Руководитель направления
„Онкогенетика“
Жусина
Юлия Геннадьевна
Окончила педиатрический факультет Воронежского государственного медицинского университета им. Н.Н. Бурденко в 2014 году.
2015 - интернатура по терапии на базе кафедры факультетской терапии ВГМУ им. Н.Н. Бурденко.
2015 - сертификационный курс по специальности «Гематология» на базе Гематологического научного центра г. Москвы.
2015-2016 – врач терапевт ВГКБСМП №1.
2016 - утверждена тема диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук «изучение клинического течения заболевания и прогноза у больных хронической обструктивной болезнью легких с анемическим синдромом». Соавтор более 10 печатных работ. Участник научно-практических конференций по генетике и онкологии.
2017 - курс повышения квалификации по теме: «интерпретация результатов генетических исследований у больных с наследственными заболеваниями».
С 2017 года ординатура по специальности «Генетика» на базе РМАНПО.
Руководитель направления
„Генетика“
Канивец
Илья Вячеславович
Канивец Илья Вячеславович, врач-генетик, кандидат медицинских наук, руководитель отдела генетики медико-генетического центра Геномед. Ассистент кафедры медицинской генетики Российской медицинской академии непрерывного профессионального образования.
Окончил лечебный факультет Московского государственного медико-стоматологического университета в 2009 году, а в 2011 – ординатуру по специальности «Генетика» на кафедре Медицинской генетики того же университета. В 2017 году защитил диссертацию на соискание ученой степени кандидата медицинских наук на тему: Молекулярная диагностика вариаций числа копий участков ДНК (CNVs) у детей с врожденными пороками развития, аномалиями фенотипа и/или умственной отсталостью при использовании SNP олигонуклеотидных микроматриц высокой плотности»
C 2011-2017 работал врачом-генетиком в Детской клинической больнице им. Н.Ф. Филатова, научно-консультативном отделе ФГБНУ «Медико-генетический научный центр». С 2014 года по настоящее время руководит отделом генетики МГЦ Геномед.
Основные направления деятельности: диагностика и ведение пациентов с наследственными заболеваниями и врожденными пороками развития, эпилепсией, медико-генетическое консультирование семей, в которых родился ребенок с наследственной патологией или пороками развития, пренатальная диагностика. В процессе консультации проводится анализ клинических данных и генеалогии для определения клинической гипотезы и необходимого объема генетического тестирования. По результатам обследования проводится интерпретация данных и разъяснение полученной информации консультирующимся.
Является одним из основателей проекта «Школа Генетики». Регулярно выступает с докладами на конференциях. Читает лекции для врачей генетиков, неврологов и акушеров-гинекологов, а также для родителей пациентов с наследственными заболеваниями. Является автором и соавтором более 20 статей и обзоров в российских и зарубежных журналах.
Область профессиональных интересов – внедрение современных полногеномных исследований в клиническую практику, интерпретация их результатов.
Время приема: СР, ПТ 16-19
Руководитель направления
„Неврология“
Шарков
Артем Алексеевич
Шарков Артём Алексеевич – врач-невролог, эпилептолог
В 2012 году обучался по международной программе “Oriental medicine” в университете Daegu Haanu в Южной Корее.
С 2012 года - участие в организации базы данных и алгоритма для интерпретации генетических тестов xGenCloud (https://www.xgencloud.com/, Руководитель проекта - Игорь Угаров)
В 2013 году окончил Педиатрический факультет Российского национального исследовательского медицинского университета имени Н.И. Пирогова.
C 2013 по 2015 год обучался в клинической ординатуре по неврологии в ФГБНУ «Научный центр неврологии».
С 2015 года работает неврологом, научным сотрудником в Научно- исследовательском клиническом институте педиатрии имени академика Ю.Е. Вельтищева ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова. Также работает врачом- неврологом и врачом лаборатории видео-ЭЭГ мониторинга в клиниках «Центр эпилептологии и неврологии им. А.А.Казаряна» и «Эпилепси-центр».
В 2015 году прошел обучение в Италии на школе «2nd International Residential Course on Drug Resistant Epilepsies, ILAE, 2015».
В 2015 году повышение квалификации - «Клиническая и молекулярная генетика для практикующих врачей», РДКБ, РОСНАНО.
В 2016 году повышение квалификации - «Основы молекулярной генетики» под руководством биоинформатика, к.б.н. Коновалова Ф.А.
С 2016 года - руководитель неврологического направления лаборатории "Геномед".
В 2016 году прошел обучение в Италии на школе «San Servolo international advanced course: Brain Exploration and Epilepsy Surger, ILAE, 2016».
В 2016 году повышение квалификации - "Инновационные генетические технологии для врачей", "Институт лабораторной медицины".
В 2017 году – школа «NGS в медицинской генетике 2017», МГНЦ
В настоящее время проводит научные исследования в области генетики эпилепсии под руководством профессора, д.м.н. Белоусовой Е.Д. и профессора, д.м.н. Дадали Е.Л.
Утверждена тема диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук "Клинико-генетические характеристики моногенных вариантов ранних эпилептических энцефалопатий".
Основные направления деятельности – диагностика и лечение эпилепсии у детей и взрослых. Узкая специализация – хирургическое лечение эпилепсии, генетика эпилепсий. Нейрогенетика.
Научные публикации
Шарков А., Шаркова И., Головтеев А., Угаров И. «Оптимизация
дифференциальной диагностики и интерпретации результатов генетического
тестирования экспертной системой XGenCloud при некоторых формах
эпилепсий». Медицинская генетика, № 4, 2015, с. 41.
*
Шарков А.А., Воробьев А.Н., Троицкий А.А., Савкина И.С., Дорофеева
М.Ю., Меликян А.Г., Головтеев А.Л. "Хирургия эпилепсии при многоочаговом
поражении головного мозга у детей с туберозным
склерозом." Тезисы XIV Российского Конгресса «ИННОВАЦИОННЫЕ
ТЕХНОЛОГИИ В ПЕДИАТРИИ И ДЕТСКОЙ ХИРУРГИИ». Российский
Вестник Перинатологии и Педиатрии, 4, 2015. - с.226-227.
*
Дадали Е.Л., Белоусова Е.Д., Шарков А.А. "Молекулярно-генетические подходы к
диагностике моногенных идиопатических и симптоматических
эпилепсий". Тезис XIV Российского Конгресса «ИННОВАЦИОННЫЕ
ТЕХНОЛОГИИ В ПЕДИАТРИИ И ДЕТСКОЙ ХИРУРГИИ». Российский
Вестник Перинатологии и Педиатрии, 4, 2015. - с.221.
*
Шарков А.А., Дадали Е.Л., Шаркова И.В. «Редкий вариант ранней эпилептической
энцефалопатии 2 типа, обусловленной мутациями в гене CDKL5 у больного
мужского пола». Конференция "Эпилептология в системе нейронаук". Сборник
материалов конференции: / Под редакцией: проф. Незнанова Н.Г., проф.
Михайлова В.А. СПб.: 2015. – с. 210-212.
*
Дадали Е.Л., Шарков А.А., Канивец И.В., Гундорова П., Фоминых
В.В., Шаркова И,В,. Троицкий А.А., Головтеев А.Л., Поляков А.В. Новый
аллельный вариант миоклонус-эпилепсии 3 типа, обусловленный мутациями в
гене KCTD7// Медицинская генетика.-2015.- т.14.-№9.- с.44-47
*
Дадали Е.Л., Шаркова И.В., Шарков А.А., Акимова И.А. «Клинико-генетические
особенности и современные способы диагностики наследственных эпилепсий».
Сборник материалов «Молекулярно-биологические технологии в медицинской
практике» / Под ред. чл.-корр. РАЕН А.Б. Масленникова.- Вып. 24.-
Новосибирск: Академиздат, 2016.- 262: с. 52-63
*
Белоусова Е.Д., Дорофеева М.Ю., Шарков А.А. Эпилепсия при туберозном
склерозе. В "Болезни мозга, медицинские и социальные аспекты" под редакцией
Гусева Е.И., Гехт А.Б., Москва; 2016; стр.391-399
*
Дадали Е.Л., Шарков А.А., Шаркова И.В., Канивец И.В., Коновалов Ф.А., Акимова
И.А. Наследственные заболевания и синдромы, сопровождающиеся
фебрильными судорогами: клинико-генетические характеристики и способы
диагностики. //Русский Журнал Детской Неврологии.- Т. 11.- №2, с. 33-
41. doi: 10.17650/ 2073-8803- 2016-11- 2-33- 41
*
Шарков А.А., Коновалов Ф.А., Шаркова И.В., Белоусова
Е.Д., Дадали Е.Л. Молекулярно-генетические подходы к диагностике
эпилептических энцефалопатий. Сборник тезисов «VI БАЛТИЙСКИЙ КОНГРЕСС
ПО ДЕТСКОЙ НЕВРОЛОГИИ» / Под редакцией профессора Гузевой В.И. Санкт-
Петербург, 2016, с. 391
*
Гемисферотомии при фармакорезистентной эпилепсии у детей с билатеральным
поражением головного мозга Зубкова Н.С., Алтунина Г.Е., Землянский М.Ю.,
Троицкий А.А., Шарков А.А., Головтеев А.Л. Сборник тезисов «VI БАЛТИЙСКИЙ
КОНГРЕСС ПО ДЕТСКОЙ НЕВРОЛОГИИ» / Под редакцией
профессора Гузевой В.И. Санкт-Петербург, 2016, с. 157.
*
*
Статья: Генетика и дифференцированное лечение ранних эпилептических
энцефалопатий. А.А. Шарков*, И.В. Шаркова, Е.Д. Белоусова, Е.Л. Дадали. Журнал неврологии и психиатрии, 9, 2016; Вып. 2doi: 10.17116/jnevro
20161169267-73
*
Головтеев А.Л., Шарков А.А., Троицкий А.А., Алтунина Г.Е., Землянский М.Ю.,
Копачев Д.Н., Дорофеева М.Ю. "Хирургическое лечение эпилепсии при
туберозном склерозе" под редакцией Дорофеевой М.Ю., Москва; 2017; стр.274
*
Новые международные классификации эпилепсий и эпилептических приступов
Международной Лиги по борьбе с эпилепсией. Журнал неврологии и психиатрии
им. C.C. Корсакова. 2017. Т. 117. № 7. С. 99-106
Руководитель направления
"Пренатальная диагностика"
Киевская
Юлия Кирилловна
В 2011 году Окончила Московский Государственный Медико-Стоматологический Университет им. А.И. Евдокимова по специальности «Лечебное дело» Обучалась в ординатуре на кафедре Медицинской генетики того же университета по специальности «Генетика»
В 2015 году окончила интернатуру по специальности Акушерство и Гинекология в Медицинском институте усовершенствования врачей ФГБОУ ВПО «МГУПП»
С 2013 года ведет консультативный прием в ГБУЗ «Центр Планирования Семьи и Репродукции» ДЗМ
С 2017 года является руководителем направления «Пренатальная Диагностика» лаборатории Геномед
Регулярно выступает с докладами на конференциях и семинарах. Читает лекции для врачей различных специальной в области репродуции и пренатальной диагностики
Проводит медико-генетическое консультирование беременных по вопросам пренатальной диагностики с целью предупреждения рождения детей с врождёнными пороками развития, а так же семей с предположительно наследственной или врожденной патологией. Проводит интерпретацию полученных результатов ДНК-диагностики.
СПЕЦИАЛИСТЫ
Латыпов
Артур Шамилевич
Латыпов Артур Шамилевич – врач генетик высшей квалификационной категории.
После окончания в 1976 году лечебного факультета Казанского государственного медицинского института в течение многих работал сначала врачом кабинета медицинской генетики, затем заведующим медико-генетическим центром Республиканской больницы Татарстана, главным специалистом министерства здравоохранения Республики Татарстан, преподавателем кафедр Казанского медуниверситета.
Автор более 20 научных работ по проблемам репродукционной и биохимической генетики, участник многих отечественных и международных съездов и конференций по проблемам медицинской генетики. Внедрил в практическую работу центра методы массового скрининга беременных и новорожденных на наследственные заболевания, провел тысячи инвазивных процедур при подозрении на наследственные заболевания плода на разных сроках беременности.
С 2012 года работает на кафедре медицинской генетики с курсом пренатальной диагностики Российской академии последипломного образования.
Область научных интересов – метаболические болезни у детей, дородовая диагностика.
Время приема: СР 12-15, СБ 10-14Прием врачей осуществляется по предварительной записи.
Врач-генетик
Габелко
Денис Игоревич
В 2009 году закончил лечебный факультет КГМУ им. С. В. Курашова (специальность «Лечебное дело»).
Интернатура в Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (специальность «Генетика»).
Интернатура по терапии. Первичная переподготовка по специальности «Ультразвуковая диагностика». С 2016 года является сотрудником кафедры кафедры фундаментальных основ клинической медицины института фундаментальной медицины и биологии.
Сфера профессиональных интересов: пренатальная диагностика, применение современных скрининговых и диагностических методов для выявления генетической патологии плода. Определение риска повторного возникновения наследственных болезней в семье.
Участник научно-практических конференций по генетике и акушерству и гинекологии.
Стаж работы 5 лет.
Консультация по предварительной записиПрием врачей осуществляется по предварительной записи.
Врач-генетик
Гришина
Кристина Александровна
Окончила в 2015 году Московский Государственный Медико-Стоматологический Университет по специальности
«Лечебное дело». В том же году поступила в ординатуру по специальности 30.08.30 «Генетика» в ФГБНУ «Медико-генетический научный центр».
Принята на работу в лабораторию молекулярной генетики сложно наследуемых заболеваний (заведующий – д.б.н. Карпухин А.В.) в марте 2015 года на
должность лаборанта-исследователя. С сентября 2015 года переведена на должность научного сотрудника. Является автором и соавтором более 10 статей и
тезисов по клинической генетике, онкогенетике и молекулярной онкологии в российских и зарубежных журналах. Постоянный участник конференций по медицинской генетике.
Область научно-практических интересов: медико-генетическое консультирование больных с наследственной синдромальной и мультифакториальной патологией.
Консультация врача-генетика позволяет ответить на вопросы:
являются ли симптомы у ребенка признаками наследственного заболевания
какое исследование необходимо для выявления причины
определение точного прогноза
рекомендации по проведению и оценка результатов пренатальной диагностики
все, что нужно знать при планировании семьи
консультация при планировании ЭКО
выездные и онлайн консультации
ринимала участие в научно-практической школе "Инновационные генетические технологии для врачей: применение в клинической практике", конференции Европейского общества генетики человека (ESHG) и других конференциях, посвященных генетике человека.
Проводит медико-генетическое консультирование семей с предположительно наследственной или врожденной патологией, включая моногенные заболевания и хромосомные аномалии, определяет показания к проведению лабораторных генетических исследований, проводит интерпретацию полученных результатов ДНК-диагностики. Консультирует беременных по вопросам пренатальной диагностики с целью предупреждения рождения детей с врождёнными пороками развития.
Врач-генетик, врач акушер-гинеколог, кандидат медицинских наук
Кудрявцева
Елена Владимировна
Врач-генетик, врач акушер-гинеколог, кандидат медицинских наук.
Специалист в области репродуктивного консультирования и наследственной патологии.
Окончила Уральскую государственную медицинскую академию в 2005 году.
Ординатура по специальности «Акушерство и гинекология»
Интернатура по специальности «Генетика»
Профессиональная переподготовка по специальности «Ультразвуковая диагностика»
Направления деятельности:
- Бесплодие и невынашивание беременности Василиса Юрьевна
Является выпускницей Нижегородской государственной медицинской академии, лечебного факультета (специальность «Лечебное дело»). Окончила клиническую ординатуру ФБГНУ «МГНЦ» по специальности «Генетика». В 2014 году проходила стажировку в клинике материнства и детства (IRCCS materno infantile Burlo Garofolo, Trieste, Italy).
С 2016 года работает на должности врача-консультанта в ООО «Геномед».
Регулярно участвует в научно-практических конференциях по генетике.
Основные направления деятельности: Консультирование по вопросам клинической и лабораторной диагностики генетических заболеваний и интерпретация результатов. Ведение пациентов и их семей с предположительно наследственной патологией. Консультирование при планировании беременности, а также при наступившей беременности по вопросам пренатальной диагностики с целью предупреждения рождения детей с врожденной патологией.
Наследственные болезни обмена веществ - обширный класс наследственных заболеваний человека, включающий более 600 различных форм. Количество новых форм болезней обмена веществ и даже классов растет с каждым годом, экспоненциально возрастает количество публикаций, связанных с возможностями диагностики, профилактики и, что немаловажно, лечения болезней обмена веществ. Отдельные формы болезней обмена веществ встречаются редко или крайне редко, однако их суммарная частота довольно высока и составляет 1:3000-1:5000 живых новорожденных. Характерным свойством этих заболеваний являются выраженные биохимические изменения, которые проявляются до начала первых клинических симптомов.
Согласно биохимической классификации, болезни обмена веществ разделены на 22 группы в зависимости от типа поврежденного метаболического пути (аминоацидопатии, нарушения углеводного обмена и т. д.) или в зависимости от его локализации в пределах определенного компонента клетки (лизосомные, пероксисомные и митохондриальные болезни).
Биохимическая классификация болезней обмена веществ выглядит следующим образом.
Лизосомные болезни накопления.
Митохондриальные болезни.
Пероксисомные болезни.
Врожденные нарушения гликозилирования.
Нарушения обмена креатинина.
Нарушения обмена холестерина.
Нарушения синтеза цитокинов и других иммуномодуляторов.
Нарушения обмена аминокислот/органических кислот.
Нарушения митохондриального b-окисления.
Нарушения обмена кетоновых тел.
Нарушения обмена жиров и жирных кислот, липопротеинов.
Нарушения обмена углеводов и гликогена.
Нарушения транспорта глюкозы.
Нарушения обмена глицерина.
Нарушения обмена витаминов.
Нарушения обмена металлов и анионов.
Нарушения обмена желчных кислот.
Нарушения обмена нейротрансмиттеров.
Нарушения обмена стероидов и других гормонов.
Нарушения обмена гема и порфиринов.
Нарушения обмена пуринов/пиримидинов.
Нарушения обмена билирубина.
Основные механизмы патогенеза болезней обмена веществ
НАКОПЛЕНИЕ СУБСТРАТА
Накопление субстрата блокированной ферментной реакции является одним из основных механизмов патогенеза при подавляющем большинстве болезни обмена веществ.
Прежде всего это относится к нарушению катаболических реакций, таких как расщепление крупных макромолекул, аминокислот, органических кислот и т. д. Если накапливаемый субстрат легко выводится из клеток и его концентрация в биологических жидкостях во много раз превышает гомеостатический уровень, может изменяться кислотно-щелочное равновесие (органические кислоты при органических ацидуриях), происходить его накопление в разных тканях (гомогентизиновая кислота при алкаптонурии). В ряде случаев субстрат создает конкуренцию сходным соединениям при транспорте через гематоэнцефалический барьер, приводя к их истощению в мозге (аминоацидопатии). Если накапливаемый субстрат плохорастворим, происходит его накопление внутри клетки, что запускает механизмы апоптотической гибели. Одним из дополнительных следствий накопления субстрата может быть активация минорных метаболических путей, чей удельный вес при нормальном метаболизме незначителен.
Такой механизм, например, лежит в основе накопления фенилпиро-виноградной кислоты при фенилкетонурии.
Накапливаемые метаболиты имеют важное диагностическое значение, в ряде случаев их количественный или полуколичественный анализ позволяет точно установить форму заболевания. При органических ацидуриях и аминоацидопатиях накопление в больших количествах водорастворимых соединений в плазме крови и моче позволяет быстро провести их количественное или качественное определение с помощью хроматографических методов анализа.
НЕДОСТАТОЧНОСТЬ ПРОДУКТОВ РЕАКЦИИ
Недостаточность продуктов реакции - второй основной механизм патогенеза болезней обмена веществ. Причиной патологических изменений может быть непосредственно недостаточность продукта блокированной реакции. Например, при дефекте биотинидазы нарушается отщепление биотина от диетарных белков, и клинические проявления болезни связаны с недостатком этого витамина.
Недостаточность продуктов реакции в циклическом процессе мочевины создает примечательную метаболическую ситуацию - некоторые аминокислоты из заменимых переходят в категорию незаменимых. Так, при аргинин-янтарной ацидурии наблюдается нарушение образования аргинина из аргинин-янтарной кислоты, что приводит к недостаточности аргинина и орнитина. В ряде случаев может возникать недостаточность более удаленного в данной метаболической цепи продукта, например альдостерона и кортизола, при адреногенитальном синдроме,
МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ИЗОЛЯЦИЯ
В отдельную группу необходимо выделить заболевания, связанные с метаболической изоляцией продукта реакции. Это основной механизм патогенеза при нарушениях белков-переносчиков, которые не являются ферментами, но участвуют в регуляции определенной биохимической реакции. Каскад метаболических событий, который запускается при этих болезнях, имеет сходные для организма и клетки последствия. Синдром гиперорнитинемия – гипераммониемия – гомоцитруллинурия (акроним от трех основных биохимических маркеров - Hyperammonemia, Hyperornithinemia, Homocitrullinemia) связан с нарушением транспорта орнитина. В результате наблюдается недостаточность орнитина внутри митохондрий, что приводит к накоплению карбамоилфосфата и аммония.
Выделить единственный ведущий механизм патогенеза практически невозможно, поскольку метаболические процессы тесно взаимосвязаны. Как правило, наблюдается сочетание всех описанных механизмов, и при каждом из фермента-тивных блоков происходят значительные изменения во всей метаболической сети клетки.
Лабораторная диагностика наследственных болезней обмена веществ
Дифференциальная диагностика наследственных болезней обмена веществ целиком зависит от применения необычайно широкого спектра биохимических, физико-химических и молекулярно-генетических методов. В большинстве случаев только сочетанная интерпретация всех полученных результатов дает возможность точно определить форму заболевания. Как правило, общая стратегия диагностики наследственных болезней обмена веществ включает несколько этапов.
I - выявление дефектного звена метаболического пути посредством анализа (количественного, полуколичественного или качественного) метаболитов.
II - выявление дисфункции белка определением его количества и/или активности.
III - выяснение природы мутации, т. е. характеристика мутантного аллеля на уровне гена.
Такую стратегию применяют не только для решения проблем, касающихся изучения молекулярных механизмов патогенеза наследственных болезней обмена веществ, выявления генофенотипических корреляций, она необходима прежде всего для практической диагностики наследственных болезней обмена веществ.
Верифицировать диагноз на уровне белка и мутантного гена необходимо как для проведения пренатальной диагностики, медико-генетического консультирования отягощенных семей, так и в ряде случаев для назначения адекватной терапии. Например, при недостаточности дегидроптеридинредуктазы клинический фенотип и уровни фенилаланина будут неотличимы от классической формы фенилкетонурии, но подходы к терапии этих заболеваний принципиально отличаются. Важность локусной дифференциации наследственных болезней обмена веществ для медико-генетического консультирования может быть проиллюстрирована на примере мукополисахаридоза II типа (болезни Хантера). По спектру экскретируемых гликозаминогликанов невозможно различить мукополисахаридозы I, II и VII типа, но из этих заболеваний только болезнь Хантера наследуется по Х-сцепленному рецессивному типу, что имеет принципиальное значение для прогноза потомства в семье с отягощенным анамнезом. Что касается пренатальной диагностики, то, имея данные о форме мукополисахаридоза (это может быть установлено только при исследовании активности ферментов), возможно проведение пренатальной диагностики уже на 8-11-й неделе беременности, если же форма не уточнена, то только на 20-й неделе. Безусловна приоритетность молекулярно-генетических методов при установлении гетерозиготного носительства, а также в пренатальной диагностике заболеваний, при которых мутантный фермент не экспрессируется в клетках ворсин хориона, например при фенилкетонурии, некоторых гликогенозах, дефектах митохондриального р-окисления.
ВЫЯВЛЕНИЕ ДЕФЕКТНОГО ЗВЕНА МЕТАБОЛИЧЕСКОГО ПУТИ
Анализ метаболитов является важнейшим этапом в диагностике многих заболеваний из класса наследственных болезней обмена веществ. Прежде всего это относится к нарушениям межуточного обмена аминокислот и органических кислот. При большинстве этих заболеваний количественное определение метаболитов в биологических жидкостях позволяет точно установить диагноз. Для этих целей применяют методы качественного химического анализа, спектрофотометрические методы количественной оценки соединений, а также различные виды хроматографии (тонкослойную, высокоэффективную жидкостную, газовую, тандемную масс-спектрометрию). Биологическим материалом для этих исследований обычно служат плазма или сыворотка крови и образцы мочи.
При таких наследственных болезнях обмена веществ, как нарушения энергетического обмена, обмена углеводов и аминокислот, анализ соединений общих для многих метаболических путей (ключевых метаболитов) позволяет проводить дифференциальную диагностику заболеваний и планировать дальнейшую тактику обследования. Для многих групп наследственных болезней обмена веществ в целях определения концентрации метаболитов используют полуколичественный анализ. Иногда и качественный анализ является первым этапом диагностического поиска и позволяет с высокой достоверностью заподозрить определенную нозологическую форму заболевания или группу болезней.
КАЧЕСТВЕННЫЕ И ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ТЕСТЫ С МОЧОЙ
Поскольку при многих наследственных болезней обмена веществ происходит накопление субстратов блокированной ферментной реакции или их производных, избыточные концентрации этих метаболитов можно обнаружить с помощью химических тестов качественного анализа. Эти тесты чувствительны, просты в применении, отличаются низкой себестоимостью и не дают ложноотрицательных результатов, а информация, полученная при их применении, позволяет с высокой долей вероятности заподозрить наследственные болезней обмена веществ у пациента. Необходимо учитывать, что на результаты этих тестов оказывают влияние лекарственные препараты, пищевые добавки и их метаболиты. Тесты качественного анализа применяют в программах селективного скрининга.
Качественные тесты
Цвет и запах: лейциноз, тирозинемия, изовалериановая ацидемия, фенилкетонурия, алкаптонурия, цистинурия, З-гидрокси-З-метилглутаровая ацидурия.
Тест Бенедикта (галактоземия, врожденная непереносимость фруктозы, алкаптонурия). Также положительный при синдроме Фанкони, сахарном диабете, лактазной недостаточности, приеме антибиотиков.
Тест с хлоридом железа (фенилкетонурия, лейциноз, гиперглицинемия, алкаптонурия, тирозинемия, гистидинемия). Также положительный при циррозе печени, плеохромацитоме, гипербилирубинемии, лактат-ацидозе, кетоацидозе, меланоме.
Тест с динитрофенилгидразином (фенилкетонурия, лейциноз, гиперглицинемия, алкаптонурия). Также положительный при гликогенозах, лактат-ацидозе.
Тест с п-нитроанилином: метилмалоновая ацидурия.
Сульфитный тест: недостаточность молибденового кофактора.
Тест на гомогентизиновую кислоту: алкаптонурия.
Тест с нитрозонафтолом: тирозинемия. Также положительный при фруктоземии и галактоземии.
КЛЮЧЕВЫЕ МЕТАБОЛИТЫ
Для многих групп наследственных болезней обмена веществ важным этапом дифференциальной лабораторной диагностики является измерение концентрации определенных метаболитов в различных биологических жидкостях (крови, плазме, цереброспинальной жидкости и моче). К этим соединениям относят глюкозу, молочную кислоту (лактат), пировиноградную кислоту (пируват), аммоний, кетоновые тела b-гидроксибутират и ацетоацетат), мочевую кислоту. Концентрация этих соединений изменяется при многих наследственных болезней обмена веществ, и их комплексная оценка позволяет разработать алгоритмы дальнейшей лабораторной диагностики.
Лактат и пируват
Концентрации лактата, пирувата, а также кетоновых тел являются важнейшими показателями нарушений энергетического обмена. Известно около 25 нозологических форм наследственных болезней обмена веществ, при которых наблюдается повышение уровня лактата в крови (лактат-ацидоз).
Лактат-ацидоз - состояние, при котором уровень молочной кислоты превышает 2,1 мм. Первичный лактат-ацидоз может быть связан с недостаточностью пируватдегидрогеназы (пируватдегидрогеназного комплекса), нарушениями дыхательной цепи митохондрий (подавляющее большинство форм), глюконеогенеза, обмена гликогена. Вторичный лактат-ацидоз наблюдается при некоторых органических ацидуриях, нарушениях митохондриального р-окисления, дефектах цикла мочевины. Концентрация этих метаболитов во многом зависит от физио-логического статуса (до или после пищевой нагрузки), также на уровень лактата оказывают влияние физическая нагрузка и даже стресс, связанный с процедурой взятия крови, особенно у детей раннего возраста. Все это необходимо учитывать при интерпретации биохимических данных. Соотношение концентрации лактат/пируват в крови является важным дифференциально-диагностическим критерием. Биохимически это соотношение отражает соотношение между восстановленной и окисленной формой никотинамиддинуклеотидов в цитоплазме - так называемый окислительный статус цитоплазмы.
Кетоновые тела
Кетоновые тела образуются в печени, их основным источником является b-окисление жирных кислот. Затем они переносятся в различные ткани организма. Соотношение кетоновых тел 3-гидроксибутират/ацетоацетат отражает окислительно-восстановительный статус митохондрий, так как их соот¬ношение связано исключительно с митохондриальным пулом никотинамиддинуклеотидов. b-гидроксибутират в плазме крови относительно стабилен, в отличие от ацетоацетата, который быстро распадается. Многие дефекты митохондриального b-окисления характеризуются низким уровнем кетоновых тел даже после продолжительного голодания, что связано с истощением продукции ацетил-КоА, являющегося основным предшественником кетоновых тел. При митохондриальных болезнях, связанных с дефектами дыхательной цепи митохондрий, наблюдается парадоксальная гиперкетонемия - уро-вень кетоновых тел после пищевой нагрузки значительно повышается (в норме наблюдается повышение концентрации кетоновых тел после продолжительного голодания).
Аммоний
При наследственных болезнях обмена веществ, протекающих по типу острой метаболической декомпенсации, важное значение имеет определение уровня аммония в крови. Значительное повышение аммония в крови наблюдается при наследственных болезнях обмена веществ, обусловленных нарушениями цикла мочевины и обмена органических кислот. При этих заболеваниях концентрация аммония повышается от 200 до 1000 мкм. Гипераммониемия является не только важным дифференциально-диагностическим признаком, но и требует неотложных терапевтических мероприятий, поскольку быстро приводит к тяжелому поражению головного мозга. Важно дифференцировать данное состояние от транзиторной гипераммониемии новорожденных, которая встречается у недоношенных новорожденных с высокими росто-массовыми показателями и клиническими симптомами поражения легких. Уровень аммония при этом состоянии не превышает 200 мкм. Концентрация аммония в крови может повышаться при тяжелом поражении печени. Нормальные значения концентрации аммония в крови: в неонатальный период - менее 110 мкм, у детей более старшего возраста - менее 100 мкм.
Глюкоза
Снижение уровня глюкозы в крови может наблюдаться при ряде наследственных болезней обмена веществ. Прежде всего это относится к нарушениям обмена гликогена и дефектам митохондриального р-окисления, при которых гипогликемия может быть единственным биохимическим изменением, выявляемым при стандартных лабораторных исследованиях. Физиологический ответ на снижение уровня глюкозы в крови - отмена выброса инсулина, выработка глюкагона и других регуляторных гормонов. Это приводит к образованию глюкозы из гликогена в печени и превращению белков в глюкозу в цепи глюконеогенеза. Также активируется липолиз, что приводит к образованию глицерина и свободных жирных кислот. Жирные кислоты транспортируются в митохондрии печени, где происходит их р-окисление и образуются кетоновые тела, а глицерин превращается в глюкозу в цепи глюконеогенеза. Дети имеют гораздо большую потребность в глюкозе, чем взрослые. Считают, что это связано с тем, что соотношение размера головного мозга к телу у детей выше, а головной мозг является основным потребителем глюкозы.
Кроме того, мозг взрослого человека более приспособлен к использованию кетоновых тел в качестве источника энергии, чем мозг ребенка. Именно по этим причинам дети более чувствительны к гипогликемическим состояниям, чем взрослые. При нарушениях обмена гликогена гипогликемия связана с невозможностью образования глюкозы из гликогена, поэтому она более выражена в периоды продолжительного голодания.
Большинство заболеваний из группы дефектов митохондриального b-окисления также сопровождаются снижением уровня глюкозы. Эта группа болезней относится к числу наиболее распространенных наследственных болезней обмена веществ. Причина гипогликемии связана с невозможностью использовать накопленные жиры в период голодания и истощением накопленного гликогена, который становится единственным источником глюкозы и соответственно метаболической энергии. Гипогликемия при дефектах митохондриального b-окисления, в отличие от гликогенозов, не сопровождается гиперкетонемией. Гипогликемия также может встречаться при галактоземии типа I, наследственной непереносимости фруктозы, недостаточности фруктозо-1,6-бифосфатазы.
Метаболический ацидоз
Метаболический ацидоз - одно из частых осложнений при инфекционных заболеваниях, тяжелой гипоксии, дегидратации и интоксикации. Наследственные болезни обмена веществ, манифестирующие в раннем детском возрасте, также нередко сопровождаются метаболическим ацидозом с дефицитом оснований.
Важнейшим критерием в дифференциальной диагностике метаболического ацидоза является уровень кетоновых тел в крови и моче, а также концентрация глюкозы. Если метаболический ацидоз сопровождается кетонурией, это указывает на нарушения метаболизма пирувата, разветвленных аминокислот, нарушения обмена гликогена. Дефекты митохондриального р-окисления, кетогенеза и некоторые нарушения глюконеогенеза не сопровождаются повышением уровня кетоновых тел в крови и моче. Наиболее частые наследственные болезни обмена веществ, протекающие с выраженным метаболическим ацидозом, - пропионовая, метилмалоновая и изовалериановая ацидемии. Нарушения метаболизма пирувата и дыхательной цепи митохондрий, манифестирующие в раннем возрасте, как правило, приводят к выраженному метаболическому ацидозу.
Мочевая кислота
Мочевая кислота - конечный продукт метаболизма пуринов. Пуриновые основания - аденин, гуанин, гипоксантин и ксантин - окисляются до мочевой кислоты. Мочевая кислота синтезируется преимущественно в печени, в кровеносном русле не связана с белками, поэтому практически вся подвергается фильтрации в почках. Повышение концентрации мочевой кислоты в моче строго коррелирует с увеличением ее уровня в плазме крови.
Повышенная продукция и экскреция мочевой кислоты (гиперурикемия и гипер- урикозурия) возникают в результате гиперактивности (уникальное явление среди наследственных болезней обмена веществ) или недостаточности ферментов, участвующих в синтезе пуринов de novo, сберегающих путях их метаболизма, или обусловлена нарушениями образования инозинмонофосфата из аденозинмонофосфата в цикле пуриновых нуклеотидов. Вторичная гиперурикемия также наблюдается при наследственной непереносимости фруктозы, недостаточности фруктозо-1,6-дефосфатазы, гликогенозах I, III, V, VII типа, недостаточности среднецепочечной ацетил-КоА-дегидрогеназы жирных кислот.
АНАЛИЗ МЕТАБОЛИТОВ С ПОМОЩЬЮ СПЕЦИАЛЬНЫХ МЕТОДОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА
Хроматографические методы анализа играют важнейшую роль в диагностике наследственных болезней обмена веществ. Современный арсенал хроматографических технологий чрезвычайно широк, что позволяет эффективно и информативно разделять сложные, многокомпонентные смеси, к которым относится и биологический материал. Для количественного анализа метаболитов при наследственных болезнях обмена веществ успешно применяют такие хроматографические методы, как газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография, хроматомасс-спектрометрия. Газовая хроматография и высокоэффективная газовая хроматография - самые универсальные методы разделения сложных смесей соединений, отличаются высокой чувствительностью и воспроизводимостью. В обоих случаях разделение осуществляется в результате различного взаимодействия компонентов смеси с неподвижной и подвижной фазами хроматографической колонки. Для газовой хроматографии подвижной фазой является газноситель, для высокоэффективной газовой хроматографии - жидкость (элюент). Выход каждого соединения фиксируется детектором прибора, сигнал которого преобразуется в пики на хроматограмме. Каждый пик характеризуется временем удерживания и площадью. Следует отметить, что газовая хроматография проводят, как правило, при высокотемпературном режиме, поэтому ограничением для ее применения является термическая неустойчивость соединений. Для высокоэффективной газовой хроматографии не существует подобных ограничений, так как в этом случае анализ проводят в мягких условиях. Хроматомасс-спектрометрия представляет собой комбинированную систему газовой хроматографии или высокоэффективной газовой хроматографии с масс-селективным детектором, что позволяет получать не только количественную, но и качественную информацию, т. е. дополнительно определяется структура соединений в анализируемой смеси.
Органические кислоты
В биохимической генетике термин «органические кислоты» относится к небольшим (молекулярная масса - менее 300 кДа), растворимым в воде карбоновым кислотам, которые являются промежуточными или конечными продуктами мета-болизма аминокислот, углеводов, липидов и биогенных аминов.
Для определения органических кислот применяют разнообразные хроматографические методы: высокоэффективную жидкостную хроматографию, хроматомасс-спектрометрию и высокоэффективную газовую хроматографию с последующей тандемной масс-спектрометрией. Более 250 различных органических кислот и глициновых конъюгатов можно обнаружить в образце мочи. Их концентрация зависит от диеты, приема лекарственных препаратов и некоторых других физиологических причин. Известно около 65 наследственных болезней обмена веществ, которые характеризуются специфическим профилем органических кислот. Относительно небольшое количество органических кислот высокоспецифичны, наличие их в больших концентрациях в моче позволяет точно установить диагноз: сукцинилацетон при тирозинемии типа I, N-ацетиласпартат при болезни Канавана, мевалоновая кислота при мевалоновой ацидурии. В подавляющем большинстве случаев диагноз наследственных болезней обмена веществ на основании только анализа органических кислот мочи установить довольно трудно, поэтому требуется дополнительная, подтверждающая диагностика.
Интерпретация результатов анализа органических кислот мочи представляет определенные проблемы как из-за большого количества экскретируемых кислот и их производных, так и из-за наложения профилей некоторых лекарственных метаболитов. Для точной диагностики данные, полученные при анализе органических кислот, должны коррелировать с клинической характеристикой заболевания и быть подтверждены результатами других лабораторных методов анализа (анализа аминокислот, лактата, пирувата, ацилкарнитинов в крови, активностью ферментов и молекулярно-генетическими данными).
Концентрация органических кислот при наследственных болезнях обмена веществ характеризуется достаточно широким диапазоном - от повышения их уровня в несколько сотен раз до незначительного превышения, близкого к нормальному. Например, при глутаровой ацидурии типа I уровень глутаровой кислоты у некоторых больных может находиться в пределах нормы; при недостаточности среднецепочечной ацетил-КоА-дегидрогеназы жирных кислот концентрация адипиновой, себациновой и субериновой кислот может быть в пределах нормы. Обнаружить аномальный профиль органических кислот мочи иногда бывает возможно только у пациентов в стадии метаболической декомпенсации. Особенно это характерно для доброкачественных, мягких форм заболеваний, которые, как правило, поздно манифестируют.
Аминокислоты и ацилкарнитины
Определение концентрации аминокислот и ацилкарнитинов проводят методом тандемной масс-спектрометрии. Масс-спектрометрия - аналитический метод, с помощью которого можно получать как качественную (структура), так и количественную (молекулярная масса или концентрация) информацию анализируемых молекул после их преобразования в ионы. Существенное отличие масс-спектрометрии от других аналитических физико-химических методов состоит в том, что в масс-спектрометре определяется непосредственно масса молекул и их фрагментов. Результаты представляются графически (так называемый масс-спектр). Иногда невозможно анализировать многокомпонентные, сложные смеси молекул без их предварительного разделения. Разделить молекулы можно либо хроматографически, либо использовать два последовательно соединенных масс-спектрометра - тандемная масс-спектрометрия. Метод тандемной масс-спектрометрии впервые был применен в 70-х гг. прошлого века и нашел применение в химии, биологии и медицине. Этот метод применяют для выяснения структуры неизвестных веществ, а также для анализа комплексных смесей с минимальной очисткой образцов.
Перед масс-спектрометрическим анализом необходимо превращение нейтральных частиц вещества в заряженные ионы, а также перевод их из жидкого состояния в газообразное. Для этой цели сначала применяли метод ионизации бомбардированием быстрыми атомами, в последнее время предпочтение отдается методу ионизации в электроспрее. С появлением новых методов ионизации применение тандемной масс-спектрометрии в области аналитической биохимии стало более доступным. Впервые анализ ацилкарнитинов с помощью тандемной масс-спектрометрии выполнили Дэвид Миллингтон и соавт., применившие химическую дериватизацию биологических образцов для образования бутиловых эфиров ацилкарнитинов. В 1993 г. Дональд Чейз и соавт. адаптировали этот метод для анализа аминокислот в высушенных пятнах крови, сформировав, таким образом, основу для скрининга множества компонентов при наследственных болезнях обмена веществ. В дальнейшем метод был адаптирован к проведению крупномасштабных анализов, необходимых для неонатального скрининга.
Тандемная масс-спектрометрия-анализ наиболее эффективен для соединений, имеющих сходные дочерние ионы или нейтральные молекулы, например для анализа аминокислот и ацилкарнитинов. Необходимо также подчеркнуть возможность МС/МС-анализа различных химических групп в одном анализе за очень короткое время (~2 мин). Это обеспечивает широкий спектр анализов и высокую пропускную способность, что экономически выгодно для скрининга на большое количество заболеваний. На основании повышения концентрации определенных ацилкарнитинов можно заподозрить заболевания из группы нарушений митохондриального р-окисления по изменению профиля аминокислот - аминоацидопатии. С помощью тандемной масс-спектрометрии можно детектировать посторонние метаболиты желчных кислот, появляющихся при нарушениях метаболизма холестерина и липидов, желчных кислот, а также при дефектах биогенеза пероксисом. При различных холестатических гепатобилиарных нарушениях (хроническом заболевании печени неизвестной этиологии, синдроме Цельвегера, недостаточности пероксисомного бифункционального белка, тирозинемии типа I, билиарной атрезии, прогрессивном фамильном внутрипеченочном холестазе неопределенного типа) с помощью тандемной масс-спектрометрии можно определять концентрации конъюгированных желчных кислот в различных биологических жидкостях.
Описаны методы определения очень длинноцепочечных жирных кислот: эйкозановой (С20:0), докозановой (С22:0), тетракозановой (С24:0), гексакозановой (С26:0), а также фитановой и пристановой кислот - с помощью тандемной масс-спектрометрии в плазме и пятнах крови, потенциально годные для скрининга многих пероксисомных болезней.
Диагностика нарушений метаболизма пуринов и пиримидинов (недостаточности пуриннуклеозидфосфорилазы, орнитинтранскарбамилазы, молибденового кофактора, аденилосукциназы, дегидропиримидиндегидрогеназы) основана на присутствии аномальных метаболитов или отсутствии нормальных метаболитов в сыворотке, моче или клетках крови. Так, разработаны быстрые методы тандемной масс-спектрометрии, позволяющие количественно определять от 17 до 24 пуринов и пиримидинов в моче в одном анализе.
Тандемную масс-спектрометрию также можно использовать для исследования других классов метаболитов. Так, разработан новый метод тандемной масс-спектрометрии измерения тотального гексозмонофосфата в пятнах крови, маркера галактозо-1-фосфата, который можно использовать при скрининге на галактоземию.
Определение катехоламинов в моче является важным для диагностики нарушения метаболизма катехоламинов и нейротрансмиттеров. Значительными недостатками существующих методов являются долгое время анализа и возможная интерференция лекарств и их метаболитов, структурно схожих с катехоламинами. Новые методы в комбинации с пробоподготовкой, специфичной к соединениям, содержащим катехольные группы, позволяет быстро диагностировать эту группу заболеваний, исключая недостатки ВЭЖХ-методов.
Исследование белков
Подавляющее большинство наследственных болезней обмена веществ обусловлено нарушением активности ферментов, поэтому в диагностике этих заболеваний выявление снижения активности специфических ферментов является важнейшим, а иногда и единственным надежным методом подтверждения диагноза.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
В настоящее время пост- и пренатальная диагностика многих наследственных болезней обмена веществ (прежде всего это относится к лизосомным болезням накопления) осуществляется с помощью методов анализа ферментативной активности. Материалом для измерения активности ферментов при наследственных болезнях обмена веществ являются прежде всего лейкоциты периферической крови: практически при всех лизосомных болезнях накопления, метилмалоновой ацидурии, некоторых гликогенозах. Для диагностики GM2- ганглиозидозов, недостаточности биотинидазы используют плазму или сыворотку крови. В некоторых случаях объектами исследования являются мышечная или печеночная ткань, культура кожных фибробластов.
Субстраты для ферментов могут быть хромогенными, флюорогенными, содержать радиоактивную метку. Для измерения активности ферментов применяют спектрофотометрический, флюориметрический и методы измерения радиоактивности. Общий принцип применения флюорогенных субстратов состоит в том, что субстрат представляет собой химическое производное флюорохрома, неспособное к флюоресценции в исходном состоянии, но под действием молекул соответствующих ферментов субстрат каталитически расщепляется с высвобождением флюорохрома, флюоресценцию которого можно измерить. Спектрофотометрические методы позволяют измерять поглощение продуктами ферментативной реакции, полученными после внесения хромогенных субстратов. Для многих ферментов (например, дегидрогеназ) образующиеся продукты реакции могут быть хромогенными. Имеется достаточно много флюорогенных субстратов для исследования различных ферментов: эстераз разной специфичности, пероксидаз, пептидаз, фосфатаз, сульфатаз, липаз и др. Радиоактивно-меченые субстраты применяют в диагностике органических ацидурий, дефектов митохондриального Р-окисления, нарушениях метаболизма углеводов, лизосомных болезнях накопления.
Для каждой ферментативной реакции необходимы определенные условия: pH и состав буферной смеси, специфический субстрат(-ы), наличие активаторов и кофакторов, температурный режим и т. д. Практически каждая клетка содержит свой набор ферментов, поэтому их распределение в тканях значительно варьирует. Многие ферменты представлены в тканях различными формами (изоферментами). В большинстве случаев это связано с наличием полипептидных субъединиц, которые, соединяясь, формируют разные изоферменты. Распределение изоферментов может варьировать от ткани к ткани. Некоторые ферменты встречаются только в определенном органе или ткани.
Лизосомные болезни накопления
Определение активности ферментов является «золотым стандартом» подтверждающей диагностики лизосомных болезней накопления. Для анализа активности ферментов используют хромогенные и флюорогенные субстраты. Флюорогенные субстраты на основе 4-метилумберифелона всегда очень чувствительны; с их помощью можно определять активность ферментов даже в микроколичествах биологического материала (пятнах высушенной крови). Как правило, активность ферментов у пациентов с лизосомными болезнями накопления составляет менее 10% нормы, и при биохимическом тестировании постановка точного диагноза не составляет значительных затруднений. Существует ряд факторов, затрудняющих интерпретацию биохимических исследований. Один из них - наличие аллелей «псевдонедостаточности», которые приводят к изменениям структуры фермента и не позволяют белку адекватно расщеплять искусственный субстрат in vitro, при этом с естественным субстратом данный фермент не показывает снижения активности. Это явление описано для арилсульфатазы А, р-галактозидазы, p-глюкоронидазы, а-идуронидазы, а-галактозидазы, галактоцереброзидазы.
Исследование мутантных генов
Развитие методов молекулярной биологии явилось настоящей революцией в области клинической биохимии. Разработка стандартных протоколов молекулярных исследований и автоматизация используемых методов сегодня - законченный комплекс диагностических подходов, который может стать рутинной процедурой в клинических лабораториях. Быстрое развитие исследований в области расшифровки генома человека и определение ДНК-последовательности генов делает возможной ДНК-диагностику различных наследственных заболеваний. Методы ДНК-диагностики, анализа структуры нормальных генов и их мутантных аналогов при наследственных болезнях обмена начали использовать в течение последнего десятилетия.
Для ДНК-диагностики наследственных заболеваний используют два основных подхода - прямую и косвенную ДНК-диагностику. Прямая ДНК-диагностика представляет собой исследование первичной структуры поврежденного гена и выделение мутаций, ведущих к заболеванию. Для детекции молекулярных повреждений в генах, обусловливающих наследственные болезни, используют стандартный арсенал методов молекулярной биологии. В зависимости от характеристики и типов мутаций, распространенности при различных наследственных заболеваниях те или иные методы являются более предпочтительными.
Для диагностики наследственных болезней обмена веществ в тех случаях, когда биохимический дефект точно известен, легко и достоверно определяем с использованием биохимических методик, ДНК-методы вряд ли займут приоритетное место. В этих случаях применение ДНК-анализа является скорее научно-исследовательским, а не диагностическим подходом. После точно установленного диагноза методы ДНК-анализа будут полезны для последующей пренатальной диагностики, идентификации гетерозиготных носителей в семье и прогноза заболевания у гомозигот, а также для отбора больных в целях проведения казуальной терапии в будущем (ферментозаместительной и генотерапии). Также в случаях, когда биохимический дефект точно не известен, биохимическая диагностика затруднена, недостаточно достоверна или требует инвазивных методов исследования, метод ДНК-диагностики - единственный и незаменимый для точной постановки диагноза.
В общем виде тактика проведения диагностики наследственных болезней обмена веществ в каждом конкретном случае должна планироваться совместно с врачом-биохимиком и врачом-генетиком. Необходимыми условиями успешной и быстрой диагностики являются понимание этиологии, механизмов патогенеза заболевания, знание специфических биохимических маркеров.
Лабораторный контроль качества
Одна из важнейших составляющих любой лабораторной диагностики - посто-янный контроль качества проводимых исследований. В такой сложной и многогранной области, как наследственные болезни обмена веществ, внешний и внутренний контроль качества приобретает особое значение. Это связано с тем, что лаборатория имеет дело с редкими заболеваниями, и, как правило, приобрести опыт по диагностике каждой из болезней в достаточном количестве не представляется возможным. Кроме того, лабораторное оборудование и методические подходы могут различаться между разными лабораториями.
Классификация 22 подкласса в зависимости от пораженного метаболического пути Подклассы:частота Аминоацидопатии 31% Органические ацидурии 27% Дефекты цикла мочевины 21% Дефекты дыхательной цепи митохондрий 12% Гликогенозы 8% Дефекты митохондриального в-окисления 8% Перокисомные заболевания 4%
Аутосомно-рецессивный тип наследования Фенилкетонурия1:8 000 Болезнь Тея-Сакса 1: (среди евреев-ашкенази)1:3 000 Болезнь Гоше1: Болезнь Краббе1: Х-сцепленный рецессивный тип наследования Х-сцепленная адренолейкодистрофия1: Мукополисахаридоз тип II1: Аутосомно-рецессивный тип наследования Фенилкетонурия1:8 000 Болезнь Тея-Сакса 1: (среди евреев-ашкенази)1:3 000 Болезнь Гоше1: Болезнь Краббе1: Х-сцепленный рецессивный тип наследования Х-сцепленная адренолейкодистрофия1: Мукополисахаридоз тип II1: Частота встречаемости ЗаболеванияЧастота
Зачем выявлять НБО? НБО – небольшое число крайне редких моногенных заболеваний. Подавляющее большинство- неизлечимы НБО – обширный класс редких моногенных болезней, суммарная частота которых высока (не менее чем 1:5000 живых новорожденных). Многие из НБО поддаются лечению. Для некоторых возможно полная клиническая коррекция. При точно установленном диагнозе возможно проведение дородовой (пренатальной) диагностики в семье.
Хроматографические методы, применяемые в диагностике НБО Аминокислоты АКА,ВЭЖХ Аминоацидопатии Органические кислоты ГХ-МС Органические ацидурии, Аминоацидопатии Пурины/пиримидины ВЭЖХ Нарушения обмена пуринов/пиримидинов ОДЦЖК, фитановая, кислота, плазмологены ГХ-МС Пероксисомные б-ни Метаболиты холестерина ГХ-МС Синдром СЛО Катехоламины, аминокислоты ВЭЖХ Болезни нейротрансмиттерного обмена Моно- и дисахаридыВЭЖХ Нарушения углеводного обмена гормоны ВЭЖХ Наследственные эндокринопатии Карнитин и его эфиры ГХ-МС нарушения митохондриального в- окисления
Тандемная масс спектрометрия- современная технология диагностики НБО Позволяет анализировать большое число метаболитов, а значит выявлять большое число наследственных нарушений обмена веществ Время анализа одного образца- несколько минут Требуется небольшое количество биологического материала (пятно высушенной крови)
Контроль m/z, amu 50 % Intensity 100 ВНУТРЕННИЕ СТАНДАРТЫ Gly Ala Val Leu Met Cit Phe Tyr Glu Gly Ala Ser Pro Val Leu + Ile Gln Tyr Phe Glu Asp Аминокислоты
Болезнь с запахом кленового сиропа мочи m/z, amu 50 % Intensity 100 ВНУТРЕННИЕ СТАНДАРТЫ Gly Ala Val Leu Met Cit Phe Tyr Glu Gly Ala Ser Pro Val Leu + Ile Gln Tyr Phe Glu Asp
Тирозинемия m/z, amu 50 % Intensity 100 ВНУТРЕННИЕ СТАНДАРТЫ Gly Ala Val Leu Met Cit Phe Tyr Glu Gly Ala Ser Pro Val Leu + Ile Gln Tyr Phe Glu Asp
M/z, amu % Intensity C3C3 ВНУТРЕННИЕ СТАНДАРТЫ C4C4 C5C5 C8 C16 Глутаровая ацидурия тип 1 C6C6 C18 C10 C12 C14 С5DC
Тандемная-масс спектрометрия Тандемная-масс спектрометрия Дефекты β-окисления Недостаточность SCAD Недостаточность MCAD (1:8000) Недостаточность VLCAD Недостаточность LCAHD Недостаточность CPT1 Недостаточность CPT2 Другие дефекты β-окисления Органические ацидурии Глютаровая ацидурия тип 1 (1:30 000) Пропионовая ацидемия (1:50 000) Метилмалоновая ацидурия (1:48 000) Изовалериановая ацидурия (1:50 000) Аминоацидопатии Лейциноз (1:) ФКУ (1:8000) Тирозинемия тип 1 (1:) Некетотическая Гиперглицинемия (1:55 000) Цитрулинемия (1:)
ДНК-диагностика Диагностика носительства заболеваний (крайне важно для Х-сцепленных форм болезней и заболеваний частых в определенных этнических группах) Диагностика заболеваний с неизвестным первичным биохимическим дефектом Диагностика заболеваний при которых биохимические методы сложные и требуют проведения инвазивных процедур (например биопсия печени) Пренатальная диагностика Предимплантационная диагностика
-- [ Страница 2 ] --
Материалы диссертации применяются в учебном процессе на кафедре медицинской генетики с курсом пренатальной диагностики Государственного бюджетного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации, а также при подготовке клинических ординаторов в ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН.
Личное участие диссертанта.
Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора. Автором были сформулированы цель и задачи исследования, разработаны методические подходы к диагностике различных классов НБО. Сбор первичных данных и проведение лабораторных исследований проведены лично автором или при его непосредственном участии, обработка, анализ и обобщение полученных результатов при написании и оформлении рукописи выполнены лично автором.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 64 научные работы, в том числе 43 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ, методические рекомендации для врачей, патент «Биочип для определения мутаций в гене галактоза-1-фосфат-уридил трансферазы, вызывающих поражение печени у новорожденных детей» № 2423521 от 27.10.2009, 1 руководство для врачей, 2 главы в «Педиатрия: национальное руководство», 1 глава в «Неврология: национальное руководство», 3 главы в «Наследственные болезни: национальное руководство», 1 глава в «Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство».
Структура и объем работы.
Диссертационная работа изложена на 254 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав с описанием методики и результатов исследования, заключения, выводов, библиографии из 288 источников (в том числе 30 на русском и 258 на иностранном языках) и 4 приложений. Работа содержит 40 рисунков и 52 таблицы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Характеристика выборок и материала для исследований.
В основу работы положены результаты исследований, проведенных в лаборатории наследственных болезней обмена веществ в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (лаб.НБО ФГБУ «МГНЦ» РАМН). Для оценки нозологической структуры группы ЛБН, проведен анализ 902 случаев ЛБН, которые были диагностированы в лаборатории с 1992 - 2009гг. Характеристика относительной частоты подклассов НБО проведена на выборке из 370 пациентов, выявленных при обследовании 9875 пациентов, направленных с подозрением на НБО научно-консультативного отдела ФГБУ «МГНЦ» РАМН, отделений неврологии и эндокринологии ФГБУ «Российская детская клиническая больница» Министерства Здравоохранения РФ, Клиники нервных болезней им. А.Я.Кожевникова Московского Государственного Медицинского Университета им. И.М. Сеченова, ФГБУ «Эндокринологический научный центр Министерства Здравоохранения РФ», ФГБУ «Научный Центр здоровья детей и подростков» РАМН, ФГБУ "Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава России", региональных медико-генетических консультаций.
Частота ЛБН в Центральном Федеральном округе России, рассчитана по числу новых случаев заболеваний диагностированных в лаборатории НБО ФГБУ «МГНЦ» РАМН за период 2000-2009гг. Данные по числу живых новорожденных за этот период по регионам Российской федерации получены по данным Росстата на сайте: (http://gks.ru/wps/wcm/connect/rosstat/). Для расчета частоты применен метод, описанный Poorthuis B.J. с соавт. (1999). Частота рассчитывалась как общее число диагностированных пациентов по отношению к общему числу новорожденных в этот же период (при этом период рождения являлся интервалом между годом рождения старшего пациента и годом рождения младшего пациента в выборке). Если за указанный период был выявлен только один пациент, то учитывалось общее число новорожденных за эти годы.
Образцы пятен крови (n=113), а также данные по концентрации тотальной галактозы в крови у новорожденных с подозрением на галактоземию предоставлены Московским центром неонатального скрининга. Для селективного скрининга на НБО методом МС/МС проанализированы 500 образцов пятен новорожденных из Московского Центра неонатального скрининга и 5205 пациентов из психо-неврологических отделений крупных детских клинических стационаров: ФГБУ «Российская детская клиническая больница» Министерства Здравоохранения РФ, ФГБУ «Научный Центр здоровья детей и подростков» РАМН. Для отбора пациентов на селективный скрининг применены общепринятые критерии, разработанные ранее (Краснопольская К.Д., 2000).
Материалом для биохимической диагностики являлись плазма гепаринизированной венозной крови и/или образцы утренней мочи.
В качестве материала для молекулярно-генетических исследований использованы образцы ДНК, выделенные из цельной крови или пятен высушенной крови на фильтрах.
Экспериментальные методы.
Анализ аминокислот и ацилкарнитинов проведен на квадрупольном тандемном масс-спектрометре PE Sciex API 2000 (PE Sciex, Онтарио, Канада) с положительной ионизацией в электроспрее. Пробоподготовка для анализа аминокислот и ацилкарнитинов методом МС/МС проведена с помощью набора «NeoGram Amino Acids and Acylcarnitines Tandem Mass Spectrometry Kit» (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Wallac OY, Finland).
Газовая хроматография – масс-спектрометрия выполнена на приборе HP5972A, колонка HP-5MS (30м*0,25мм*4 мкм). Концентрация органических кислот в моче определяли в виде триметилсилиловых эфиров.
Для определения активности фермента Г-1-ФУТ использован модифицированный флюориметрический тест Бутлера (Beutler E., 1968).
Для молекулярно-генетического анализа геномную ДНК из цельной крови и пятен крови на фильтрах выделяли, используя набор реактивов Diatom DNA Prep (ООО Биоком, Россия) по методике, рекомендованной изготовителем. Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере “МС2” (АО “ДНК-Технология”, Москва).
Для каждой пары праймеров подобраны условия, отличающиеся необходимой температурой отжига и концентрацией MgCl2. Анализ частых мутаций проводили методами ПЦР, рестрикционного анализа, гель-электрофореза, используя олигонуклеотидный праймеры, последовательности которых подобраны на основании нуклеотидной последовательности генов, опубликованных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Поиск мутаций в генах проведен методом автоматического секвенирования фрагментов ДНК согласно протоколу фирмы производителя на приборе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems).
Статистическая обработка результатов исследований
Оценка статистической значимости результатов проведена с использованием методов параметрической и непараметрической статистики для множественных сравнений. Анализу данных предшествовала проверка распределений значений показателей на соответствие их критериям «нормальности». В случае нормального распределения применен однофакторный дисперсионный анализ ANOVA или ANOVA для повторных измерений, в противном случае – критерий Крускала-Уоллиса и/или критерий Ньюмана-Кейлса. Обработка результатов осуществлена с помощью программного обеспечения Excel 2000, Statistica 6.0
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Спектр и относительные частоты отдельных подклассов НБО
В общей совокупности в лаборатории НБО проводится диагностика 157 различных форм заболеваний, что составляет около 30% от всех известных НБО. За период 2004-2009гг обследовано 9875 пациентов с подозрением на НБО, выявлено 48 различных нозологических форм из 10 различных подклассов НБО у 370 пациентов.
Результаты проведенного анализа показали, что наиболее распространенными формами НБО в обследуемой выборке являются ЛБН (n=177 – 48%) и МБ (n=69 – 19%), которые в совокупности составляют более половины всех случаев (рис. 1).
Болезни, связанные с нарушением обмена аминокислот, органических кислот и дефектами митохондриального -окисления составляют 2%, 7%, 4%, соответственно (в расчет не включены случаи фенилкетонурии).
По данным зарубежных лабораторий относительные доли заболеваний этих классов более существенны, чем в нашей выборке, что указывает на необходимость совершенствования методов их диагностики.
Рис 1. Относительные частоты отдельных подклассов НБО в исследуемой выборке.
Примечание: МБ-митохондриальные болезни, ОА- органические ацидурии, АА-аминоацидопатии, УГ-нарушения обмена углеводов, ЛБН-лизосомные болезни накопления, ПБ-пероксисомные болезни,в-окисление- дефекты митохондриального -окисления жирных кислот
Анализ нозологической структуры наиболее представленных подклассов НБО
Для оценки нозологической структуры группы ЛБН, проведен анализ 902 случаев ЛБН, которые были диагностированы в лаборатории с 1992 гг- 2009гг. За этот период было установлено 25 различных форм ЛБН. Проведенный анализ показывает, что самыми частыми являются мукополисахаридозы и липидозы (сфинголипидозы и ганглиозидозы), которые составляют существенную долю всех диагностированных случаев ЛБН. В группе сфинголипидозов самой частой формой заболевания является болезнь Гоше (рис. 2). Сходная тенденция наблюдается и в других странах Европы – Чехии, Австралии и Германии.
Для оценки нозологической структуры группы МБ, проведен анализ 176 случаев МБ, которые диагностированы в лаборатории с 2004 -2009гг. Выбранный временной интервал соответствует началу диагностики данных заболеваний в лаборатории НБО ФГБУ «МГНЦ» РАМН. В группе МБ наиболее часто встречаются заболевания, связанные с мутациями мтДНК, среди них превалируют мутации, приводящие к синдрому Лебера (n=62).
Рис. 2. Относительная частота нозологических форм в выборке больных с ЛБН
Примечание: Б.Гоше- болезнь Гоше, МЛД- метахроматическая лейкодистрофия, МПС- мукополисахаридоз, НЦЛ2- нейрональный цероидный липофусциноз тип 2, МЛII/III- муколипидоз II/III типа, Б.Краббе- болезнь Краббе
В нашем исследовании было зарегистрировано большое число случаев (n=34), связанных с мутациями гена SURF1, что приводит к недостаточности цитохром с оксидазы (IV комплекса дыхательной цепи митохондрий). Мутации этого гена являются причиной одной из частых форм МБ, дебютирующих в детском возрасте - синдрома Ли.
Частота заболеваний из группы лизосомных болезней накопления в России (Центральный федеральный округ)
ЛБН - одна из наиболее многообразных и хорошо изученных групп НБО, которая включает более 45 различных нозологических форм. Подтверждающей лабораторной диагностикой ЛБН лаборатории НБО ФГБУ «МГНЦ» РАМН занимается с 1982 года и является единственной в РФ лабораторией, осуществляющей точную диагностику большинства ЛБН. В лабораторию поступают образцы из всех регионов РФ, но в настоящем исследовании учтены только больные, проживающие в Центральном Федеральном округе (ЦФО), которым был установлен диагноз в лаборатории в период с 2000 по 2009гг (табл. 1). Это связанно с географической близостью к г. Москве и достаточно высоким уровнем медико-генетической помощи в данном регионе.
Суммарная частота заболеваний группы ЛБН определена в разных странах Европы и составляет от 7,6 до 25 на 100 000 новорожденных (Meikle P.J. et al., 1999; Poorthuis B.J. et al., 1999; Applegarth D.A. et al., 2000; Dionisi-Vici С. et al., 2002; Pinto R. et al., 2004). В РФ подобные исследования не проводились.
Проведенный анализ показывает, что суммарная частота ЛБН в РФ (ЦФО) составляет 5,22: 100 000 новорожденных (1:19937), в других странах Европы значение примерно в 2-3 раза выше, однако следует учитывать, что все эти заболевания чрезвычайно редкие и случайная вариация в оценке их частоты очень высока, что отражает минимальное и максимальное пороговое значение при 95% доверительном интервале а также различные подходы к расчету.
Наибольшая частота показана для следующих нозологических форм: болезнь Гоше -0,93 (95% ДИ 0,790-1,070), МПС I типа - 0,82 (95% ДИ 0,552-1,089), МПС II типа -0,74 (95% ДИ 0,478-1,075), GM1-ганглиозидоз -0,58 (95% ДИ 0,117-1,052). Следует отметить, что в отличие от других стран в РФ диагностированы лишь единичные случаи болезни Ниманна-Пика тип С (n=3), болезни Помпе (n=5), что в совокупности также влияет на общую частоту ЛБН. В группе МПС наблюдается меньшее число случаев МПС III типа, по сравнению с другими странами.
Таблица 1. Частота некоторых форм ЛБН на 100 000 новорожденных.
Заболевание | Германия | Австралия | Нидерланды |
||
МПС (общее) | |||||
Болезнь Гоше | |||||
GM1-ганглиозидоз | |||||
Болезнь Краббе | |||||
Сфинголипидозы | |||||
ЛБН (общее) |
