 100 тпн. В составе F–плазмиды изучено более 20 генов. Примерно половина из них образует гигантский оперон tra (длиной около 30 тпн); продукты этого оперона контролируют образование контакта между донором и реципиентом и собственно перенос ДНК. Остальные гены регулируют работу tra–оперона.
Клетка-реципиент не содержит F–плазмиды и обозначается как F – –клетка.
При образовании цитоплазматического мостика одна из цепей F–плазмиды надрезается в определенной точке (точка О), а на комплементарной цепи начинается репликация ДНК по принципу «катящегося кольца». Копия комплементарной цепи по цитоплазматическому мостику переходит в цитоплазму клетки–реципиента, и на ней достраивается недостающая цепь. После окончания репликации двунитевая плазмидная ДНК замыкается в кольцо, и F – –клетка превращается в F + –клетку. Полное время переноса копии F–плазмиды в клетку–реципиент составляет примерно 5 минут.
Однако при скрещивании F + × F – в клетку–реципиент попадают только гены, содержащиеся в F –плазмиде; гены домашнего хозяйства, локализованные в бактериальной хромосоме, в клетку–реципиент не переносятся.
В то же время F–плазмида может встраиваться в бактериальную хромосому, то есть переходить в интегрированное состояние. В бактериальной хромосоме имеется около 20 сайтов интеграции F–плазмиды. Тогда при переносе копии одной из цепей F–плазмиды в клетку–реципиент за ней увлекается и копия одной из цепей бактериальной хромосомы. Клетки с интегрированной F–плазмидой называются Hfr–доноры (от англ. «высокая частота рекомбинаций»). В зависимости от условий возможен полный или частичный перенос копии бактериальной хромосомы Hfr–донора в цитоплазму реципиента. В результате образуется клетка с одной исходной двунитевой бактериальной хромосомой и одной полной или неполной гомологичной однонитевой молекулой ДНК. Такая клетка называется мерозигота («частичная зигота»). Далее при репликации ДНК протекает рекомбинация. Этот процесс принципиально не отличается от рекомбинации при трансформации.
Перенос копии ДНК начинается примерно с середины F–плазмидной ДНК (с точки О, в которой одна из цепей ДНК надрезается, и начинается репликация F–плазмидной ДНК). Таким образом, половина F–плазмидной ДНК проникает в клетку–реципиент в начале конъюгации, а вторая половина – только после полного переноса копии хромосомной ДНК. Для полного завершения этого процесса при t = 37 0 С требуется более 100 минут. Однако в природных условиях конъюгация прерывается значительно раньше, в клетку–реципиент переходит только часть копии хромосомы донора и только первая половина F–плазмидной ДНК. Таким образом, клетка-реципиент не принимает свойства Hfr–донора.
Однако существуют штаммы бактерий, у которых копия бактериальной хромосомы вместе с копией F–плазмидной ДНК переносится полностью. Такие клетки называются vHfr–доноры (от англ. «очень высокая частота рекомбинаций»).
Вероятность переноса определенного гена в клетку–реципиент зависит от его удаления от F–плазмидной ДНК, а точнее, от точки О, в которой начинается репликация F–плазмидной ДНК. Чем больше время конъюгации, тем выше вероятность переноса данного гена. Это дает возможность составить генетическую карту бактерий в минутах конъюгации. Например, у кишечной палочки ген thr (оперон из трех генов, контролирующих биосинтез треонина) находится в нулевой точке (то есть непосредственно рядом с F–плазмидной ДНК), ген lac переносится через 8 мин, ген recE – через 30 мин, ген argR – через 70 мин и т.д.
F–плазмида может переходить из интегрированного состояния в автономное путем самовырезания из бактериальной хромосомы. В этом случае возможен захват и части хромосомной ДНК (до 50 % хромосомных генов). F–плазмида, включающая хромосомные гены, называется F ′ –фактором. Перенос генетического материала при скрещиваниях F ′ × F – называется сексдукция.
Кроме F–плазмиды у прокариот известны и другие типы половых факторов (R, Ent, Hly, Col), обеспечивающих перенос генетического материала от бактерии к бактерии. На основе природных плазмид (в том числе ДНК хлоропластов и митохондрий) получены полусинтетические молекулы ДНК, обеспечивающие перенос генетического материала из одной клетки в другую, называются векторы. Векторы должны обеспечивать не только устойчивый перенос генов, но и регуляцию их транскрипции.
Прокариотические плазмиды могут реплицироваться только в прокариотических клетках. В то же время, существует необходимость переноса генов от эукариот к прокариотам и наоборот. Для этого используются челночные плазмиды, которые содержат два репликатора (прокариотический и эукариотический) и способны реплицироваться и в прокариотических, и в эукариотических клетках, например, Ti– и Ri–плазмиды, способные к репликации в прокариотических и растительных клетках, и полусинтетические векторы, созданные на их основе. Для защиты векторов от разрушения нуклеазами их заключают в фосфолипидные пузырьки – липосомы.
Трансдукция
Трансдукцией называется перенос генетического материала с помощью вирусов из клетки-донора в клетку-реципиент. (Явление трансдукции открыл в 1951 г. Н. Зиндер (ученик Дж. Ледерберга)).
При трансдукции в вирионы попадает ДНК клетки-хозяина. Вирионы заражают другие клетки, и ДНК исходной бактериальной клетки проникает в другую бактериальную клетку. Вирусная ДНК интегрируется в бактериальную хромосому, а привнесенная бактериальная ДНК рекомбинирует с ДНК бактериальной хромосомы. В результате 50% клеток оказываются трансформированными.
Различают общую (неспецифическую), ограниченную (специфическую) и абортивную трансдукцию.
Общая трансдукция
При общей трансдукции фрагменты бактериальной ДНК донора случайно включаются в созревающую фаговую частицу вместе с фаговой ДНК или вместо фаговой ДНК. Фрагменты бактериальной ДНК образуются при ее разрезании ферментом, контролируемым фагом. В состав фаговой частицы может включаться до 100 бактериальных генов.
Ограниченная трансдукция
При ограниченной трансдукции происходит рекомбинация – бактериальная ДНК замещает часть фаговой ДНК. В состав рекомбинантной ДНК входит небольшое количество бактериальных генов, прилежащих к фаговой ДНК, интегрированной в бактериальную хромосому.
При общей и ограниченной трансдукции донорская ДНК замещает гомологичные участки ДНК реципиента. Этот процесс сходен с трансформацией.
Абортивная трансдукция может быть и неспецифической, и специфической. Ее сущность заключается в том, что трансдуцируемый фагом фрагмент ДНК не включается в хромосому реципиента, а существует как цитоплазматический репликон. Рано или поздно этот репликон утрачивается.
Явление трансдукции вирусами широко используется при переносе генов у эукариот. Если применяется вирус, неспособный формировать капсид (то есть существующий только в форме ДНК), то трансдукция принципиально не отличается от трансформации или от конъюгативного переноса генетического материала с помощью плазмид–векторов. Созданы системы векторов на основе модифицированных вирусов SV40 (они образуют в клетке до 100 тысяч копий), герпеса, осповакцины, вирус мозаики цветной капусты.
Следует еще раз подчеркнуть, что все описанные типы рекомбинации связаны не с добавлением новых участков ДНК, а с замещением уже имеющихся нуклеотидных последовательностей. Чем выше степень гомологии трансформирующей и исходной ДНК, тем выше вероятность успешной рекомбинации. Легче всего удается рекомбинация ферментов, имеющихся у всех организмов. Труднее ввести в геном новые регуляторы, отличающиеся высокой специфичностью. Поэтому для внедрения в геном новых генов используются более сложные методы, связанные с биохимическими модификациями ДНК.
Тема 7: Цитоплазматическое наследование. Генетика соматических клеток и тканей.
1. Цитоплазматическое наследование. Генетический материал полуавтономных органоидов. Пластидное наследование. Наследование через митохондрии. Цитоплазматическая мужская стерильность
2. Особые типы наследования. Предетерминация цитоплазмы. Наследование через инфекцию и эндосимбионтов
3. Генетика соматических клеток. Соматические мутации. Химеры. Генетика онкологических заболеваний.
Комбинативные изменения.
Появляются в результате трансформации и конъюгации. Трансформация - это процесс переноса участка генетического материала ДНК, содержащего одну пару нуклеотидов, отклетки-донорак клеткерецептору.
Впроцессе трансформации различают 5 стадий:
1)Адсорбция трансформирующей ДНК на поверхности микробной клетки;
2)Проникновение ДНК в клетку-реципиент;
3)Спаривание внедрившейся ДНК с хромосомными структурами клетки;
4)Включение участка ДНК клетки-донорав хромосомные структурыклетки-реципиента;
5)Дальнейшее изменение нуклеотида в ходе последующих делений. Оптимальная температура трансформации 29-32ͦС.
Трансдукция- это изменение, при котором генетический материал отклетки-доноракклетке-реципиентупереносит трансдуцирующий (умеренный) фаг, т.е. фаг, не вызывающий ее разрушения.
Различают три типа трансдукции:
1)Общая (неспецифическая), может происходить перенос различных или нескольких признаков одновременно.
2)Специфическая, характеризуется переносом только определѐнного признака.
3)Абортивная, участок ДНК клетки-донора,перенесенный фагом вклетку-реципиента,не включается в ее геном.
Конъюгация - форма полового процесса, при котором происходит соединение мужской и женской микробных клеток и обмен между ними ядерным веществом.
При этом генетический материал клетки-донорапереходит в клеткуреципиент. После рекомбинации и деления клетки образуются формы с признаками конъюгирующих клеток.
Таким образом, все три формы комбинативной изменчивости (трансформация, трансдукция, конъюгация) различны по форме, но одинаковы по существу. При трансформации участок ДНК клетки-доноравходит вклетку-реципиент,при трансдукции эту роль выполняет фаг, а при конъюгации перенос генетической информации осуществляется через цитоплазматический мостик (пили).
Риккетсии
Грамотрицательные микробы. По формекороткие палочки или кокки. Риккетсии имеют клеточную стенку, которая сходна с клеточной стенкой грамотрицательных бактерий.
Относят к истинным бактериям. Прокариоты.
Нитрификация.
Продукты гниения белков и разложения мочевиныаммиак и аммиачные соли – могут быть непосредственно усвоены растениями, но они обычно превращаются в нитратысоли азотной кислоты.
В первой фазе нитрификации аммиак окисляется до азотной кислоты по схеме
DG = -662кДж/моль.
Процесс нитрификации проходит в несколько стадий, при этом образуется ряд промежуточных продуктов: гидроксиламин, нитроксил и др.
Во второй фазе азотистая кислота окисляется до азотной:
DG= -201кДж/моль.
Первая и вторая фаза единого процесса нитрификации вызываются разными возбудителями. С.Н. Виноградский объединил их в три рода:
1)Nitrosomonas. Имеют форму палочек, грамотрицательные, подвижные, снабжены одним жгутиком, спор не образуют. Широко распространены в почве и отличаются друг от друга формой и размерами.
2)Nitrosocystis. Способен образовывать зооглеи (кокковые формы микробов, окружающей капсулой)
3)Nitrosospira. Они разделяется на два вида. Бактерии обоих видов имеют правильную спиральную форму. Наряду со спирально закрученными нитями у старых культур встречаются короткие палочки и кокки.
Впоследнее время выделено еще два рода микробов, вызывающих первую фазу нитрификации.
Нитрифицирующие бактерии отрицательно относятся к органическим веществам. Сильная чувствительность нитрифицирующих микробов к органическим веществам отмечается в растворах; в почве этого не наблюдается, т.к. в ней водорастворимых веществ в значительных количествах никогда не бывает.
На процессы окисления аммиака влияют не только микробы, но и их ферменты. Кроме органического вещества на нитрификацию оказывает влияние концентрация аммиака. Его действие на культуру резко проявляется в условиях жидких сред. В почве же аммиак находится адсорбированном состоянии и не может оказывать угнетающего действия. Поэтому нитробактер сразу же окисляет азотистую кислоту в азотную.
На процесс нитрификации положительно сказывается присутствие кислорода. В обрабатываемых почвах процесс нитрификации протекает более интенсивно.
