ГОСТ Р 54635-2011
Группа Н59
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ
Метод определения витамина А
Functional food products. Method of vitamin A determination
ОКС 67.050
ОКСТУ 9109
Дата введения 2013-01-01
Предисловие
Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом N 184-ФЗ "О техническом регулировании" от 27 декабря 2002 г. , а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Учреждением Российской академии медицинских наук Научно-исследовательским институтом питания
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 36 "Функциональные пищевые продукты"
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 декабря 2011 г. N 784-ст
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
1 Область применения
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на функциональные пищевые продукты и устанавливает метод определения массовой доли витамина А в виде ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ).
Диапазон измерений массовой доли витамина А составляет от 0,5 до 10,0 млн.
Примечание - Настоящий стандарт допускается распространять на пищевые продукты при условии соблюдения диапазона измерений.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ Р 8.563-2009 Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений
ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006 * Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
________________
ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009
ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ Р 52062-2003 Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб
ГОСТ Р 52179-2003 Маргарины, жиры для кулинарии, кондитерской, хлебопекарной и молочной промышленности. Правила приемки и методы контроля
ГОСТ Р 52349-2005 Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины и определения
ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия
ГОСТ 4517-87 Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9293-74 Азот газообразный и жидкий. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 13496.0-80 * Комбикорма, сырье. Методы отбора проб
________________
* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ Р ИСО 6497-2011 , здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.
ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия
ГОСТ 19627-74 Гидрохинон (парадиоксибензол). Технические условия
ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб канализу
ГОСТ 27025-86 Реактивы. Общие указания по проведению испытаний
ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р 52349 , а также следующий термин с соответствующим определением:
4 Сущность метода
Определение витамина А в экстракте, полученном из анализируемой пробы, проводят разделением методом ВЭЖХ с последующим фотометрическим или флуориметрическим детектированием. При необходимости экстракт получают после щелочного гидролиза анализируемой пробы.
Количественный анализ проводят методом внешнего стандарта с использованием площади или высоты пиков ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола.
5 Требования безопасности
5.1 Условия безопасного проведения работ
При выполнении испытаний необходимо соблюдать требования пожарной безопасности, установленные ГОСТ 12.1.004 , электробезопасности - ГОСТ Р 12.1.019 , техники безопасности при работе с реактивами - ГОСТ 12.1.007 , а также требования, изложенные в технической документации на спектрофотометр, хроматограф, другие приборы и оборудование.
Помещение, в котором проводят испытания, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Контроль за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны следует проводить в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005 .
При работе с газовыми баллонами необходимо руководствоваться .
5.2 Требования к квалификации оператора
К выполнению испытаний и обработке результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием по профессиям: химик, инженер-химик, техник, лаборант, с опытом работы в химической лаборатории. Первое применение метода в лаборатории следует проводить под наблюдением квалифицированного специалиста в области ВЭЖХ.
6 Условия выполнения испытания
6.1 Общие условия
Испытания проводят в нормальных лабораторных условиях: температура окружающей среды - (25±5) °С; относительная влажность - (65±15)%; частота переменного тока - (50±5) Гц; напряжение в сети - (220±10) В.
При приготовлении и хранении растворов следует выполнять требования ГОСТ 27025 , ГОСТ 4517 .
Для предотвращения разрушения витамина А анализ испытуемого материала и стандартов проводят в присутствии антиоксиданта (аскорбиновой кислоты, гидрохинона, пирогаллола), предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.
6.2 Условия фотометрических измерений
Условия фотометрических измерений приведены в таблице 1.
Таблица 1 - Условия фотометрических измерений
Витамин А | Растворитель | Длина волны, нм | Удельный коэффициент поглощения |
Ретинол | |||
Ретинола ацетат | |||
Ретинола пальмитат | 2-пропанол |
6.3 Условия хроматографического анализа
Температура хроматографической колонки: 25 °С или температура окружающей среды.
Скорость потока подвижной фазы: 0,7 см/мин (ориентировочное значение).
Объем вводимой пробы: 50·10 см.
Подвижная фаза: смесь ацетонитрила, метилового спирта, метилена хлористого в объемном соотношении 50:45:5.
Проверку оптимальности условий хроматографического разделения осуществляют путем хроматографического анализа смешанного раствора ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола с массовой концентрацией каждого вещества не менее 0,4 мкг/см. Данный смешанный раствор готовят из основных растворов ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола по аналогии с методикой приготовления рабочих растворов по 8.1.2. Эффективность хроматографического разделения признается удовлетворительной, если коэффициент разделения соседних пиков ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола составляет не менее 1,3. В противном случае для достижения требуемой эффективности разделения экспериментальным путем подбирают скорость потока подвижной фазы или проводят испытания других колонок.
7 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
7.1 Для определения содержания массовой доли витамина А применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование и материалы:
- весы по ГОСТ Р 53228 , обеспечивающие точность взвешивания с пределами допускаемой абсолютной погрешности ±0,1 мг;
- спектрофотометр со спектральным диапазоном работы от 190 до 1100 нм, основной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%;
- кюветы кварцевые с длиной оптического пути 1 см;
- хроматограф высокоэффективный жидкостный, включающий следующие элементы: насос; устройство для ввода проб; флуориметрический детектор (длины волн, нм: возбуждения - 325 нм, эмиссии - 470 нм) или спектрофотометрический детектор (длина волны детектирования - 325 нм) с уровнем шумов не более 10 единиц оптической плотности и относительной погрешностью измерений не более 10%; колонку аналитическую для ВЭЖХ диаметром 0,30-0,46 см, длиной 10-25 см, заполненную октадецилсиликагелем с размером частиц 5 мкм; регистрирующее устройство - интегратор или самописец, позволяющий проводить измерение площади (или высоты) пика с погрешностью не более 1%; программное обеспечение для обработки полученных результатов измерений;
- фильтры для фильтрования подвижной фазы и анализируемых растворов (например, с размером пор 0,45 мкм);
- микрошприц типа "Гамильтон" вместимостью 0,1 см для ввода проб в жидкостный хроматограф;
- пипетки градуированные 1(2,3)-1(2)-1-0,5(1,2,5,10,25) по ГОСТ 29227 или дозаторы автоматические с аналогичными или изменяемыми объемами доз с относительной погрешностью дозирования не более ±1%;
- цилиндры 1-50(100,250)-1(2) по ГОСТ 1770 ;
- колбы мерные 2-50(100,250,500,1000)-2 по ГОСТ 1770 ;
- пробирки мерные с притертыми пробками П-2-5(10,15,20,25)-0,1(0,2)ХС по ГОСТ 1770 ;
- стаканы В(Н)-1-50(100,150,250)ТХС по ГОСТ 25336 ;
- колбы круглодонные К-1-100(250,500)-29/32ТС по ГОСТ 25336 ;
- воронки В-36(56)-80ХС, В-75-110(140)ХС, В-100-150ХС по ГОСТ 25336 ;
- линейка металлическая с ценой деления 1 мм по ГОСТ 427 ;
- встряхиватель для колб и пробирок с диапазоном частот колебаний платформ 100-150 колебаний в минуту;
- центрифуга, обеспечивающая 4-6 тыс. об/мин;
- баня водяная с регулятором нагрева, поддерживающая температуру от 40 ° до 100 °С;
- баня ультразвуковая лабораторная рабочим объемом не менее 2 дм;
- испаритель ротационный с диапазоном рабочего давления от 7 мм рт.ст. до 760 мм рт.ст. (от 9·10 Па до 10·10 Па) или насос водоструйный по ГОСТ 25336 ;
- холодильники стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336 ;
- термометр лабораторный жидкостный диапазоном температур от 0 °С до 100 °С, ценой деления шкалы 1 °С по ГОСТ 28498 ;
- баллон с газообразным азотом по ГОСТ 9293 , ос.ч., и по ;
- бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026 ;
- плитка электрическая закрытого типа по ГОСТ 14919 ;
- мельница лабораторная электрическая;
- холодильник бытовой по ГОСТ 16317 .
7.2 При выполнении измерений применяют следующие реактивы и материалы:
- спирт этиловый абсолютный () массовой долей основного вещества не менее 99,9%;
- спирт этиловый ректификованный () массовой долей основного вещества не менее 96% или по ГОСТ Р 51652 , ГОСТ 18300 ;
- спирт метиловый () массовой долей основного вещества не менее 99,9%;
- ацетонитрил () массовой долей основного вещества не менее 99,8%;
- метилен хлористый () массовой долей основного вещества не менее 99,8%;
- н-гексан () массовой долей основного вещества не менее 99%;
- этилацетан () массовой долей основного вещества не менее 99% или по ГОСТ 8981 ;
- пропанол-2 () массовой долей основного вещества не менее 99%;
- эфир петролейный, перегнанный при температуре (50±10) °С, очищенный от перекисей;
- эфир диэтиловый, очищенный от перекисей, содержащий 0,1% пирогаллола, по ;
- калия гидроокись (КОН) по ГОСТ 24363 , х.ч. или ч.д.а., раствор КОН массовой долей 50%;
- натрий сернокислый () безводный массовой долей основного вещества не менее 99,5% или по ГОСТ 4166 , х.ч.;
- воду дистиллированную по ГОСТ 6709 ;
- кислоту аскорбиновую () по или , х.ч.;
- гидрохинон () массовой долей основного вещества не менее 99% или по ГОСТ 19627 ;
- пирогаллол () массовой долей основного вещества не менее 99%;
- бутилгидрокситолуол () массовой долей основного вещества не менее 99%;
- ретинол ()=286,5 г/моль, массовой долей основного вещества не менее 90%;
- ретинола ацетат ()=328,5 г/моль, массовой долей основного вещества не менее 90% или по ;
- ретинола пальмитат ()=524,9 г/моль, массовой долей основного вещества не менее 90% или по .
7.3 Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.
8 Подготовка к выполнению измерений
8.1 Приготовление растворов
8.1.1 Основные стандартные растворы
Растворяют около 50 мг ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата) в 50 см абсолютного этилового спирта. Массовая концентрация ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата) в растворе составляет примерно 1,0 мг/см. Далее 2 см раствора ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата) с помощью пипетки помещают в мерную колбу объемом 50 см и доводят до метки спиртом этиловым абсолютным. Массовая концентрация соединений в полученных основных стандартных растворах составляет примерно 40 мкг/см.
8.1.2 Градуировочные растворы
Из основных стандартных растворов готовят не менее четырех градуировочных растворов ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата) в диапазоне массовых концентраций 0,4-4,0 мкг/см путем точного разведения основных стандартных растворов спиртом этиловым абсолютным в мерной колбе вместимостью 50 см.
Определение массовой концентрации ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата), (мкг/см) проводят после измерения оптической плотности градуировочных растворов в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см на спектрофотометре при оптимальной длине волны и вычисляют по формуле
где - значение оптической плотности градуировочного раствора;
- значение оптической плотности градуировочного раствора в абсолютном этиловом спирте или 2-пропаноле массовой концентрации 1 г в 100 см при толщине поглощающего слоя 1 см, приведенное в таблице 1;
10 - коэффициент пересчета;
- коэффициент, учитывающий поглощение сопутствующих компонентов при измерении , вычисляемый по формуле
где - площадь пика стандартного вещества при проведении ВЭЖХ анализа, mAU·с (AU·с);
- сумма площадей пиков сопутствующих компонентов при проведении ВЭЖХ анализа стандартного вещества, mAU·с (AU·с).
Все растворы в ходе приготовления и анализа тщательно защищают от воздействия ультрафиолетового излучения. Растворы ретинола хранят при температуре ниже 4 °С в течение 2 мес. Свежеприготовленные растворы ретинола ацетата или ретинола пальмитата используют для измерений в течение 2-3 ч при комнатной температуре.
8.2 Отбор и подготовка проб
8.2.1 Отбор проб проводят по ГОСТ 13496.0 , ГОСТ 26809 , ГОСТ Р 52062 , ГОСТ Р 52179 .
8.2.2 Крупные частицы средней пробы, выделенной методом квартования из лабораторной пробы, измельчают с использованием подходящего оборудования (например, лабораторной мельницы) до такого состояния, чтобы весь продукт проходил через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Размолотую пробу тщательно перемешивают.
Анализируемые пробы гомогенизируют, избегая воздействия повышенной температуры.
8.2.3 Пищевые продукты на масложировой основе с массовой долей воды 1% и менее, обогащенные ацетатом ретинола или пальмитатом ретинола
2-5 г анализируемой пробы переносят в мерную колбу вместимостью 25 см, растворяют в 10-15 см н-гексана, используя ультразвуковую баню для ускорения растворения. Раствор доводят до метки н-гексаном. При необходимости раствор можно использовать для последующего разведения н-гексаном. Затем аликвоту гексанового раствора упаривают в токе азота и сухой остаток перерастворяют в элюенте.
8.2.4 Пищевые продукты на масложировой основе с массовой долей воды не более 20%, обогащенные ацетатом ретинола или пальмитатом ретинола
2-5 г анализируемой пробы растворяют при интенсивном перемешивании в 10-15 см н-гексана, используя ультразвуковую баню для ускорения растворения. Удаляют избыток воды добавлением безводного сульфата натрия. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр для отделения нерастворившегося осадка. Колбу промывают дважды 5 см н-гексана. Фильтраты собирают в мерную колбу вместимостью 25 см. Раствор доводят до метки н-гексаном. Затем аликвоту гексанового раствора упаривают в токе азота и сухой остаток перерастворяют в элюенте.
8.2.5 Другие пищевые продукты, обогащенные ацетатом ретинола или пальмитатом ретинола
Для проведения щелочного гидролиза 1-30 г анализируемой пробы сухого или жидкого материала помещают в круглодонную колбу вместимостью 100-500 см. К сухому материалу добавляют 5-20 см воды и нагревают на водяной бане при температуре 60 °С - 70 °С при перемешивании в течение 5 мин. Затем прибавляют 50-150 см этилового ректификованного спирта (или метилового спирта), 0,2-1,0 г антиоксиданта (аскорбиновой кислоты, гидрохинона, бутилгидрокситолуола), 4-40 см 50%-ного раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 15-45 мин на водяной бане с обратным холодильником при температуре 80 °С-100 °С.
Рекомендуемые соотношения испытуемого материала и реактивов приведены в таблице 2.
Таблица 2 - Рекомендуемые соотношения испытуемого материала и реактивов
Массовая доля витамина А, млн | Навеска испытуемого материала, г | Объем этанола, см | Объем 50%-ного раствора KОН, см |
От 0,1-1,0 включ. | |||
Св. 1,0-5,0 включ. | |||
Св. 5,0-10,0 включ. |
При проведении щелочного гидролиза при комнатной температуре в течение не менее 16 ч используют вышеуказанные соотношения материала и реактивов.
Если после охлаждения на поверхности смеси остается слой масла или жира, то объем добавленного раствора KОН и время проведения щелочного гидролиза увеличивают.
После окончания гидролиза содержимое колбы быстро охлаждают до (20±5) °С и количественно переносят в делительную воронку. Колбу ополаскивают водой, объем которой равен объему добавленного этилового спирта (или метилового), и воду сливают в ту же воронку. Витамин А экстрагируют диэтиловым (или петролейным) эфиром, н-гексаном, н-гексаном с добавкой диэтилового (или петролейного) эфира в объемном соотношении 1:1 в течение двух минут. Для учета возможной неполной экстракции витамина А следует использовать метод добавок стандартов.
Экстракцию повторяют три-четыре раза порциями экстрагента 50-100 см. Объединенный экстракт отмывают от щелочи три-четыре раза порциями воды 50-150 см до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по универсальной индикаторной бумаге).
Для удаления воды экстракт фильтруют через фильтр с 2-5 г безводного сульфата натрия. Далее экстракт упаривают досуха, используя роторный испаритель при температуре не выше 50 °С и затем перерастворяют в элюенте. При необходимости раствор можно использовать для последующего разведения.
Раствор, полученный по 8.2.3 (8.2.4, 8.2.5), анализируют методом ВЭЖХ. Массу анализируемой пробы и объем растворителя подбирают таким образом, чтобы концентрация определяемых веществ в анализируемом растворе находилась в диапазоне от 0,4 до 4,0 мкг/см.
8.3 Подготовка жидкостного хроматографа
Подготовку жидкостного хроматографа к работе осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации оборудования. Перед началом работы колонку промывают элюентом.
8.4 Построение градуировочной зависимости
Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования. Проводят хроматографический анализ всех градуировочных растворов, приготовленных по 8.1.2.
Градуировочный график строят в координатах "аналитический сигнал" - "массовая концентрация витамина в градуировочном растворе, мкг/см". Для каждого анализируемого градуировочного раствора проводят два параллельных измерения и находят среднеарифметическое значение. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и значениями времени удерживания не должно превышать 5% от средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соответствовать всему диапазону определяемых массовых концентраций витамина А.
Коэффициент градуировочного графика , мкг/см/(mAU·с) или мкг/см/(AU·с) определяют как среднеарифметическое значение коэффициентов , вычисляемых по формуле
где - массовая концентрация стандартных веществ в -м градуировочном растворе, мкг/см;
- площадь (высота) аналитического сигнала при анализе -го градуировочного раствора, mAU·с (AU·с) или высота пика, мм.
Правильность построения градуировочной зависимости контролируется значением достоверной аппроксимации 0,997.
Градуировка проводится в следующих случаях: на этапе освоения метода, при изменении условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.
9 Выполнение измерений
В колонку хроматографа последовательно вводят равные объемы испытуемого и градуировочного растворов. В качестве градуировочного выбирают раствор, высота пика которого наименее отличается от высоты пика испытуемого раствора. Концентрацию витамина А () в растворе, используемом для градуировки, уточняют в день его использования по 8.1.2.
Для идентификации пиков сопоставляют время удерживания ретинола (или ретинола ацетата или ретинола пальмитата) испытуемого раствора и раствора стандарта, а также добавляют к испытуемому раствору раствор стандарта с близким содержанием витамина А.
10 Обработка и оформление результатов
Массовую долю витамина А , млн, вычисляют по формулам:
где - коэффициент градуировочного графика по 8.4;
- объем разведения, см;
- масса анализируемой пробы, г.
С использованием градуировочного раствора
где - массовая концентрация градуировочного раствора, мкг/см;
- объем разведения, см;
- среднеарифметическое значение результатов измерений площади (высоты) пика анализируемого компонента для двух параллельных хроматографических анализов испытуемого раствора, mAU·с (AU·с) или высота пика, мм;
- масса анализируемой пробы, г;
- среднеарифметическое значение результатов измерений площади (высоты) пика анализируемого компонента для двух параллельных хроматографических анализов градуировочного раствора, mAU·с (AU·с) или высота пика, мм.
Результат вычисляют до третьего десятичного знака и округляют до второго десятичного знака.
При анализе каждой пробы выполняют два параллельных определения, начиная со взятия навески испытуемой пробы.
Расхождение между результатами двух параллельных измерений , (в процентах от среднего значения ), выполненными одним оператором с использованием идентичных реактивов и оборудования и в минимально возможный промежуток времени, не должно превышать (предел повторяемости приведен в таблице 3) с доверительной вероятностью 95%.
При соблюдении этого условия за окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение .
Границы относительной погрешности определения массовой доли витамина А (), в процентах от результата испытания, и при доверительной вероятности 95% не должны превышать значений, указанных в таблице 3.
Результат определения витамина А представляют в следующем виде:
Млн при 95%, (6)
где - среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, млн;
- значение границы абсолютной погрешности определений, млн, вычисляемое по формуле
Результаты испытаний заносят в протокол, в котором указывают:
- ссылку на настоящий стандарт;
- вид, происхождение и название пробы;
- способ и дату отбора пробы;
- дату поступления и испытания пробы;
- результаты исследования;
- причины отклонений в процедуре определения от установленных условий.
Биохимический показатель обеспеченности витамином – концентрация витамина или его метаболита (коферментной формы) в биологических жидкостях, величина экскреции с мочой, активность витаминзависимых ферментов и др.
Критерий адекватной обеспеченности витамином (нижняя граница нормы) – конкретная величина каждого показателя, относительно которой оценивают обеспеченность организма витамином.
Для количественного определения витаминов используют методы:
1. Физико-химические методы определения содержания витаминов как химических веществ (нг, мкг, мг).
2. Микробиологические методы – по скорости роста микроорганизмов в присутствии витамина судят об его количестве.
3. Биологические методы – определяют минимальное количество пищи или лекарственного препарата, способное предохранить животное (находящееся на диете, в которой отсутствует изучаемый витамин) от заболевания. Это количество пищи или витаминного препарата принимают за витаминную единицу.
Эффективность витаминизации оценивают, определяя показатели витаминной обеспеченности до и после приема витаминов.
Жирорастворимые витамины
К жирорастворимым витаминам относят витамины А, Д, Е, К.
Витамин А (ретинол, антиксерофтальмический)
1. Структура. Витамин А является полиизопреноидом , содержащим циклогексенильное кольцо . В группу витамина А входят ретинол, ретиналь и ретиноевая кислота . Только ретинол обладает полной функцией витамина А. Термин «ретиноиды» включает природные и синтетические формы ретинола. Растительный предшественник β-каротин обладает 1/6 активности витамина А.
2. Транспорт и метаболизм. Эфиры ретинола растворяются в жирах пищи, эмульгируются желчными кислотами и всасываются кишечным эпителием. Всосавшийся b-каротин расщепляется на две молекулы ретиналя . В клетках эпителия ретиналь восстанавливается в ретинол и небольшая часть ретиналя окисляется в ретиноевую кислоту. Большая часть ретинола эстерифицируется насыщенными жирными кислотами и в составе хиломикронов поступает через лимфу в кровь. После липолитической трансформации ремнанты хиломикронов захватываются печенью. В печени витамин А запасается в виде эфиров. Для транспорта к периферическим тканям эфиры ретинола гидролизуются и свободный ретинол связывается в сыворотке крови с плазменным ретинолсвязывающим протеином (ПРСП). Ретиноевая кислота транспортируется альбуминами . Внутри периферических клеток ретинол связывается с клеточным ретинолсвязывающим протеином (КРСП). Токсическое действие витамина А проявляется при появлении свободной формы витамина, т.е. после исчерпания мощности КРСП. Ретинол и ретиналь взаимопревращаются друг в друга с помощью НАДФ-зависимых дегидрогеназ или редуктаз. Ретиноевая кислота не может превращаться в ретинол или ретиналь, поэтому ретиноевая кислота может поддерживать рост и дифференцировку тканей, но не может заменить ретиналь в зрении или ретинол в функционировании репродуктивных органов.
Ретиналь
 |
Ретиноевая кислота
3. Биологическая роль.
3.1. Ретинол действует подобно гормонам, проникающим в клетку, – связывается с ядерными белками и регулирует экспрессию определенных генов. Ретинол необходим для осуществления нормальной репродуктивной функции.
3.2. Ретиналь участвует в акте зрения . 11-цис-ретиналь связан с белком опсином и образует родопсин. На свету родопсин диссоциирует и цис-ретиналь переходит в транс-ретиналь. Реакция сопровождается конформационными изменениями мембран палочек и открытием кальциевых каналов. Быстрый вход ионов кальция инициирует нервный импульс, который передается в зрительный анализатор. Для повторного восприятия (т.е. в темноте) транс-ретиналь восстанавливается алкогольдегидрогеназой в транс-ретинол (здесь возможны потери витамина А). Транс-ретинол изомеризуется в цис-ретинол (здесь возможно восполнение убыли витамина А). Цис-ретинол окисляется в цис-ретиналь, который, соединяясь с опсином, образует родопсин. Система светоощущения готова к восприятию следующего кванта света.
3.3. Ретиноевая кислота участвует в синтезе гликопротеинов , усиливает рост и дифференцировку тканей .
3.4. Ретиноиды обладают антиопухолеввой активностью и ослабляют действие канцерогенов .
3.5. b-каротин – антиоксидант и способен обезвреживать пероксидные свободные радикалы (ROO ·) в тканях с низким парциальным давлением кислорода.
4. Источники. Витамин А содержится только в продуктах животного происхождения (печень, почки, сливочное масло, рыбий жир). Из печени пресноводных рыб выделен витамин А 2 , который отличается наличием еще одной двойной связи в 3-4 положении и называется 3-дегидроретинол. Биологическая активность витамина А 2 для млекопитающих соответствует примерно 40% активности витамина А 1 . В растениях есть пигменты – a-, b- и g-каротины, которые могут превращаться в витамин А (морковь, томаты).
5. Суточная потребность . 1-2,5 мг витамина А (5000-7000 МЕ). 1 МЕ = 0,344 мкг ретинолацетата. Частично потребность в витамине А может покрываться за счет каротина (2-5 мг), причем 1 мг каротина = 0,67 мг ретинола.
6. Гиповитаминоз. Проявляется в виде нарушения зрения при слабом освещении -куриной слепоты – гемералопия . Это наиболее ранний признак недостаточности витамина А: человек нормально видит при дневном освещении и очень плохо различает предметы при скудном освещении (в сумерках). Авитаминоз характеризуется падением массы тела, остановкой роста, пролиферацией и ороговеванием эпителия, сухости кожи и слизистых, слущиванием эпителия, нарушением репродуктивной функции. Сухость роговицы глаза называется ксерофтальмия (отсюда название витамина – антиксерофтальмический). Повреждение эпителия мочевых путей, кишечника приводит к развитию воспалительных заболеваний. Важнейшей причиной недостаточности витамина А являются нарушения всасывания и транспорта липидов. При введении высоких доз витамина А развивается гипервитаминоз А.
Витамин D (кальциферол, антирахитический)
1. Структура. В растительных продуктах содержится эргостерол, который при действии ультрафиолетовых лучей превращается в витамин D 2 (эргокальциферол). В животных тканях распространен 7-дегидрохолестерол , который в коже при облучении ультрафиолетовыми лучами превращается в витамин D 3 (холекальциферол ) (рис. 27.1).
2. Метаболизм. Витамин D пищи всасывается в составе мицелл. В крови транспортируется в связи со специфическим транспортным глобулином. В гепатоцитах гидроксилируется в 25-гидроксихолекальциферол (25-ОН- D 3) . Это главная резервная в печени и транспортная в крови форма витамина D. Часть 25-ОН-D 3 участвует в энтеро-печеночной циркуляции (как желчные кислоты). При ее нарушении может возникать дефицит витамина D. В почках, плаценте и костях 25-ОН- D 3 может гидроксилироваться в положении 1 с образованием 1,25-дигидроксихолекальциферола или кальцитриола . Продукция кальцитриола регулируется собственной концентрацией, паратгормоном и сывороточными фосфатами.
3. Биологическая роль. Кальцитриол функционирует подобно проникающим гормонам. Кальцитриол – единственный регулятор перемещения кальция через мембрану энтероцитов против градиента концентрации. Кальцитриол стимулирует биосинтез в энтероцитах кальций-связывающего белка, что обеспечивает всасывание кальция и фосфатов в тонком кишечнике. Витамин D 3 усиливает реабсорбцию фосфатов в почечных канальцах, что способствует поддержанию нормального соотношения Са 2+ и НРО 4 3- в плазме и внеклеточных жидкостях. Это необходимо для кальцификации молодой растущей костной ткани.
Рис. 10.1. Схема образования витамина D и его активной формы кальцитриола.
Подписи: 7-Дегидрохолестерол; Ультрафиолетовые лучи; Провитамин D 3 ; Витамин D 3 (Холекальциферол); Кальцитриол (1,25-дигидроксихолекальциферол)
4. Источники : рыбий жир, печень рыб и животных, сливочное масло, яичный желток, молоко.
5. Суточная потребность. Потребность в витамине D зависит от возраста и состояния организма и составляет 12-25 мкг (500-1000 МЕ) в сутки (1 мкг=40 МЕ).
6. Гиповитаминоз. При недостатке витамина D у детей развивается заболевание рахит : нарушение минерализации костей, позднее развитие зубов, гипотония мышц. При недостатке витамина D у взрослых развивается остеопороз . Для профилактики D-гиповитаминоза используют ультрафиолетовое облучение кожи и пищи. При передозировке витамина D (в дозах, превышающих лечебные в 2-3 тысячи раз 1 500 000 МЕ) развивается гипервитаминоз : у детей остановка роста, рвота, исхудание, повышение артериального давления, возбуждение с переходом в ступор. В основе – гиперкальциемия и кальцификация внутренних оранов.
Витамин Е (токоферол, антистерильный)
1. Структура. К витамину Е относится группа соединений – производных токола, обладающих витаминной активностью. Известно 8 видов токоферолов – α, β, γ, δ и т.д. Наибольшей активностью обладает a-токоферол (5,7,8-триметилтокол).
2. Транспорт и метаболизм. Витамин Е не метаболизируется в организме. Нарушение всасывания липидов может приводить к дефициту токоферола, поскольку токоферол растворяется в жирах пищи, высвобождается и всасывается во время их переваривания. Токоферол всасывается в кишечнике и в составе хиломикронов через лимфу поступает в кровь. Токоферол попадает в ткани, в капиллярах которых хиломикроны подвергались действию липопротеинлипазы, а в печень витамин Е поступает в составе ремнантов хиломикронов. Токоферол транспортируется из печени к периферическим тканям в составе ЛПОНП. Депонируется витамин в жировой ткани, печени и мышцах .
3. Биологическая роль.
3.1. Витамин Е накапливается в мембранах клеток и действует как антиоксидант , прерывая цепи свободно-радикальных реакций. Антистерильный эффект связан с антиоксидантным действием витамина Е, когда он, препятствуя пероксидному повреждению мембран, обеспечивает нормальный контакт между клетками (предотвращает преждевременное отделение сперматогоний при созревании сперматозоидов или обеспечивает имплантацию оплодотворенной яйцеклетки в слизистую матки).
В отличие от других витаминов, витамин Е повторно не используется и после своего действия должен заменяться новыми молекулами токоферола.
Антиоксидантное действие токоферола эффективно при высокой концентрации кислорода , поэтому он находится в мембранах клеток с высоким парциальным давлением кислорода (мембраны эритроцитов, клеток респираторных органов). Потребность в витамине Е повышается при увеличении потребления ненасыщенных жирных кислот.
3.2. Витамин Е и селен (Se) действуют как синергисты. Se входит в состав глютатионпероксидазы, которая обеспечивает обезвреживание пероксидных радикалов. Se необходим для нормального функционирования поджелудочной железы. При нарушении ее функции нарушается переваривание и всасывание липидов и вторично витамина Е.
3.3. Витамин Е может участвовать в функционировании SH-содержащих ферментов , влиять на биосинтез КоQ, участвовать в механизмах переноса электронов по дыхательной цепи митохондрий
4. Источником витамина Е для человека являются растительные масла, а также зерновые продукты, ягоды шиповника, салат, капуста.
5. Суточная потребность. 20-30 мг.
6. Дефицит витамина Е. При дефиците витамина Е нарушается образование сперматозоидов у мужчин и развитие плода у женщин. Отмечаются дегенеративные изменения клеток репродуктивных органов, мышечная дистрофия, дегенеративные изменения клеток спинного мозга, жировое перерождение печени, дислипопротеинемии. У новорожденных может развиваться анемия, поэтому витамин Е необходимо добавлять к пище беременных и кормящих грудным молоком женщин. Анемия развивается из-за уменьшения продукции гемоглобина и сокращения продолжительности жизни эритроцитов. При нарушении переваривания и всасывания липидов развивается гиповитаминоз Е, ведущий к неврологическим заболеваниям.
Витамин К (филлохинон, антигеморрагический)
1. Структура. Три соединения обладают биологической активностью витамина К. Витамин К 1 (филлохинон) является производным 2-метил-1,4-нафтохинона, содержащий в положении 3 боковую цепь (фитол). Выделен из люцерны. Витамин К 2 (менахинон) выделен из гниющей рыбной муки. Синтезируется кишечной микрофлорой. Отличается от витамина К 1 строением боковой цепи, представленной фарнезилдигеранилом. Витамин К 3 (менадион, синтетический) не имеет боковой цепи в положении 3. На его основе А.Б.Палладин синтезировал водорастворимый препарат викасол (натриевая соль бисульфитного производного 2-метил-1,4-нафтохинона).
2. Транспорт и метаболизм. Для всасывания природных витаминов группы К (нафтахинонов) требуются желчные кислоты. В кровь они поступают в составе хиломикронов через лимфу. Викасол может всасываться без желчных кислот и прямо поступает в воротную вену и печень. Витамин К вначале аккумулируется в печени, но быстро расходуется.
3. Биологическая роль.
3.1. Витамин К стимулирует биосинтез в печени четырех белковых факторов свертывания крови (II-протромбин; VII-проконвертин; IX-фактор Кристмаса, или антигемофильный глобулин В; Х-фактор Стюарта-Прауэра).
3.2. Витамин К действует как кофактор карбоксилазы на этапе посттрансляционной модификации глутаминовых остатков протромбина . Протромбин содержит 10 таких остатков, которые карбоксилируются витамин К-зависимой карбоксилазой. Образуется γ-карбоксиглутамат, который затем хелатируется кальцием, что важно для свертывания крови.
3.3. Реакция карбоксилирования требует СО 2 и восстановленной (гидрохиноидной) формы витамина К. В эндоплазматическом ретикулуме есть цикл восстановления продукта карбоксилазной реакции витамина К (т.е. хиноидной формы в гидрохиноидную). Центральное место занимают две редуктазные реакции (в первой используются дитиоловый восстановитель, во второй – НАДФ-зависимая редуктаза).
3.4. Описано участие витамина К в окислительном фосфорилировании, его многостороннее анаболическое действие, функционирование в составе мембран.
5. Основной источник витамина К – микрофлора кишечника. Возможно поступление нафтохинонов с пищей (шпинат, тыква, капуста, ягоды рябины, печень животных).
6. Суточная потребность. Суточная потребность условно выражается 0,2-0,3 мг.
7. Дефицит витамина К . При нормальной микрофлоре кишечника у взрослых дефицита витамина К не бывает. Основная причина гиповитаминоза К – это стерилизация кишечника антибиотиками и сульфаниламидными препаратами. У новорожденных возможен дефицит витамина К, так как плацента его не пропускает, а кишечник стерилен. После родов содержание витамина К в плазме падает, но после еды восстанавливается. Если уровень протромбина низкий, возможно развитие геморрагического синдрома. Гиповитаминоз К бывает при мальабсорбции, дисфункции гепато-билиарной и панкреатической систем, при атрофии слизистой кишечника. Основные проявления гиповитаминоза К связаны с нарушением внутрисосудистого свертывания крови и кровоточивостью.
Водорастворимые витамины
К водорастворимым витаминам относят витамины группы В, С, Р, Н.
н С (аскорбиновая кислота, антискорбутный витамин)
1. Структура. Витамин С по структуре представляет собой g-лактон, имеющий 2 ассиметричных атома углерода. Биологически активной является L-форма аскорбиновой кислоты.
Аскорбиновая кислота Дегидроаскорбиновая кислота
Кислые свойства аскорбиновой кислоты обусловлены наличием 2-х енольных гидроксильных групп. L-аскорбиновая кислота обратимо подвергается окислению с образованием дегидроаскорбиновой кислоты под действием фермента аскорбатоксидазы . Восстановление дегидроаскорбиновой кислоты в аскорбиновую осуществляется с участием редуктазы и восстановленного глутатиона. Аскорбиновая и дегидроаскорбиновая кислоты являются биологически активными формами витамина . При гидратации в присутствии кислорода дегидроаскорбиновая кислота необратимо окисляется в 2,3-дикетогулоновую кислоту, которая не обладает биологической активностью и распадается до щавелевой и треоновой кислот. Скорость разрушения витамина возрастает с повышением температуры, в щелочной среде, под действием УФ-лучей, в присутствии солей тяжелых металлов (например, меди). Аскорбиновая кислота разрушается в процессе приготовления пищи и хранения продуктов.
2. Метаболизм. Аскорбиновая кислота всасывается путем простой диффузии на всем протяжении желудочно-кишечного тракта, но преимущественно в тонком кишечнике. В организме не накапливается.
3. Биологическая роль.
3.1. Окислительно-восстановительные реакции . Аскорбиновая кислота является сильным восстановителем с окислительно-восстановительным потенциалом +0,08 В и участвует в восстановлении молекулярного кислорода, нитратов и цитохромов а и с .
3.2.Витамин С участвует в гидроксилировании остатков пролина и лизина в процессе биосинтеза коллагена. ОН-группы гидроксипролина необходимы для стабилизации структуры коллагена, формируя водородные связи между цепями триплетной спирали зрелого коллагена. Гидроксилизин в коллагене служит для образования участков связывания с полисахаридами. Витамин С необходим для формирования костной ткани, поскольку основными компонентами костной ткани являются органический матрикс, коллаген, неорганический кальций и фосфаты.
3.3.Витамин С участвует в метаболизме тирозина . При синтезе катехоламинов норадреналина и адреналина из тирозина в надпочечниках и центральной нервной системе происходит окисление Cu + в Cu 2+ ; для обратного процесса восстановления меди необходима аскорбиновая кислота. Кроме того, аскорбиновая кислота требуется для окисления p-гидроксифенилпирувата в гомогентизиновую кислоту.
3.4.Витамин С необходим для гидроксилирования триптофана в гидрокситриптофан при биосинтезе серотонина .
3.5. Витамин С участвует в биосинтезе желчных кислот из холестерола.
3.6. Синтез кортикостероидных гормонов . В коре надпочечников содержится высокая концентрация витамина С, особенно в период стресса. Предполагают, что витамин С необходим для синтеза кортикостероидов.
3.7. Метаболизм железа и гемоглобина . Аскорбиновая кислота повышает всасывание железа из кишечника путем его восстановления в Fe 2+ . Витамин С участвует в образовании ферритина и высвобождении железа из связи его с транспортным белком крови трансферрином. Витамин С способствует восстановлению метгемоглобина в гемоглобин и участвует в деградации гемоглобина до желчных пигментов.
3.8. Метаболизм фолиевой кислоты . Активной формой фолиевой кислоты является тетрагидрофолиевая кислота (ТГФК). Витамин С необходим для образования ТГФК. Вместе с ТГФК аскорбиновая кислота участвует в созревании эритроцитов.
3.9. Витамин С является водорастворимым антиоксидантом и защищает клетки от повреждения свободными радикалами. Антиоксидантная функция аскорбиновой кислоты объясняется ее способностью легко отдавать два атома водорода, используемых в реакциях обезвреживания свободных радикалов.
4. Источники. В организме человека, обезьян, морских свинок и некоторых птиц витамин С не синтезируется. Источником витамина С служит растительная пища. Особенно им богаты перец, черная смородина, укроп, петрушка, капуста, щавель, цитрусовые, земляника.
5. Суточная потребность 70-120 мг.
6. Гиповитаминоз. Проявляется повышенным утомлением, снижением аппетита, сниженной устойчивостью к простудным заболеваниям, кровоточивостью десен. Авитаминоз приводит к заболеванию цингой (скорбутом). Главными симптомами цинги являются нарушение проницаемости капилляров, обусловленное недостаточностью гидроксилирования пролина и лизина в коллагене, расшатывание и выпадение зубов, отеки и боли в суставах, поражение костей, нарушение заживления ран. Смерть обычно наступает от кровоизлияния в полость перикарда. При гиповитамизозе С развивается железодефицитная анемия из-за нарушения всасывания железа и использования его запасов при синтезе гемоглобина.
Витамин В 1 (тиамин, антиневритный витамин)
1. Структура. Витамин В 1 был первым витамином, выделенным в кристаллическом виде К.Функом в 1912 г. Позже был осуществлен его химический синтез. Свое название – тиамин – получил из-за наличия в составе его молекулы атома серы и аминогруппы. Тиамин состоит из 2-х гетероциклических колец – аминопиримидинового и тиазолового. Последнее содержит каталитически активную функциональную группу – карбанион (относительно кислый углерод между серой и азотом).
Тиамин устойчив в кислой среде и выдерживает нагревание до высокой температуры. В щелочной среде витамин быстро разрушается.
2. Транспорт и метаболизм. В желудочно-кишечном тракте различные формы витамина гидролизуются с образованием свободного тиамина. Большая часть тиамина всасывается в тонком кишечнике с помощью специального механизма активного транспорта, остальное количество расщепляется тиаминазой кишечных бактерий. С током крови всосавшийся тиамин попадает вначале в печень, где фосфорилируется, а затем переносится в другие органы и ткани.
тиаминпирофосфаткиназа
АТФ + тиамин тиаминпирофосфат + АМФ
Витамин В 1 присутствует в различных органах и тканях как в форме свободного тиамина, так и его фосфорных эфиров: тиаминмонофосфата, тиаминдифосфата и тиаминтрифосфата. Основной коферментной формой (60-80% от общего внутриклеточного) является тиаминдифосфат, или тиаминпирофосфат (ТДФ, или ТПФ). Роль тиаминмонофосфата и тиаминтрифосфата пока неизвестна. Возможно они и аденилированная форма тиаминтрифосфата участвуют в реакциях приспособительного характера, путем переключения метаболических потоков углеводов.
После распада коферментов свободный тиамин выделяется с мочой и определяется в виде тиохрома.
3. Биологическая роль
3.1. ТПФ является коферментом 3-х полиферментных комплексов, которые катализируют окислительное декарбоксилирование кетокислот:
- Пируватдегидрогеназный комплекс участвует в окислительном декарбоксилировании пирувата, что является одной из ключевых реакций в обмене углеводов. В результате этой реакции образуется ацетил-КоА, который включается в цикл трикарбоновых кислот, где окисляется до углекислоты и воды. Благодаря этой реакции создаются условия для полного окисления углеводов и утилизации всей заключенной в них энергии. Кроме того, образующийся ацетил-КоА служит источником для синтеза многих биологических продуктов: жирных кислот, холестерола, стероидных гормонов, кетоновых тел и т.д.
2-Оксоглуторатдегидрогеназный комплекс входит в состав ЦТК и катализирует окислительное декарбоксилирование 2-оксоглутарата с образованием сукцинил-КоА.
- Дегидрогеназа кетокислот с разветвленным углеродным радикалом участвует в метаболизме валина, изолейцина и лейцина.
3.2. ТПФ является коферментом транскетолазы – фермента пентозофосфатного пути окисления углеводов, основными продуктами которого являются НАДФН и рибоза.
3.3. Витамин В 1 принимает участие в синтезе ацетилхолина, катализируя в пируватдегидрогеназной реакции образование ацетил-КоА.
4. Источники. Довольно много витамина содержится в пшеничном хлебе из муки грубого помола, в оболочке семян хлебных злаков, в сое, фасоли, горохе, дрожжах. Из продуктов животного происхождения наиболее богаты тиамином печень, нежирная свинина, почки, мозг, яичный желток.
5. Суточная потребность составляет 2-3 мг.
6. Гиповитаминоз. Проявляется слабостью, снижением аппетита, тошнотой, нарушением периферической чувствительности, онемением пальцев, ощущением ползанья «мурашек», болями по ходу нервов . При авитаминозе развивается заболевание бери-бери , что в переводе с индийского означает овца, так как походка больного человека напоминает поступь овцы. У больных бери-бери концентрации пирувата и 2-оксоглутарата в крови выше, чем в норме. Низкая активность транскетолазы в эритроцитах является лабораторным критерием бери-бери. Характерно поражение сердечно-сосудистой и нервной систем. Особая чувствительность нервной ткани к недостатку тиамина объясняется тем, что коферментная форма этого витамина необходима нервным клеткам для усвоения глюкозы.
Витамин В 2 (рибофлавин)
1. Структура. Витамин В 2 отличается от других витаминов желтым цветом (flavus – желтый). Рибофлавин впервые был выделен из кисломолочной сыворотки. Молекула рибофлавина состоит из гетероциклического изоаллоксазинового ядра, к которому в 9-м положении присоединен спирт рибитол (производное D-рибозы). Термином флавины обозначаются многие производные изоаллоксазина, обладающие В 2 -витаминной активностью.
Биосинтез флавинов осуществляется растительными и многими бактериальными клетками, а также плесневыми грибками и дрожжами. Благодаря микробному биосинтезу рибофлавина в желудочно-кишечном тракте жвачные животные не нуждаются в этом витамине. У других животных и человека синтезированных в кишечнике флавинов недостаточно для предупреждения гиповитаминозов. Витамин В 2 хорошо растворим в воде, устойчив в кислой среде, но легко разрушается в нейтральной и щелочной, а также под действием видимого и УФ-света. Витамин В 2 легко подвергается обратимому восстановлению, присоединяя водород по месту двойных связей (1 и 10), превращаясь из оранжево-желтого раствора в бесцветную лейкоформу.
2. Метаболизм. В пище витамин В 2 находится преимущественно в составе своих коферментных форм, связанных с белками – флавопротеинов. Под влиянием пищеварительных ферментов витамин высвобождается и всасывается путем простой диффузии в тонком кишечнике. В клетках слизистой кишечника, крови, печени и других тканях рибофлавин фосфорилируется до флавинмононуклеотида (ФМН) и флавинадениндинуклеотида (ФАД).
3. Биологическая роль . Основное значение витамина В 2 состоит в том, что он входит в состав флавиновых коферментов – ФМН и ФАД. Различают два типа реакций, катализируемых флавопротеинами:
3.1. Простые дыхательные системы – это прямое окисление субстрата с участием кислорода, перенос на него атомов водорода с образованием Н 2 О 2 и выделением энергии в виде тепла: оксидазы L- и D-аминокислот, ксантиноксидаза (разрушение пуриновых азотистых оснований), альдегиддегидрогеназа (деградация альдегидов).
3.2. Участие в сложных дыхательных системах
ФАД во втором комплексе цепи переноса электронов во внутренней мембране митохондрий (сукцинатдегидрогеназа и ацил-КоА-дегидрогеназа - дегидрирование метаболита ЦТК сукцината и ацил-КоА при окислении жирных кислот);
- НАДН-дегидрогеназа (перенос протонов и электронов от НАДН+Н + матрикса на ФМН первого комплекса цепи переноса электронов во внутренней мембране митохондрий);
- дигидролипоилдегидрогеназа (ФАД – кофактор фермента окислительного декарбоксилирования α-кетокислот пирувата и 2-оксоглутарата).
4. Источники. Основными источниками рибофлавина являются печень, почки, желток куриного яйца, творог. В кислом молоке витамина содержится больше, чем в свежем. В растительных продуктах витамина В 2 мало (исключение – миндальные орехи). Частично дефицит рибофлавина восполняется кишечной микрофлорой.
5. Суточная потребность 2-3 мг.
6. Гиповитаминоз. Недостаток витамина В 2 , как и других витаминов, проявляется слабостью, повышенной утомляемостью, склонностью к простудным заболеваниям. К специфическим проявлениям недостаточности рибофлавина относятся воспалительные процессы в слизистых оболочках. Слизистая губ и полости рта становится сухой, язык приобретает ярко-красный цвет, в углах рта появляются трещины. Отмечается повышенное шелушение эпителия кожи, особенно на лице.
Витамин РР (никотиновая кислота, никотинамид, ниацин; антипеллагрический витамин)
1. Структура. Витамин РР выделен К.Эвельгеймом в 1937 г. Его введение предохраняло от заболевания пеллагра или излечивало ее. РР означает противопеллагрический (preventive pellagra).
Никотиновая кислота является пиридин-3-карбоновой кислотой, никотинамид – ее амидом. Оба соединения в организме легко превращаются друг в друга и поэтому обладают одинаковой витаминной активностью.
Витамин РР плохо растворим в воде, но хорошо в водных растворах щелочей.
2. Метаболизм. Поступающий с пищей витамин РР быстро всасывается в желудке и кишечнике в основном путем простой диффузии. С током крови никотиновая кислота попадает в печень и другие органы, несколько медленнее проникает в них никотинамид. В тканях оба соединения преимущественно используются для синтеза коферментных форм НАД + и НАДФ + . Часть никотинамидных коферментов синтезируется в организме животных из триптофана . Однако этот путь, в который вовлекается до 2% метаболического пула триптофана, значительно уступает по эффективности первому (т.е. из прямого витаминного предшественника).
3. Биологическая роль. Значение витамина РР определяется ролью коферментов НАД + и НАДФ + .
3.1. НАД + входит в состав дегидрогеназ, катализирующих окисительно-востановительные превращения пирувата, изоцитрата, 2-оксоглутарата, малата и др. Эти реакции чаще локализованы в митохондриях и служат для освобождения энергии в сопряженных митохондриальных цепях переноса протонов и электронов.
3.2.НАДФ + входит в состав дегидрогеназ (редуктаз ), которые чаще локализованы в цитозоле или эндоплазматическом ретикулуме и служат для восстановительных синтезов (НАДФ-зависимые дегидрогеназы пентозофосфатного пути, синтеза жирных кислот и холестерола, митохондриальные монооксигеназные системы для синтеза желчных кислот, кортикостероидных гормонов) и обезвреживания ксенобиотиков (микросомальное окисление, оксигеназы со смешанной функцией).
3.3. НАД + и НАДФ + - аллостерические регуляторы ферментов энергетического обмена.
4. Источники. Продукты животного (печень, мясо) и растительного происхождения (рис, хлеб, картофель). Молоко и яйца содержат следы ниацина, но в них содержится триптофан, что может компенсировать недостаточное поступление никотинамида с пищей.
5. Суточная потребность составляет 15-25 мг.
6. Гиповитаминоз. Характерным признаком недостаточности витамина РР является симптомокомплекс «три Д»: дерматит, диарея и деменция . В основе заболевания лежит нарушение пролиферативной активности и энергетики клеток. Дерматит чаще всего отмечается на открытых участках кожи, которая под действием солнечных лучей краснеет, покрывается пигментными пятнами (на лице в виде крыльев бабочки) и шелушится. Язык становится ярко-красным и болезненным, утолщается, на нем появляются трещины. Расстройство пищеварения проявляется тошнотой, отсутствием аппетита, болями в животе. Нарушается функция периферических нервов и центральной нервной системы.
Симптомы гиповитаминоза развиваются:
1. У лиц с недостатком белка в диете. Объясняется это тем, что животные белки содержат оптимальное количество аминокислоты триптофана, витамина В 6 и некоторые другие компоненты, необходимые для синтеза ниацина.
2. При постоянном питании маисом, где ниацин находится в связанной форме.
3. При постоянном питании сорго, зерна которого содержат высокую концентрацию лейцина – ингибитора ключевого фермента превращения триптофана в НАД + .
4. При дефиците витамина В 6 и его коферментной формы пиридоксальфосфата, необходимого для синтеза из триптофана коферментных форм витамина РР.
Пантотеновая кислота
Пантотеновая кислота широко распространена в природе, название от panthos – повсюду. Витамин открыт Р.Вильямсом в 1933 г., спустя десятилетие от уже был синтезирован химическим путем.
1.Структура . Пантотеновая кислота состоит из пантоевой кислоты (α,γ,-дигидрокси-β,β-диметилмасляная кислота) и β-аланина.
Пантотеновая кислота представляет собой вязкую светло-желтую жидкость, хорошо растворимую в воде. Она малоустойчива и легко гидролизуется по месту пептидной связи под действием слабых кислот и щелочей.
2. Метаболизм. Пантотеновая кислота с током крови поступает в ткани после всасывания на всем протяжении тонкого кишечника и в толстой кишке (в зависимости от концентрации путем простой диффузии или активного транспорта). Пантотеновая кислота фосфорилируется с использованием АТФ до 4’-фосфопантотената . Присоединение цистеина и его декарбоксилирование приводит к образованию тиоэтаноламина, из которого образуется 4’-фосфопантотеин – простетическая группа кофермента А (HS-КоА) и ацилпереносящего белка (АПБ).
3. Биологическая роль. Тиоловая группа в НS-КоА и АПБ действует как переносчик ацильных радикалов .
HS-КоА участвует в важнейших метаболических процессах:
а) в обмене углеводов – окислительное декарбоксилирование пирувата в ацетил-КоА и 2-оксоглутарата в сукцинил-КоА;
б) в β-окислении жирных кислот на этапах активации до образования ацил-КоА и тиолитическом расщеплении с выделением ацетил-КоА и укороченного на 2 углеродных атома ацил-КоА;
в) в форме ацетил-КоА переносится остаток ацетила на холин с образованием медиатора ацетилхолина;
г) сукцинил-КоА участвует в синтезе порфиринов;
д) в биосинтезе жирных кислот – функцию переносчика метаболитов в пальмитатсинтазном комплексе выполняет 4-фосфопантетеин;
ж) ацетил-КоА используется для синтеза кетоновых тел, холестерола и стероидных гормонов.
Ацетил-КоА занимает центральное место в процессах взаимосвязи обменов углеводов, аминокислот и жирных кислот.
4. Источники. Пантотеновая кислота широко распространена в продуктах животного (печень, почки, яйца, мясо, молоко и др.) и растительного (картофель, капуста, фрукты и др.) происхождения. Синтезируется кишечной микрофлорой.
5. Суточная потребность . 10-15 мг
6. Гиповитаминоз. В связи с широким распространением витамина в продуктах питания авитаминоз не встречается. Симптомы гиповитаминоза не специфичны: дерматиты, невриты, язвы слизистых пищеварительного тракта, нарушения продукции стероидных гормонов и др.
Витамин В 6 (пиридоксин, пиридоксол, антидерматитный витамин)
1. Структура . Витамин В 6 включает три природных производных пиридина, обладающих одинаковой витаминной активностью: пиридоксина, пиридоксаля, пиридоксамина, отличающихся друг от друга наличием соответственно спиртовой, альдегидной или аминогруппы. Витамин В 6 открыт в 1934 г. А.Сент-Дьердьи. Пиридоксин хорошо растворяется в воде и этаноле, устойчив в кислой и щелочной среде, но легко разрушается под действием света при рН 7,0.
2 Метаболизм. Всосавшись в тонком кишечнике, все формы витамина с током крови разносятся к тканям и, проникая в клетки, фосфорилируются с участием АТФ. Коферментные функции выполняют два фосфорилированных производных пиридоксина: пиридоксальфосфат и пиридоксаминфосфат .
3. Биологическая роль. Витамин В 6 характеризуется широким спектром биологического действия. Он принимает участие в регуляции белкового, углеводного и липидного обменов, биосинтезе гема и биогенных аминов, гормонов щитовидной железы и других биологически активных соединений. Коферментные формы витамина В 6 входят в состав следующих ферментов:
- Аминотрансфераз аминокислот , катализирующих обратимый перенос NH 2 -группы от аминокислоты на α-кетокислоту (образование заменимых аминокислот, непрямое дезаминирование и восстановительное аминирование аминокислот).
- Декарбоксилаз аминокислот , отщепляющих карбоксильную группу аминокислот, что приводит к образованию биогенных аминов.
- Ферментов, осуществляющих неокислительное дезаминирование серина, треонина, триптофана, серусодержащих аминокислот.
- Мышечной фосфорилазы (распад гликогена).
4. Источники. Витамином В 6 богаты бобовые, зерновые культуры, мясные продукты, рыба, картофель. Он синтезируется кишечной микрофлорой, частично покрывая потребность организма в этом витамине.
5. Суточная потребность. 2-3 мг
6. Гиповитаминоз . Основными проявлениями недостаточности витамина В 6 являются гипохромная анемия и судороги. Отмечается развитие сухого себорейного дерматита, стоматита и глоссита. Чаще всего пиридоксиновая недостаточность наблюдается:
а) у маленьких детей при искусственном вскармливании стерилизованным молоком (разрушается витамин В 6), у беременных при токсикозах;
б) при групповой недостаточности витаминов группы В;
в) при подавлении микрофлоры кишечника антибиотиками;
г) у алкоголиков, поскольку ацетальдегид стимулирует дефосфорилирование пиридоксальфосфата.
Витамин Н (биотин)
Биотин – это первое вещество, которое было определено как необходимый ростовой фактор для микроорганизмов. Позже было показано токсическое действие сырого яичного белка на крыс. Употребление печени или дрожжей снимало этот эффект. Фактор, предотвращающий развитие токсикоза, был назван витамином Н или биотином (от греч. bios – жизнь).
 |
Структура. Молекула биотина состоит из имидазольного и тиофенового колец и боковой цепи , представленной остатком валериановой кислоты . В пище биотин представлен биоцитином, который высвобождается путем протеолиза.
2.Метаболизм
2.1. Биотин не модифицируется в организме, но ковалентно связывается с ферментами, в которых выполняет функцию простетической группы.
2.2. Биотин связывается через свободную карбоксильную группу с остатком лизина апофермента. Комплекс биотин-фермент взаимодействует с СО 2 в присутствии АТФ (источник энергии) с образованием комплекса карбоксибиотин-фермент.
2.3. Биотинидаза катализирует удаление биотина от фермента во время метаболизма белков, что позволяет использовать биотин повторно.
3. Биологическая роль. Биотин действует как кофермент реакций карбоксилирования , в которых служит переносчиком СО 2 . В организме 4 фермента используют биотин как кофермент.
- Пируваткарбоксилаза. В результате карбоксилирования пирувата образуется оксалоацетат, который используется в глюконеогенезе и ЦТК.
- Ацетил-КоА-карбоксилаза катализирует карбоксилирование ацетил-КоА с образованием малонил-КоА. Реакция используется при биосинтезе высших жирных кислот.
- Пропионил-КоА-карбоксилаза превращает пропионил-КоА в D-метилмалонил-КоА, который превращается в сукцинат (вступает в ЦТК).
- β-метил-кротонил-КоА-карбоксилаза , участвующая в катаболизме лейцина и веществ, имеющих в составе изопреноидные структуры.
4. Источники. Биотин в достаточном количестве синтезируется микрофлорой кишечника. Пищевые источники: печень, сердце, яичный желток, отруби, бобы, соя, цветная капуста и др.
5. Суточная потребность. 150-200 мкг.
6. Дефицит. Причинами гиповитаминоза являются:
а)применение антибиотиков, которые подавляют рост кишечной микрофлоры;
б) поступление в организм большого количества авидина – гликопротеина присутствующего в белке куриных яиц, который нарушает всасывание биотина из-за образования нерастворимого комплекса;
в) длительное парэнтеральное питание;
г)наследственный дефект фермента, который присоединяет биотин к лизиновым остаткам апофермента.
Симптомы гиповитаминоза включают себорейный дерматит, тошноту, выпадение волос, боли в мышцах.
Фолиевая кислота (фолацин, витамин В 9 , витамин Вс)
Витамин обнаружили в 1930 г., когда было показано, что люди с определенным типом мегалобластической анемии могли быть излечены включением в пищу дрожжей или экстракта печени. В 1941 г. фолиевая кислота была выделена из зеленых листьев (лат. folium - лист, отсюда и название витамина). Витамином Вс это соединение назвали из-за его способности излечивать анемию у цыплят (от англ. chicken – цыпленок).
1. Структура. Фолиевая кислота состоит из птеридина, связанного с p-аминобензойной кислотой (ПАБК) и глутаминовой кислотой.
Фолиевая кислота плохо растворима в воде и органических растворителях, но хорошо в щелочных растворах. Разрушается под действием света, при обработке и консервировании овощей.
2. Метаболизм. Фолат в пище присутствует в форме полиглутамата. Внешние остатки глутамата удаляются в кишечнике до всасывания, главным образом, в тонком кишечнике. Коферментной формой фолиевой кислоты является 5,6,7,8-тетрагидрофолиевая кислота (ТГФК), которая образуется из фолиевой кислоты под действием фермента дигидрофолатредуктазы и с использованием НАДФН+Н + как донора атомов водорода.
3. Биологическая роль.
3.1. Фолиевая кислота является переносчиком одноуглеродных радикалов (групп): метильного (-СН 3), метиленового (=СН 2), метенильного (≡СН), формильного (-СНО), оксиметильного (-СН 2 ОН) и формиминового (-СН=NH). Одноуглеродные фрагменты связываются с ТГФК в положениях N 5 или N 10 . Присоединение формильного радикала в 5 положении приводит к образованию N 5 -формилТГФК, которая известна как фолиниковая кислота. МетиленТГФК образуется при взаимодействии ТГФК с глицином, серином или холином.
3.2. Фолат необходим для синтеза пуриновых нуклеотидов (2 и 8 атомы углерода) и синтеза тимина. N 5 ,N 10 -метиленТГФК вводит метильную группу при синтезе тимидилата, необходимого для синтеза ДНК и образования эритроцитов.
3.3. Участвует в метаболизме глицина, серина и этаноламина .
3.4. N-формилметионин является инициирующей аминокислотой в биосинтезе белка у прокариот.
3.5. В крови ТГФК присутствует как N 5 -метилТГФК. Витамин В 12 необходим для превращения N 5 -метилТГФК в ТГФК в реакции превращения гомоцистеина в метионин. Эта реакция необходима для освобождения свободной ТГФК и повторного использования в одноуглеродном метаболизме. При дефиците витамина В 12 блокируется превращение N 5 -метилТГФК в ТГФК («фолатная ловушка»).
4. Источники: кишечная микрофлора, свежие овощи – салат, капуста, морковь, помидоры, лук.
5. Суточная потребность : 50-200 мкг.
6. Дефицит. При дефиците ТГФК снижается синтез пуринов и тимина, что приводит к нарушению синтеза ДНК. Это проявляется развитием мегалобластической анемии , которая характеризуется появлением в крови незрелых ядросодержащих форм эритроцитов.
Витамин В 12 (кобаламин, антианемический витамин)
Злокачественная анемия (болезнь Аддисона-Бирмера) оставалась смертельным заболеванием до 1926 г., когда впервые для ее лечения применили сырую печень. Поиски содержащегося в печени антианемического фактора привели к успеху и в 1955 г. Дороти Ходжкин расшифровала структуру этого фактора и его пространственную конфигурацию с помощью метода рентгеноструктурного анализа.
1.Структура. Структура витамина В 12 отличается от строения всех других витаминов наличием в молекуле иона металла – кобальта. Кобальт связан координационными связями с атомами азота, входящими в состав четырех пиррольных колец, которые образуют планарную (плоскую структуру), называемую коррином. I, II, III пиррольные кольца связаны через метиленовые мостики, IV и I – непосредственно. Перпендикулярно плоскости коррина расположен нуклеотид, содержащий 5,6-диметилбензимидазол, α-D-рибозу и остаток фосфорной кислоты, который связан координационной связью с атомом кобальта (рис. 10.2). В пище кобаламин содержит атом кобальта в окисленной форме (III). Для образования активных коферментных форм атом кобальта восстанавливается до Со (I).
В витамине В 12 атомы углерода пиррольных колец замещены метильными, ацетамидными и пропионамидными радикалами. Пропионамидный радикал в IV кольце через изопропиловый спирт связан с фосфатным остатком нуклеотида.
Атом кобальта трехвалентен и ковалентно связан с группой CN - . Вся структура получила название цианокобаламина или кобаламина, поскольку считают, что цианид-ион является артефактом, зависящим от способа выделения.
Кобаламины растворимы в воде, термостабильны и устойчивы в присутствии растворов кислот при рН 4,0.
2. Транспорт и метаболизм
2.1. Витамин В 12 , содержащийся в пище, называют внешним фактором Кастла . Всасывается витамин в тонком кишечнике в комплексе с внутренним фактором Кастла (гликопротеин, секретируемый париетальными клетками желудка).
Витамин В 12 находится в пище в комплексе с белками. В желудке под действием соляной кислоты и пепсина витамин В 12 высвобождается из комплекса с белками и связывается с кобалофилином (R-протеин, гаптокоррин) – белком, секретируемым слюной. В двенадцатиперстной кишке комплекс распадается, кобалофилин гидролизуется панкреатическими протеазами, витамин В 12 связывается с внутренним фактором Кастла. Комплекс витамин В 12 -внутренний фактор Кастла всасывается в дистальной части подвздошной кишки через рецепторы (кубилины ), которые связывают комплекс, но не связывают свободный фактор или свободный витамин. Другой белок – мегалин – связан с кубилином и обеспечивает процесс эндоцитоза для всасывания комплекса
Рис. 10.2. Витамин В 12 .
2.2. Витамин транспортируется в крови в комплексе с белками, называемыми транскобаламинами и превращается в метилкобаламин и 5-дезоксиаденозилкобаламин в печени, клетках костного мозга и ретикулоцитах. Транскобаламин I участвует в хранении и резервировании водорастворимого витамина в печени и плазме крови (циркулирующий резерв). Транскобаламин II транспортирует витамин в крови. Комплекс транскобаламин II-витамин В 12 поступает в периферические клетки путем эндоцитоза. В лизосомах клеток транскобаламин II разрушается, витамин высвобождается в виде гидроксикобаламина, который либо превращается в цитозоле в метилкобаламин, либо в митохондриях – в 5-дезоксиаденозилкобаламин. В печени запасается около 4-5 мг витамина и этих запасов достаточно для обеспечения организма витамином в течение 4-6 лет.
3. Биологическая роль.
В организме человека витамин необходим для 2-х важнейших реакций:
3.1. 5-дезоксиаденозилкобаламин является коферментом метилмалонил-КоА-мутазы , который превращает метилмалонил-КоА в сукцинил-КоА. Метилмалонил-КоА образуется как промежуточный продукт катаболизма валина и карбоксилирования пропионил-КоА, синтезирующегося при катаболизме изолейцина, холестерола, жирных кислот с нечетным числом атомов углерода или прямо из пропионовой кислоты (продукт микробиологической ферментации в кишечнике). В результате этой реакции метилмалонил-КоА превращается в сукцинил-КоА.
3.2. Метилкобаламин является коферментом гомоцистеинметилтрансферазы – фермента, катализирующего метилирование гомоцистеина в метионин. Кобаламин забирает метильные группы от N 5 -метилтетрагидрофолиевой кислоты и превращает ее в тетрагидрофолат. Метаболическое значение этой реакции состоит в том, что сохраняются запасы метионина и тетрагидрофолата, что необходимо для синтеза пуриновых, пиримидиновых нуклеотидов и синтеза нуклеиновых кислот. При дефиците витамина В 12 фолат постоянно находится в форме N 5 -метил-ТГФК («фолатная» или метильная ловушка).
3.3. Витамин В 12 требуется для превращения D-рибонуклеотидов в дезокси-D-рибонуклеотиды. Эту реакцию у прокариот катализирует специфическая рибонуклеотидредуктаза.
4. Источники. Основным источником витамина являются микроорганизмы. В растительной пище витамин В 12 отсутствует. В небольших количествах витамин образуется бактериями на поверхности фруктов. Значительное количество витамина содержится в печени, дрожжах, молоке, яичном желтке.
5. Суточная потребность . 2-5 мкг.
6. Дефицит.
1. Энтеропеченочная циркуляция витамина В 12 обеспечивает организм достаточным количеством витамина, и дефицит может развиваться при отсутствии витамина в диете в течение нескольких лет. При заболеваниях желудка или подвздошной кишки дефицит витамина может развиваться быстрее.
2. Пернициозная анемия является следствием дефицита витамина В 12 и характеризуется нарушением синтеза ДНК, образования эритроцитов и появлением незрелых ядерных форм эритроцитов (мегалобластов).
3. Длительное вегетарианство может приводить к дефициту витамина В 12 .
Витаминоподобные вещества
Кроме витаминов, описанных выше, в пище присутствуют другие компоненты, которые являются незаменимыми факторами.
Холин
Best и Huntsman (1934) обнаружили, что дефицит холина у крыс вызывает жировое перерождение печени. Тем не менее, холин может адекватно синтезироваться в организме (из серина) и содержится во многих продуктах (молоко, яйца, печень, злаковые и др.).
1. Структура. По химическому строению холин – аминоэтиловый спирт, содержащий 3 метильные группы у атома азота.
2. Биологическая роль.
2.1. Является компонентом фосфолипидов (лецитины), которые являются компонентами мембран и участвуют в транспорте липидов.
2.2. Предотвращает накопление липидов в печени (липотропный фактор), что объясняется участием в синтезе фосфолипидов и липопротеинов, транспортирующих жиры из печени.
2.3. Участвует в метаболизме одноуглеродных радикалов из-за наличия в структуре трех метильных групп.
2.4. Предшественник для синтеза ацетилхолина, который участвует в передаче нервного импульса.
3. Пищевым источником являются мясо и злаковые растения. Суточная потребность составляет в среднем 0,5 г.
4. Недостаточность. Проявления недостаточности холина у человека не описаны. У животных отмечаются жировая инфильтрация печени, повреждение кровеносных сосудов.
Инозит
1. Структура. По химическому строению – шестиатомный циклический спирт циклогексана, хорошо растворимый в воде.
2. Биологическая роль.
2.1. Необходим для синтеза фосфатидилинозитола (компонент клеточных мембран).
2.2. Действует как липотропный фактор (вместе с холином) и предотвращает накопление жиров в печени.
2.3. Является посредником в действии некоторых гормонов (инозитол-1,4,5-трифосфат). Инозитолтрифосфат способствует высвобождению кальция из эндоплазматического ретикулума.
2.4. Высокая концентрация отмечена в сердечной мышце, хотя функция не известна.
3. . Инозитол находится во всех продуктах животного и растительного происхождения, особенно много его в печени, мозге, мясе, яичном желтке, а также в хлебе, картофеле, зеленом горохе, грибах. Суточная потребность приблизительно 1,0 -1,5 г.
4. Недостаточность инозитола у животных проявляется жировой дистрофией печени и падением содержания в ней фосфолипидов, облысением и анемией. У молодых особей наблюдается задержка роста
Липоевая кислота (витамин N)
1. Структура. В 1951 г. было выделено вещество, которое активно участвовало в обмене пирувата и ацетил-КоА – ключевых метаболитов клетки. Оно было названо липоевая кислота, так как хорошо растворялось в неполярных растворителях (lipid – жир). По химическому строению липоевая кислота является серосодержащей жирной кислотой (6,8-дитиооктановая кислота). Существует в окисленной и восстановленной формах.
2. Биологическая роль.
2.1. Участвует в реакциях окислительного декарбоксилирования вместе с другими витаминами (тиамин, ниацин, рибофлавин и пантотеновая кислота), в результате которых пируват превращается до ацетил-КоА и 2-оксоглутарат до сукцинил-КоА.
2.2. Является антиоксидантом и эффективна при защите организма от повреждающего действия радиации и токсинов.
3. Гипо- и гипервитаминозы липоевой кислоты у человека не описаны.
4. Суточная потребность. Источники . Наиболее богаты липоевой кислотой дрожжи, мясные продукты, молоко. Суточная потребность предположительно 1-2 мг.
Парааминобензойная кислота (ПАБК)
1. Структура. Является структурным компонентом фолиевой кислоты. Химическое строение ПАБК:
ПАКБ плохо растворяется в воде, хорошо – в спирте и эфире, химически устойчива.
2. Биологическая роль.
2.1. Витаминные свойства ПАБК связаны с тем, что она входит в состав молекулы фолиевой кислоты и, следовательно, принимает участие во всех реакциях метаболизма, где необходима фолиевая кислота.
2.2. Оказывает антигипоксическое, антиатерогенное действие, препятствует окислению адреналина, положительно влияет на функцию щитовидной железы.
3. Суточная потребность. Источники. ПАБК содержится практически во всех продуктах питания. Наиболее богаты ее печень, мясо, молоко, яйца, дрожжи. Суточная потребность не установлена.
Витамин Р (рутин, биофлавоноиды)
1. Структура. В 1936 г. А.Сент-Дьердьи из кожуры лимона выделил действующее начало, уменьшающее ломкость, проницаемость капилляров. Оно получило название витамин Р (от permeability – проницаемость).
Биофлавоноиды – разнообразная группа растительных полифенольных соединений, в основе структуры которых лежит дифенилпропановый углеродный скелет.
В растениях обнаружено свыше 4000 флавоноидов с идентифицированной химической структурой. Они делятся на 6 групп: флавонолы, флавоны, флавононы, катехины, антрагликозиды, антоцианы.
2. Биологическая роль.
2.1. Биофлавоноиды могут использоваться для синтеза биологически важных соединений в клетке (например, убихинона).
2.2. Рутин и кверцетин – полифенолы, обладающие Р-витаминной активностью, являются эффективными антиоксидантами . Флавоноиды (катехины) зеленого чая способны оказывать выраженное цитопротективное действие, в основе которого лежит их свойство обезвреживать свободные радикалы. В отличие от витамина Е, биофлавоноиды кроме прямого антирадикального действия могут также связывать ионы металлов с переменной валентностью, ингибируя, тем самым, процесс пероксидного окисления липидов мембран.
2.3. Достаточно изученным является капилляроукрепляющее действие витамина Р, обусловленное его способностью регулировать образование коллагена (синергизм с витамином С) и препятствовать деполимеризации основного вещества соединительной ткани гиалуронидазой.
3. Суточная потребность. Источники . Р-витаминные вещества содержатся в тех же растительных продуктах, что и витамин С. Наиболее богаты ими черноплодная рябина, черная смородина, яблоки, виноград, лимоны, чайный лист и плоды шиповника. Биофлавоноид цитрон придает кожуре лимона желтый цвет. Потребление флавоноидов в составе натуральных продуктов (фруктов, соков и виноградных вин), где они могут находиться в виде комплексов с металлами, может быть более эффективным, чем использование очищенных витаминных препаратов. Суточная потребность 25-50 мг.
4. Гиповитаминоз. Симптоматика недостаточности биофлавоноидов сводится к явлениям повышенной проницаемости и ломкости капилляров, петехиям (точечным ковоизлияниям), кровоточивости десен.
Витамин U
1. Структура. Витамин U был обнаружен в 1950 г. в сырых овощах. Поскольку сок сырых овощей, особенно капусты, обладал способностью предотвращать или задерживать развитие экспериментальных язв желудка, выделенный из него витамин назвали противоязвенным , или витамином U (от лат. ulcus – язва). По химическому строению он представляет собой S-метилметионин:
Витамин U хорошо растворим в воде. При варке пищи легко разрушается, особенно в нейтральной и щелочной среде.
2. Биологическая роль.
Подобно метионину витамин U является донором метильных групп в реакциях синтеза холина и креатина.
3. Недостаточность витамина у человека не описана. Цыплята, которым скармливался алкалоид цинкофен с целью моделирования язвы желудка, излечивались, если им в корм добавлялся свежий овощной сок.
4. Суточная потребность. Источники. Источниками витамина U являются свежая капуста, петрушка, морковь, лук, перец, зеленый чай, свежее молоко, печень.
Витамин F
В группу витамина F входят полиеновые жирные кислоты: линолевая, линоленовая, арахидоновая. При достаточном поступлении в организм линолевой и линоленовой кислот осуществляется синтез арахидоновой кислоты, являющейся предшественником эйкозаноидов (простагландинов, простациклинов, тромбоксанов и лейкотриенов). Одним из эффективных источников ω3 полиненасыщенных жирных кислот является льняное масло (α-линоленовая кислота – 52%). Для стабилизации ненасыщенных жирных кислот в масле присутствуют лигнаны, обладающие антиоксидантным и эстрогенным действиями.
Кофермент Q
В группу кофермента Q относят убихиноны. Убихинон Q 10 может синтезироваться на конечных стадиях синтеза холестерола. Поэтому при применении классических статинов (ингибиторов ГМГ-редуктазы) могут проявляться эффекты недостаточности кофермента Q. В настоящее время разработаны статины второго поколения, которые блокируют синтез холестерола ниже места ответвления синтеза кофермента Q.
Кофермент Q находится в мембранах, является переносчиком электронов в липидной фазе мембран (цепи переноса электронов). Недостаточность кофермента Q проявляется в виде гипоэнергетического состояния и сопряженных с этим разнообразных функциональных нарушений.
Кофермент Q входит в состав многих биологически активных добавок к пище с целью оптимизации пищевой поддержки метаболизма.
Похожая информация.
Незаменимые вещества пищи, объединяемые под общим названием «витамины», относятся к различным классам химических соединений, что само по себе исключает возможность использования единого метода их количественного определения. Все известные для витаминов аналитические методы основаны либо на определении специфических биологических свойств этих веществ (биологические, микробиологические, ферментативные), либо на использовании их физико-химических характеристик (флуоресцентные, хроматографические и спектрофотометрические методы), либо на способности некоторых витаминов вступать в реакции с некоторыми реагентами с образованием окрашенных соединений (колориметрические методы).
Несмотря на достигнутые успехи в области аналитической и прикладной химии методы определения витаминов в пищевых продуктах еще трудоемки и длительны. Это обусловлено рядом объективных причин, основные из которых следующие.
1.Определение ряда витаминов часто осложняется тем, что многие из них находятся в природе в связанном состоянии в виде комплексов с белками или пептидами, а также в виде фосфорных эфиров. Для количественного определения необходимо разрушить эти комплексы и выделить витамины в свободном виде, доступном для физико-химического или микробиологического анализа. Это достигается обычно путем использования особых условий обработки (кислотным, щелочным или ферментативным гидролизом, автоклавированием).
2.Почти все витамины – соединения весьма неустойчивые, легко подвергающиеся окислению, изомеризации и полному разрушению под воздействием высокой температуры, кислорода воздуха, света и других факторов. Следует соблюдать меры предосторожности: максимально сокращать время на предварительную подготовку продукта, избегать сильного нагрева и воздействия света, использовать антиоксиданты и др.
3.В пищевых продуктах, как правило, приходится иметь дело с группой соединений, имеющих большое химическое сходство и одновременно различающихся по биологической активности. Например, витамин Е включает 8 токоферолов, сходных по химическим свойствам, но отличающихся по биологическому действию; группа каротинов и каротиноидных пигментов насчитывает до 80 соединений, из которых только 10 в той или иной степени обладают витаминными свойствами.
4.Витамины принадлежат к различным классам органических соединений. Поэтому для них не могут существовать общие групповые реакции и общие методы исследования.
5.Кроме того, анализ затрудняет присутствие в исследуемом образце сопутствующих веществ, количество которых может во много раз превышать содержание определяемого витамина (например, стерины и витамин D). Для устранения возможных погрешностей при определении витаминов в пищевых продуктах обычно проводят тщательную очистку экстрактов от сопутствующих соединений и концентрирование витамина. Для этого используют различные приемы: осаждение мешающих анализу веществ, методы адсорбционной, ионобменной или распределительной хроматографии, избирательную экстракцию определяемого компонента и др.
В последние годы для определения витаминов в пищевых продуктах с успехом стали использовать метод ВЭЖХ. Этот метод является наиболее перспективным, так как позволяет одновременно разделять, идентифицировать и количественно определять различные витамины и их биологически активные формы, что позволяет сократить время анализа.
Физико-химические методы исследования витаминов. Методы основаны на использовании физико-химических характеристик витаминов (их способности к флуоресценции, светопоглощению, окислительно-восстановительным реакциям и др). Благодаря развитию аналитической химии, приборостроения физико-химические методы почти полностью вытеснили длительные и дорогостоящие биологические методы.
Определение витамина С. Витаминб С (аскорбиновая кислота) может присутствовать в пищевых продуктах как в восстановленной, так и в окисленной форме. Дегидроаскорбиновая кислота (ДАК) может образовываться при обработке и хранении пищевых продуктов в результате окисления, что вызывает необходимость ее определения. При определении витамина С в пищевых продуктах используют различные методы: колориметрические, флуоресцентные, методы объемного анализа, основанные на окислительно-восстановительных свойствах АК, и ВЭЖХ.
Ответственный момент количественного определения АК – приготовление экстракта образца. Извлечение должно быть полным. Наилучшим экстрагентом является 6% раствор метафосфорной кислоты, обладающей способностью осаждать белки. Используются также уксусная, щавелевая и соляная кислоты, а также их смеси.
1. Для суммарного и раздельного определения окисленной и восстановленной форм АК часто используют метод Роэ с применением 2,4-динитрофенилгидразинового реактива. АК (гулоновая кислота) под действием окислителей переходит в ДАК, а затем в 2,3-дикетогулоновую кислоту, которая образует с 2,4-динитрофенилгидразином соединения, имеющие оранжевую окраску. Сам 2,4-динитрофенилгидразин представляет собой основание, неспособное существовать в аци-форме. Однако соответствующие гидразоны под влиянием щелочей превращаются в интенсивно окрашенные аци-соли. При определении витамина С этим методом мешает присутствие восстановителей (глюкоза, фруктоза и др). Поэтому при большом содержании сахаров в исследуемом продукте используют хроматографию, что осложняет определение.
Нитроформа Ацидоформа
2. В последнее время для определения общего содержания витамина С (сумма АК и ДАК) получил признание весьма чувствительный и точный флуоресцентный метод. ДАК конденсируясь с о-фенилендиамином, образует флуоресцирующее соединение хиноксалин, обладающее максимальной флуоресценцией при длине волны возбуждающего света 350 нм.
о-Фенилендиамин ДАК Хиноксалин
Интенсивность флуоресценции хиноксалина в нейтральной среде при комнатной температуре прямо пропорциональна концентрации ДАК. Для количественного определения АК ее предварительно окисляют в ДАК. Недостатком метода является достаточно дорогое оборудование.
Методы, основанные на окислительно-восстановительных свойствах АК.
3. Из методов, основанных на окислительно-восстановительных свойствах АК, наибольшее применение нашел метод титрования раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола, имеющим синюю окраску. Продукт взаимодействия АК с реактивом – бесцветный. Метод может быть использован при анализе всех видов продуктов. При анализе продуктов, не содержащих естественных пигментов, в картофеле, молоке используют визуальное титрование. В случае присутствия естественных красителей, используют потенциометрическое титрование или метод индофенол-ксилоловой экстракции. Последний метод основан на количественном обесцвечивании 2,6-дихлорфенолиндофенола аскорбиновой кислотой. Избыток краски экстрагируется ксилолом и измеряется оптическая плотность экстракта при 500 нм.
В реакцию вступает только АК. ДАК предварительно восстанавливают цистеином. Для отделения АК от восстановителей, присутствующих в пищевых продуктах, подвергшихся тепловой обработке, или длительно хранившиеся экстракты обрабатывают формальдегидом. Формальдегид в зависимости от рН среды избирательно взаимодействует с АК и посторонними примесями восстановителей (рН = 0). Указанным методом определяют сумму АК и ДАК.
2,6-дихлорфенолиндофенол может быть использован и для фотометрического определения АК. Раствор реактива имеет синюю окраску, а продукт взаимодействия с АК – бесцветен, т.е. в результате реакции уменьшается интенсивность синей окраски. Оптическую плотность измеряют при 605 нм (рН = 3,6).
4. Еще одним методом, основанным на восстановительных свойствах АК, является колориметрический метод, в котором используется способность АК восстанавливать Fe(3+) до Fe(2+) и способность последнего образовывать с 2,2’-дипиридилом соли, интенсивно окрашенные в красный цвет. Реакцию проводят при рН 3,6 и температуре 70ºС. Оптическую плотность раствора измерят при 510 нм.
5. Фотометрический метод, основанный на взаимодействии АК с реактивом Фолина. Реактив Фолина представляет собой смесь фосфорномолибденовой и фосфорновольфрамовой кислот, т.е. это – известный метод, основанный на образовании молибденовых синей, поглощающих при 640–700 нм.
6. Для определения витамина С во всех пищевых продуктах с успехом может быть использован высоко чувствительный и специфичный метод ВЭЖХ. Анализ достаточно прост, лишь при анализе продуктов, богатых белками, необходимо предварительно удалить их. Детектирование осуществляется по флуоресценции.
Кроме названных методов определения витамина С существует еще целый ряд способов, например, окисление хлоридом золота и образование гидроксамовых кислот, но эти методы не имеют практического значения.
Определение тиамина (В 1 ). В большинстве природных продуктов тиамин встречается в виде дифосфорного эфира – кокарбоксилазы. Последняя, являясь активной группой ряда ферментов углеводного обмена, находится в определенных связях с белком. Для количественного определения тиамина необходимо разрушить комплексы и выделить исследуемый витамин в свободном виде, доступном для физико-химического анализа. С этой целью проводят кислотный гидролиз или гидролиз под воздействием ферментов. Объекты, богатые белком, обрабатывают протеолитическими ферментами (пепсином) в среде соляной кислоты. Объекты, с высоким содержанием жира (свинина, сыры), для его удаления обрабатывают эфиром (тиамин практически нерастворим в эфире).
1. Для определения тиамина в пищевых продуктах используют, как правило, флуоресцентный метод, основанный на окислении тиамина в щелочной среде гексацианоферратом калия (3+) с образованием сильно флуоресцирующего в ультрафиолетовом свете соединения тиохрома. Интенсивность его флуоресценсции прямо пропорциональна содержанию тиамина (длина волны возбуждающего света 365 нм, испускаемого – 460–470 нм (синяя флуоресценция)). При использовании этого метода возникают трудности, связанные с тем, что в ряде объектов присутствуют флуоресцирующие соединения. Их удаляют очисткой на колонках с ионообменными смолами. При анализе мяса, молока, картофеля, пшеничного хлеба и некоторых овощей очистка не требуется.
Тиамин Тиохром
2. Тиамин характеризуется собственным поглощением в УФ области (240 нм – в водном растворе, 235 нм – в этаноле), а значит он может быть определен методом прямой спектрофотометрии.
3. Для одновременного определения тиамина и рибофлавина используют ВЭЖХ.
Определение рибофлавина (В 2 ). В пищевых продуктах рибофлавин присутствует главным образом в виде фосфорных эфиров, связанных с белками, и, следовательно, не может быть определен без предварительного протеолитического расщепления. Свободный рибофлавин в значительном количестве содержится в молоке.
При определении рибофлавина наибольшее распространение получили микробиологический и физико-химический (флуоресцентный) методы анализа. Микробиологический метод специфичен, высоко чувствителен и точен; применим ко всем продуктам, но длителен и требует специальных условий.
Физико-химический метод разработан в двух вариантах, которые отличаются способом оценки флуоресцирующих веществ:
· вариант прямой флуоресценции (определение интенсивности флуоресценции рибофлавина) и
· люмифлавиновый вариант.
1. Свободный рибофлавин и его фосфорные эфиры обладают характерной желто-зеленой флуоресценцией при длине волны возбуждающего света 440–500 нм. На этом свойстве основан наиболее широко используемый флуоресцентный метод определения рибофлавина. Рибофлавин и его эфиры дают очень сходные спектры флуоресценции с максимумом при 530 нм. Положение максимума не зависит от рН. Интенсивность флуоресценции значительно зависит от рН и от растворителя (по-разному для рибофлавина и его эфиров), поэтому предварительно разрушают эфиры и анализируют свободный рибофлавин. Для этого используют гидролиз с соляной и трихлоруксусной кислотами, автоклавирование, обработку ферментными препаратами.
Интенсивность желто-зеленой флуоресценции рибофлавина в УФ-свете зависит не только от его концентрации, но и от значения рН раствора. Максимальная интенсивность достигается при рН=6-7. Однако измерение проводят при рН от 3 до 5, так как в этом интервале интенсивность флуоресценции определяется только концентрацией рибофлавина и не зависит от других факторов – значения рН, концентрации солей, железа, органических примесей и др.
Рибофлафин легко разрушается на свету, определение проводят в защищенном от света месте и при рН не выше 7. Следует отметить, что метод прямой флуоресценции не применим к продуктам с низким содержанием рибофлавина.
2. Люмифлавиновый вариант основан на использовании свойства рибофлавина при облучении в щелочной среде, переходить в люмифлавин, интенсивность флуоресценции которого измеряют после извлечения его хлороформом (голубая флуоресценция, 460–470 нм). Поскольку при определенных условиях в люмифлавин переходит 60–70% общего рибофлавина, при проведении анализа необходимо соблюдать постоянные условия облучения, одинаковые для испытуемого и стандартного раствора.
Рибофлавин Люмифлавин
Определение витамина В 6 . Для определения витамина могут быть использованы следующие методы:
1. Прямая спектрофотометрия. Пиридоксина гидрохлорид характеризуется собственным поглощением при 292 нм (e = 4,4·10 3) при рН = 5.
2. Метод Кьельдаля. Определение осуществляется по аммиаку, образующемуся при окислении витамина.
3. Фотометрический метод, основанный на реакции с 2,6-дихлорхинонхлоримином (реактив Гиббса) при рН 8–10, в результате которой образуются индофенолы, имеющие синюю окраску. Индофенолы экстрагируют метил-этилкетоном и измеряют оптическую плотность экстракта при 660–690 нм (реакцию Гиббса дают фенолы со свободным пара-положением).
Индофенол
4. Флуоресцентный метод, основанный на том, что при облучении пиридоксина и пиридоксамина наблюдается синяя, а пиридоксаля – голубая флуоресценция.
Определение витамина В 9 . Определение фолатов в пищевых продуктах в тканях и жидкостях организма представляет значительные трудности, т.к. в этих объектах они обычно присутствуют в связанной форме (в виде полиглютаматов); кроме того, большинство форм чувствительно к воздействию кислорода воздуха, света и температуры. Для предохранения фолатов от гидролиза рекомендуется вести гидролиз в присутствии аскорбиновой кислоты.
В пищевых продуктах фолаты могут быть определены физическими, химическими и микробиологическими методами. Колориметрический метод основан на расщеплении птероилглутаминовой кислоты с образованием п-аминобензойной кислоты и родственных ей веществ и дальнейшем превращении их в окрашенные соединения. Однако из-за недостаточной специфичности этот метод применяется в основном для анализа фармацевтических препаратов.
Для разделения, очистки и идентификации фолатов разработаны также методы хроматографии на колонках, бумаге и в тонком слое адсорбента.
Определение витамина РР. В пищевых продуктах никотиновая кислота и ее амид находятся как в свободной, так и в связанной форме, входя в состав коферментов. Химические и микробиологические методы количественного определения ниацина предполагают наиболее полное выделение и превращение его связанных форм, входящих в состав сложного органического вещества клеток, в свободную никотиновую кислоту. Связанные формы ниацина освобождают воздействием растворов кислот или гидрооксида кальция при нагревании. Гидролиз с 1 М раствором серной кислоты в автоклаве в течение 30 минут при давлении 0,1 МПа приводит к полному освобождению связанных форм ниацина и превращению никотинамида в никотиновую кислоту. Установлено, что этот способ обработки дает менее окрашенные гидролизаты и может быть использован при анализе мясных и рыбных продуктов. Гидролиз с гидрооксидом кальция предпочтителен при определении ниацина в муке, крупах, хлебобулочных изделиях, сырах, пищевых концентратах, овощах, ягодах и фруктах. Ca(OH) 2 образует с сахарами и полисахаридами, пептидами и гликопептидами соединения, почти полностью нерастворимые в охлажденных растворах. В результате гидролизат, полученый при обработке Ca(OH) 2 , содержит меньше веществ, мешающих химическому определению, чем кислотный гидролизат.
1. В основе химического метода определения ниацина лежит реакция Кенига, протекающая в две стадии. Первая стадия – реакция взаимодействия пиридинового кольца никотиновой кислоты с бромцианом, вторая – образование окрашенного производного глутаконового альдегида в результате взаимодействия с ароматическими аминами. (Сразу после добавления к никотиновой кислоте бромистого циана появляется желтая окраска глутаконового альдегида. В результате взаимодействия его с ароматическими аминами, вводимыми в реакционную смесь, образуются дианилы, которые интенсивно окрашены в желтый, оранжевый или красный цвет, в зависимости от амина (бензидин – красный, сульфаниловая кислота – желтый). Реакцию Кенига применяют для фотометрического определения пиридина и его производных со свободным a-положением. Недостатком метода является его длительность, так как скорость реакций мала.
Количественное определение аскорбиновой кислоты в исследуемом материале часто осуществляют с помощью раствора 2,6-дихлофенолиндофенола натрия, который в щелочной среде имеет синюю окраску, в кислой – розовую. Химизм реакции можно выразить в виде следующего уравнения.
Принцип метода основан на способности аскорбиновой кислоты восстанавливать индофеноловый реактив. При титровании вытяжки исследуемого материала раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола происходит окисление аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбиновую и восстановление индофенолового реактива. Конец титрования можно установить по изменению окраски. Окисленная форма 2,6-дихлорфенолиндофенола имеет синюю окраску в нейтральной и щелочной среде, восстановленная форма – приобретает розовую окраску в кислой среде.
Аскорбиновую кислоту извлекают из исследуемого материала 1 % раствором соляной кислоты и титруют раствором индофенолового реактива. По количеству краски, затраченной на титрование, рассчитывают содержание аскорбиновой кислоты.
Следует заметить, что точному определению содержания аскорбиновой кислоты в биологических объектах мешают другие, легко окисляемые вещества: глютатион, цистеин и т.п.
7.7.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ВИТАМИНА С В
РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ
Берут навеску исследуемого материала 5-20 г (в зависимости от предполагаемого содержания аскорбиновой кислоты), нарезают мелкими кусочками (картофель, морковь, черемша, яблоки и т.п.) тщательно растирают в ступке со щепоткой стекла или кварцевого песка, добавляя порциями по 4-5 мл раствора с массовой долей метафосфорной или соляной кислоты 2 % до получения однородной жидкой кашицы. Смесь из ступки количественно, с помощью раствора используемой при растирании кислоты, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и общий объем экстракта доводят до метки тем же раствором кислоты. Содержимое хорошо перемешивают, настаивают 5-7 мин и фильтруют через бумажный фильтр. Полученный фильтрат должен быть совершенно прозрачным.
Используемые для экстракции кислоты (соляная, метафосфорная, щавелевая) извлекают из исследуемого материала как свободную, так и связанную аскорбиновую кислоту, а также способствуют устойчивости аскорбиновой кислоты в экстрактах.
Берут две конические колбочки вместимостью 100-150 мл и в одну пипеткой вносят 20 мл полученного фильтрата, в другую – 20 мл раствора кислоты, используемой для растирания исследуемого материала. Содержимое колбочек титруют индофеноловым реактивом до слабо-розового цвета, удерживающегося 30 секунд. Результаты записывают, и титрование повторяют с новыми порциями того же фильтрата. На основании средней величины, полученной из 2-3 определений, рассчитывают содержание аскорбиновой кислоты по формуле:
,
(a-b) – разность между объемами индофенолового реактива, пошедшими на титрование опытной (а) и контрольной (b) проб, мл;
u - общий объем экстракта, мл;
u 1 – объем фильтрата, взятого для титрования, мл;
m – масса исследуемого материала, г,
100 – пересчет на 100г материала.
В растительных тканях в некоторых количествах содержатся и другие редуцирующие вещества, восстанавливающие 2,6-дихлорфенолиндофенол, поэтому при необходимости проведения особо точного анализа следует принять это в расчет. Для этого к двум другим порциям по 10-20 мл исследуемой вытяжки прибавляют по 0,1 или 0,2 мл 10 % раствора сернокислой меди и нагревают в термостате или сушильном шкафу 10 мин при температуре 110 ˚С. Охлаждают и титруют индофеноловым реактивом. В присутствии солей меди и при нагревании аскорбиновая кислота разрушается полностью. Полученную поправку вычитают из данных титрования опытных проб.
При анализе многих плодов и ягод, некоторых овощей получают окрашенные экстракты, что затрудняет определение аскорбиновой кислоты. Для определения аскорбиновой кислоты, окрашенную вытяжку переносят в широкую пробирку, приливают 2-5 мл дихлорэтана или хлороформа и титруют при взбалтывании раствором индофенолового реактива до появлении в слое дихлорэтана или хлороформа розового окрашивания, не исчезающего 30 сек.
При определении необходимо учитывать редуцирующую способность применяемых для экстракции кислот (смесь 20 мл 1 % соляной кислоты и 80 мл 2 % метафосфорной или 1 % щавелевой кислоты). Для этого две порции смеси кислот по 10 мл титруют индофеноловым реактивом до розового окрашивания. Полученную поправку (обычно не превышающую 0,08-0,10 мл раствора краски) вычитают из данных титрования опытных растворов.
|
2,6-ДИХЛОРФЕНОЛИНДОФЕНОЛА НАТРИЯ (ПО АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЕ)
|
|
Мaccy аскорбиновой кислоты (в мг), соответствующую 1 мл индофенолового реактива (раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола натрия), рассчитывают пo формуле:
где М – масса аскорбиновой кислоты в мг, соответствующая 1 мл индофенолового реактива;
(u-u 1) - разность между объемами индофенолового реактива, пошедшими на титрование пробы с аскорбиновой кислотой (u) и пробы без аскорбиновой кислоты (u 1), мл;
2 – масса аскорбиновой кислоты в мг, содержащаяся в опытной пробе (основной опыт).
7.7.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ВИТАМИНА С В МОЛОКЕ
Для определения аскорбиновой кислоты в молоке предварительно осаждают белки.
В колбочку наливают 50 мл молока и добавляют 4 мл насыщенного раствора щавелевой кислоты, взбалтывают, приливают 10 мл насыщенного раствора хлорида натрия, взбалтывают и оставляют при комнатной температуре на 5 мин. Затем содержимое колбочки фильтруют через бумажный складчатый фильтр, отмеривают пипеткой 20 мл фильтрата и титруют его индофеноловым реактивом до слабо-розового цвета, сохраняющегося 30 секунд. Берут еще 20 мл фильтрата и титрование повторяют. Для расчета берут средний результат.
Параллельно проводят контрольное определение, для чего в колбочке смешивают 50 мл воды, 4 мл насыщенного раствора щавелевой кислоты и 10 мл насыщенного раствора хлорида натрия. Далее поступают как в основном опыте.
,
где (a-b) – разность между объемами индофенолового реактива, пошедшего на титрование опытной и контрольной проб, мл;
64 – общий объем молока после добавления осадителей белка и жира;
М – масса аскорбиновой кислоты, соответствующая 1 мл индофенолового реактива (см. пункт 7.7.2.), мг;
u - объем фильтрата, взятого для титрования, мл;
u 1 - объем молока, взятого для анализа, мл.
РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; молоко свежее; картофель (лимоны,морковь, яблоки, капуста, черемша и т.п.); раствор с массовой долей метафосфорной или соляной кислоты 2 %; насыщенный раствор щавелевой кислоты; насыщенный раствор хлорида натрия; свежеприготовленный стандартный раствор аскорбиновой кислоты (в мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 100 мг аскорбиновой кислоты квалификации «медицинская» и, растворяя, объем доводят до метки раствором с массовой долей метафосфорной или соляной кислоты 2 %; индофеноловый реактив (в мерную колбу вместимостью 500 мл вносят 140-150 мг 2,6-дихлорфенолиндофенола натрия и 200-300 мл воды, энергично встряхивают до растворения краски, объем доводят до метки водой, перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр в сухую склянку из темного стекла; раствор хранят в холодильнике не более трех суток).
Введение……………………………………………………………2
1. Общий обзор методов определения витаминов…………………3
2. Хроматографические методы определения витаминов…………5
3. Электрохимические методы определения витаминов…………10
4. Инверсионно вольтамперометрический метод определения
водорасторимых витаминов B 1 B 2 в пищевых продуктах………..13
Заключение………………………………………………………...18
Введение
В настоящее время на рынке появилось огромное количество витаминизированных продуктов питания для человека и кормов для животных, представляющих собой сухие многокомпонентные смеси. Ассортимент таких продуктов представлен достаточно широко. Это, прежде всего, биологически активные добавки к пище, премиксы, комбикорма для животных и птиц, поливитаминные препараты. Критерием качества таких продуктов может являться их анализ на содержание витаминов и, особенно, таких жизненно необходимых, как водорастворимые и жирорастворимые витамины, количество которых регламентируется нормативными документами и санитарными нормами качества.
Для определения витаминов применяют различные методы. Широко используемые оптические методы анализа трудоемки, требуют больших затрат времени и дорогостоящих реактивов, применение хроматографических методов осложнено использованием дорогостоящего оборудования. С каждым годом расширяется ассортимент и увеличивается производство продуктов питания, совершенствуется рецептура детского питания. Это в свою очередь предъявляет повышенные требования к контролю за качеством выпускаемой продукции и совершенствованию методов определения витаминов. Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов характеризуют пищевую ценность большинства видов и групп продуктов детского питания различного назначения.
1. Общий обзор методов определения витаминов
Почти все витамины легко подвергаются окислению, изомеризации и разрушаются под воздействием высокой температуры, света, кислорода воздуха, влаги и других факторов.
Из существующих методов определения витамина С (аскорбиновой кислоты) наиболее широко применяют метод визуального и потенциометрического титрования раствором 2,6-ди-хлорфенолиндофенола по ГОСТ 24556-81, основанный на редуцирующих свойствах аскорбиновой кислоты и ее способности восстанавливать 2,6-ДХФИФ. Темно-синяя окраска этого индикатора при добавлении аскорбиновой кислоты переходит в бесцветную. Важное значение имеет приготовление экстракта исследуемого продукта. Наилучшим экстрагентом является 6 %-ный раствор метафосфорной кислоты, который инактивирует аскорбинотоксидазу и осаждает белки.
Каротин в растительном сырье, концентратах и безалкогольных напитках контролируют физико-химическим методом по ГОСТ 8756.22-80. Метод основан на фотометрическом определении массовой доли каротина в растворе, полученном в процессе экстрагирования из продуктов органическим растворителем. Предварительно раствор очищают от сопутствующих красящих веществ с помощью колоночной хроматографии. Каротин легко растворяется в органических растворителях (эфир, бензин и др.) и придает им желтую окраску. Для количественного определения каротина используют адсорбционную хроматографию на колонках с окисью алюминия и магния. Такое определение пигментов на колонке зависит от активности адсорбента, количества пигментов, а также присутствия других компонентов в разделяемой смеси. Сухая смесь окиси алюминия задерживает каротин, а влажная пропускает в раствор другие красящие вещества.
Тиамин в основном находится в связанном состоянии в виде дифосфорного эфира - кокарбоксилазы, которая является активной группой ряда ферментов. С помощью кислотного гидролиза и под воздействием ферментов тиамин освобождается из связанного состояния. Этим способом определяют количество тиамина. Для расчета содержания витамина B1 используют флюрометрический метод, который применяют для определения тиамина в пищевых продуктах. Он основан на способности тиамина образовывать в щелочной среде с феррнцианндом калня тиохром, который дает интенсивную флюоресценцию в бутиловом спирте. Интенсивность процесса контролируют на флюорометре ЭФ-ЗМ.
В продуктах питания и напитках рибофлавин присутствует в связанном состоянии, т. е. в форме фосфорных эфиров, связанных с белком. Чтобы определить количество рибофлавина в продуктах, необходимо освободить его из связанного состояния путем кислотного гидролиза и обработки ферментными препаратами. Витамин B1 в безалкогольных напитках рассчитывают с помощью химического метода для определения количества легкогидролизуемых и прочно связанных форм рибофлавина в тканях. Метод основан на способности рибофлавина к флюоресценции до и после восстановления его гипосульфитом натрия. Определение общего содержания фенольных соединений. Для этого используют колориметрический метод Фолина - Дениса, который основан на образовании голубых комплексов при восстановлении вольфрамовой кислоты под действием полифенолов с реагентом в щелочной среде. Фенольные соединения определяют по хлорогеновой кислоте методом пламенной фотометрии на приборе ЕКФ-2.
2. Хроматографические методы определения витаминов
В последнее время за рубежом бурное развитие переживает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Это связано, прежде всего, с появлением прецизионных жидкостных хроматографов, совершенствованием техники выполнения анализа. Широкое использование метода ВЭЖХ при определении витаминов нашло отражение и в числе публикаций. На сегодняшний день более половины всех опубликованных работ по анализу как водо- так и жирорастворимых витаминов посвящено применению этого метода.Широкое распространение при определении витаминов получили различные варианты хроматографии.
Для очистки токоферола от посторонних примесей используют метод тонкослойной хроматографии В сочетании со спектрофотометрическими и флуориметрическими методами этим способом проводят и количественное определение витамина Е. При разделении используют пластинки с силуфолом, кизельгелем
Анализ изомеров токоферола в оливковом масле проводится методом газо-жидкостной хроматографии. Методики анализа ГХ и ГЖХ требуют получения летучих производных, что крайне затруднительно при анализе жирорастворимых витаминов. По этой причине данные способы определения не получили большого распространения. Определение витамина Е в пищевых продуктах, фармпрепаратах и биологических объектах проводят в градиентном и изократическом режимах как в нормально-фазовых, так и в обращенно-фазовых условиях. В качестве адсорбентов используют силикагель (СГ), кизельгур, силасорб, ODS-Гиперсил и другие носители. Для непрерывного контроля состава элюата в жидкостной хроматографии при анализе витаминов и увеличения чувствительности определения используют УФ (А,=292 нм), спектрофотометрический (Х=295нм), флуоресцентный (Х,=280/325нм), электрохимический, ПМР- и масс-спектроскопический детекторы.
Большинство исследователей для разделения смесей всех восьми изомеров токоферолов и их ацетатов предпочитают использовать адсорбционную хроматографию. В этих случаях подвижной фазой обычно служат углеводороды, содержащие незначительные количества какого-либо простого эфира. Перечисленные методики определения витамина Е, как правило, не предусматривают предварительного омыления образцов, что существенно сокращает время выполнения анализа.
Разделение с одновременным количественным определением содержания жирорастворимых витаминов (А, Д, Е, К) при их совместном присутствии в поливитаминных препаратах проводят как на прямой, так и на обращенной фазах. При этом большинство исследователей предпочитают использовать обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ. Метод ВЭЖХ позволяет анализировать водорастворимые витамины В1 и В2 как одновременно, так и отдельно. Для разделения витаминов используют обращенно-фазный, ион-парный и ионообменный варианты ВЭЖХ. Применяют как изократический, так и градиентный режимы хроматографирования. Предварительное отделение определяемых веществ от матрицы осуществляют путем ферментативного и кислотного гидролиза пробы.
Преимущества метода жидкостной хроматографии:
Одновременное определение нескольких компонентов
Устранение влияния мешающих компонентов
Комплекс можно быстро перестроить на выполнение других анализов.
Состав и характеристика оборудования и программного обеспечения для жидкостного хроматографа "Хромос ЖХ-301":
Таблица 1
