Весь путь развития В-лимфоцитов от полипотентной стволовой кроветворной клетки до образования синтезирующих антитела плазматических клеток и В-клеток памяти включает антигеннезависимую и антигензависимую стадиидифференцировки . Антигеннезависимая дифференцировка В-лимфоцитов происходит в костном мозге, в ее основе лежит перестройка генов иммуноглобулинов, приводящая к формированию клонов В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности рецепторные иммуноглобулины различной специфичности. В процессе антигензависимой дифференцировки в периферических лимфоидных органах происходит активация В-лимфоцитов в результате распознавания соответствующих антигенов с помощью иммуноглобулиновых антигенраспознающих рецепторов (ВКР); их пролиферация и дифференцировка в плазматические клетки, синтезирующие антитела, и В-клетки памяти. На этой стадии происходит также реарранжировка генов иммуноглобулинов, приводящая к синтезу разных изотипов иммуноглобулинов.
Образование В-лимфоцитов начинается в эмбриогенезе и продолжается в течение всей жизни. В эмбриональном периоде В-лимфоциты образуются в желточном мешке, эмбриональной печени и в эмбриональном костном мозге. После рождения единственным источником В-лимфоцитов у млекопитающих и человека является костный мозг.
Основные этапы дифференцировки В-лимфоцитов
Схема, отражающая основные этапы дифференцировки В-лимфоцитов, представлена на рис.19.
Рисунок 19. Основные этапы дифференцировки В-лимфоцитов
· СКК – стволовая кроветворная клетка костного мозга;
· ЛСК – лимфоидная стволовая клетка (общий предшественник лимфопоэза);
· пВ – предшественник В-лимфоцитов;
· В 0 –лимфоциты;
· В 1 – лимфоциты (наивные В-лимфоциты);
· В 2 – лимфоциты;
Родоначальником В-лимфоцитов, как и других клеток крови, является полипотентная стволовая кроветворная клетка костного мозга (СКК). Через стадию лимфоидной стволовой клетки (ЛСК) – общего предшественника всех (Т- и В-) лимфоцитов – происходит формирование предшественников В-лимфоцитов (пВ), которые затем превращаются в незрелые В 0 -лимфоциты. Эта дифференцировка происходит в костном мозге без взаимодействия с антигенами.
Предшественники В-лимфоцитов образуются из лимфоидных стволовых клеток под влиянием микроокружения костномозговых стромальных клеток. Стромальные клетки поддерживают процесс развития пВ-клеток путем прямых межклеточных взаимодействий с помощью различных молекул клеточной адгезии (VLA-4, VCAM-1 и др.), а также с помощью поверхностных молекул стромальных клеток, таких как SCF (фактор стволовых клеток). Стромальные клетки костного мозга секретируют также целый ряд цитокинов: ИЛ-3,4,6, а также ИЛ-7, который поддерживает процесс развития пВ-клеток на ранних этапах их развития.
В 0 -лимфоциты мигрируют затем через кровоток и заселяют тимуснезависимые зоны периферических лимфоидных органов. Там происходит дальнейшее созревание и дифференцировка В-лимфоцитов до стадии В 1 и В 2 и приобретение ими способности к синтезу всех классов иммуноглобулинов в ответ на поступающие в организм антигены.
В 0 -лимфоциты – это популяция иммунологически незрелых В-лимфоцитов. На их поверхности имеются только антигенраспознающие рецепторы, относящиеся к классу IgМ . Однако плотность этих рецепторов на единицу поверхности клеток очень низка, поэтому они не могут обеспечить эффективного взаимодействия с антигеном и не синтезируют IgМ в периферическую кровь. Стадия В 0 соответствует моменту формирования клонов В-лимфоцитов. Клон В-лимфоцитов – это группа В-лимфоцитов, имеющих на своей поверхности иммуноглобулиновые рецепторы одной специфичности. На стадии В 0 костномозговые В-лимфоциты проходят негативную селекцию , в результате которой аутореактивные клоны В-лимфоцитов погибают от апоптоза или подвергаются рецепторному редактированию , что лишает их иммуноглобулиновые рецепторы способности к взаимодействию с собственными антигенами. Эти процессы лежат в основе формирования центральной В-клеточной толерантности .
Незрелые В 0 -лимфоциты, которые покидают костный мозг и выходят на периферию, называются еще транзиторными В-лимфоцитами . При контакте с антигенами на периферии функционально незрелые транзиторные В-лимфоциты вступают в состояние анергии или погибают от апоптоза.
В 1 -лимфоциты – это наивные В-лимфоциты , которые еще не встречались с антигеном, они обладают довольно короткой продолжительностью жизни (от 5-6 дней до 3-4 месяцев). Если наивные В 1 -лимфоциты не встретятся с соответствующим им по специфичности антигеном, они погибают, так как не смогут стать резидентными, находящимися в лимфоидных фолликулах В 2 -лимфоцитами.
На поверхности В 1 -лимфоцитов экспрессируются одновременно IgМ и IgD одной и той же антигенной специфичности, но IgD- рецепторы на В 1 -лимфоцитах представлены в гораздо меньшей степени. Хотя IgD является характеристическим поверхностным маркером зрелых наивных В-лимфоцитов, его функция пока не выяснена, однако доказана необходимость наличия IgD для развития В-лимфоцитов и их ответа на большинство антигенов. Плотность рецепторного IgM на единицу поверхности В 1 -клеток значительно выше, чем на стадии В 0.
При встрече с соответствующим им по специфичности антигеном наивные В 1 -лимфоциты распознают его с помощью ВКР, активируются и вступают в пролиферацию с последующей дифференцировкой в плазматические клетки, синтезирующие антитела. Однако В 1 -лимфоциты могут непосредственно реагировать преимущественно на тимуснезависимые антигены синтезом IgМ. Примированные антигеном В 1 -лимфоциты – это уже полностью зрелые В-клетки, но еще не перешедшие в стадию В 2 и не ставшие резидентными фолликулярными В-лимфоцитами.
В 2 -лимфоциты (называемые еще фолликулярными В-лимфоцитами , или В-2-лимфоцитами ) образуются из примированных В 2 -лимфоцитов и находятся главным образом в фолликулах лимфоузлов и других лимфоидных органов, где контактируют с антигеном, представленным на поверхности АПК. Затем они пролиферируют, образуя зародышевые центры фолликулов и дифференцируются в плазматические клетки, синтезирующие антитела. В 2 -лимфоциты – это большая по численности популяция, состоящая из зрелых иммунокомпетентных клеток. На поверхности В 2 -лимфоцитов в высокой концентрации экспрессируется иммуноглобулин D (дифференцировочный), а также содержатся антигенраспознающие рецепторы, относящиеся ко всем классам иммуноглобулинов. В 2 -лимфоциты способны реагировать на любые антигены (как тимуcнезависимые, так и тимусзависимые) и осуществлять синтез иммуноглобулинов всех классов, что составляет основу вторичного гуморального адаптивногоиммунного ответа. Они требуют для своей активации помощи со стороны Т-хелперов, взаимодействие с которыми осуществляется в лимфоидных фолликулах как при непосредственном контакте этих клеток, так и с помощью синтезируемых Т-хелперами цитокинов (ИЛ-2, IFN-γ, ИЛ-4, ИЛ-5 и др.).
Сигналы от Т-хелперов индуцируют в фолликулярных В 2 -лимфоцитах переключение изотипов иммуноглобулинов, что обеспечивает продукцию антител с оптимальными свойствами, необходимыми для борьбы с данным антигеном. В процессе развития иммунного ответа средняя аффинность продуцируемых антител возрастает (процесс, называемый аффинным созреванием). Это происходит потому, что в процессе пролиферации отвечающего на антиген клона В-лимфоцитов в этих клетках происходят соматические гипермутации, а затем - селекция наиболее эффективно связывающих антиген вариантов (тех В-лимфоцитов, чьи ВКР обладают максимальной аффинностью к данному В-клеточному эпитопу).
В 2 -лимфоциты дифференцируются не только в плазматические клетки, синтезирующие иммуноглобулины, но из них образуются и В-клетки памяти , хранящие информацию об антигене. В-клетки памяти – это долгоживущие малые В-лимфоциты, образовавшиеся из зрелых В-клеток в результате стимуляции антигеном при участии Т-лимфоцитов. При повторном внедрении в организм этого антигена благодаря В-лимфоцитам памяти ускоряется распознавание антигена, пролиферация соответствующего клона В-лимфоцитов и осуществляется быстрый синтез большого количества специфических антител против него.
В-лимфоциты памяти в отсутствие антигена могут также превращаться в плазматические клетки и синтезировать антитела определенной специфичности, обеспечивая иммунитет. Так, на вирусы оспы, полиомиелита, кори такой процесс осуществляется практически всю жизнь, на столбнячный токсин – всего около 5 лет, на дизентерийную палочку – около 1 месяца. Проблема усиления иммуногенности и увеличения сроков иммунологической памяти является весьма важной для создания эффективных вакцин.
На стадии В 2 в результате антигензависимой дифференцировки внутри каждого клона В-лимфоцитов, реагирующего на данный антиген, поочередно , в результате переключения генов, кодирующих синтез тяжелых цепей молекул иммуноглобулинов, образуются четыре основные группы В 2 -лимфоцитов: Bm, Bg, Be, Ba , которые осуществляют соответственно синтез и секрецию IgM, IgG, IgE и IgA. Этот процесс схематически изображен на рис. 20.
Рисунок 20. Дифференцировка В2-лимфоцитов
Первой в процессе дифференцировки образуется группа В 2 -лимфоцитов, на поверхности которых имеются IgD и IgM, эти клетки будут осуществлять синтез на экспорт IgM. Затем, в результате переключения генов в процессе дифференцировки, образуется группа В 2 -лимфоцитов, содержащих на поверхности IgD и IgG, которые синтезируют IgG против данного антигена; третьей образуется группа В 2 -лимфоцитов, имеющих на поверхности IgD и IgE и синтезирующих IgE; и, наконец, четвертой - В 2 -лимфоциты, содержащие на поверхности IgD и IgA, они дифференцируются в плазматические клетки, синтезирующие IgA. IgD, содержащийся на поверхности В 2 -лимфоцитов, имеет только мембраносвязанную форму и на экспорт в норме практически не синтезируется, поэтому в плазме крови он содержится в следовых количествах. Механизм действия этого иммуноглобулина пока еще мало изучен, однако экспериментально показано, что его удаление с поверхности В-лимфоцитов приводит к утрате ими способности к реакции на тимусзависимые антигены.
Таким образом, при поступлении в организм любого антигена(тимуснезависимого или тимусзависимого)первым против данного антигена в процессе гуморального иммунного ответа синтезируется IgM , а затем идет синтез всех остальных классов иммуноглобулинов - IgG,IgE и IgA , что обеспечивает эффективную защиту всех органов и тканей организма.
После нескольких циклов пролиферации лимфоцитов обычно происходит их дифференцировка. Существует представление, что дифференцировка (по крайней мере в случае лимфоцитов, реагирующих на антигены) осуществляется как этап реализации генетической программы клетки и не нуждается в действии специальных факторов, а лишь провоцируется процессами активации и деления клеток. В результате после периода делений в фазу покоя переходит уже качественно иная клетка.
В целом дифференцировка рассматривается как процесс, альтернативный пролиферации. В его основе лежит стабильная и избирательная активация групп генов (в отличие от временной их экспрессии при активации). При этом, как правило, происходят сужение спектра работающих генов и его ограничение генами «домашнего хозяйства» и генами, детерминирующими выполнение специализированных функций, свойственных клеткам этого типа (например, секреции иммуноглобулинов плазматическими клетками). Детали этого процесса и его метаболические основы изучены недостаточно.
Из известных путей передачи сигналов к процессу дифференцировки имеет отношение цАМФ-зависимый путь. Рецепторы для ряда внешних агентов (например, адренергических) связаны с белком О, но после связывания рецепторов этот белок утрачивает сродство к ним и вступает во взаимосвязь с аденилатциклазой, активируя ее. Аденилат-циклаза катализирует образование из АТФ циклического аденозинмо-.нофосфата (цАМФ), который активирует цАМФ-зависимую протеин-киназу. Последняя находится в антагонистических функциональных отношениях с протеинкиназой С, что в значительной степени объясняет альтернативный характер процессов пролиферации и дифференцировки Клеток. цАМФ-зависимая протеинкиназа фосфорилирует ряд белков, как мембранных (что проявляется в изменении макромолекулярной структуры клеточной мембраны), так и ядерных. Среди последних - транскрипционные факторы, которые осуществляют реорганизацию активности генов. Следует, однако, подчеркнуть, что цАМФ-зависимый;путь приводит скорее к временным и обратимым изменениям фенотипа:И функциональной активности клеток (т.е. к их модификации), чем к Истинной дифференцировке.
В отличие от дифференцировки лимфоцитов при их созревании, результатом которой является формирование клеток, готовых к распознаванию антигена и ответу на него, в результате дифференцировки При иммунном ответе формируются эффекторные клетки и клетки памяти.
По отношению к клеткам иммунной системы все органы делятся на 2 группы:
А. Центральные (первичные) - тимус, красный костный мозг. Первичные, так как здесь происходит первый антиген независимый этап дифференицировки лимфоцитов.
Б. Периферические: лимфоузлы, селезенка, диффузная ткань слизистых оболочек. Здесь происходит вторичный этап - антиген зависимая дифференцировка лимфоцитов.
Кожу относят и к центральным и к периферическим органам.
В центральных органах развитие лимфоцитов не зависит от контакта с антигеном. На
этом этапе клетки приобретают специальные рецепторы - маркеры и становятся
иммунокомпетентными (способными различать разные классы чужеродных структур).
Эта способность заложена в геноме, не требует присутствия антигена. Теоретически
формируется способность клеток реагировать в будущем на чужеродные структуры.
Один лимфоцит - один антиген.
В периферических органах образуются эффекторные лимфоциты, способные не только
различать, но и уничтожать чужеродные структуры (Т-киллеры, плазмоциты, Т и В
клетки памяти). Образование этих клеток зависит от потребностей организма.
Предшественники Т-лимфоцитов (пТ), образовавшиеся в костном мозге, мигрируют в тимус и заселяют его корковую зону .
Важную роль в этом процессе играют хемокины, выделяемые эпителиальными клетками тимуса и привлекающие пТ в этот орган. Для проникновения в тимус пТ должны преодолеть гемато-тимический барьер. Преодоление этого барьера основано на взаимном распознавании мембранных молекул пТ (протеогликан CD44, остатки гиалуроновой кислоты, β-интегрин и др.), молекул межклеточного матрикса, таких как фибронектин, и мембранных молекул барьерных клеток.
В субкапсулярной зоне коры тимуса из пТ образуются незрелые Т-лимфоциты , они проходят через несколько стадий дифференцировки прежде чем приобретут иммунокомпетентность и покинут тимус.
В коре тимуса интенсивно идет процесс размножения лимфоцитов. В среднем у человека за сутки образуется около 5х10 8 тимоцитов, тогда как покидают тимус за это же время лишь примерно 8х10 6 клеток. Таким образом, из тимуса выходит лишь около 3% вновь образованных клеток. Биологический смысл этого явления стал понятен сравнительно недавно. Он обусловлен селекцией клонов Т-лимфоцитов, способных взаимодействовать с собственными антигенами гистосовместимости.
Этапы внутритимусной дифференцировки от пТ до более зрелых Т-лимфоцитов, покидающих тимус, характеризуются изменением экспрессии фенотипических Т-клеточных маркеров. Основными из них являются поверхностные CD-антигены (дифференцировочные антигены).
Разные CD-антигены характерны как для определенных стадий дифференцировки, так и для функционально различных субпопуляций лимфоцитов.
CD-антигены представляют собой молекулы сложных белков, гликопротеидов, встроенные в плазматическую мембрану лимфоцитов. Так, для Т-хелперов фенотипическим маркером является белок CD4, для цитотоксических Т-лимфоцитов – CD8. Оба этих белка выполняют функцию корецепторов и участвуют в процессе распознавания антигенов.
Белок CD2 , который появляется на самых ранних этапах образования кортикальных тимоцитов, является общим маркером Т-лимфоцитов и выполняет функцию рецептора для эритроцитов барана. На выявлении этого рецептора основан ранее широко применявшийся тест спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, позволяющий определить количество Т-лимфоцитов (Е-РОК).
Другим общим Т-лимфоцитарным маркером является белок CD3 , он играет важную роль в передаче сигнала в цитоплазму Т-лимфоцитов при контакте антигенраспознающих рецепторов Т-лимфоцитов с антигенными детерминантами.
В процессе дифференцировки Т-лимфоцитов параллельно с появлением новых CD-антигенов может происходить утрата некоторых старых. Таким образом, CD-антигены могут служить примером стадиоспецифических антигенов. Поэтому по CD-маркерам можно определять как количество Т-лимфоцитов и их субпопуляций, так и степень зрелости этих клеток.
Другим важным маркером дифференцировки Т-лимфоцитов является антигенраспознающий рецептор (ТКР) , также формирующийся на ранних стадиях дифференцировки тимоцитов в корковой зоне тимуса.
Фенотипические изменения поверхностных маркеров Т-лимфоцитов в процессе дифференцировки отражают индуцированные целым комплексом стимулов дифференцировочные изменения в клетках: перестройку и активацию определенных генов, синтетические процессы в клетках, приобретение ими определенных функциональных свойств.
К стимулам, под влиянием которых индуцируется дифференцировка Т-лимфоцитов, относятся, прежде всего, межклеточные взаимодействия тимоцитов с эпителиальными клетками тимуса, макрофагами и дендритными клетками с участием формирующихся ТКР и корецепторов, а также молекул адгезии.
Очень важную роль в этом процессе играют и гуморальные воздействия : гормоны тимуса и целый комплекс цитокинов, таких как ИЛ-7, ИЛ-3, ИЛ-1 и другие.
Предшественники Т-лимфоцитов, мигрировавшие в тимус из костного мозга, представляют собой лимфобласты, имеющие определенный набор поверхностных молекул, в частности, CD44, но лишенные маркеров дифференцировки – СD2, СД3, CD4 и СD8. Они заселяют верхнюю часть коры тимуса – субкапсулярную зону.
Взаимодействие пТ с эпителиальными клетками стромы субкапсулярной зоны приводит к экспрессии первого специфического маркера Т-клеток – белка CD2 . Тимоциты, имеющие этот маркер (CD2 +), находясь в тесном контакте с эпителиальными клетками-няньками (nurse cells), активно размножаются и начинают экспрессировать также белки CD3, CD4, CD8 и β-цепь ТКР. Их фенотип записывается следующим образом: CD2 + 3 + 4 ± 8 ± βТКР ± . Эти клетки перемещаются в более глубокие слои коры тимуса. Важную роль на этой стадии дифференцировки играют гормоны тимуса, в первую очередь тимопоэтин, а также цитокины ИЛ-3 и ИЛ-7.
В корковой зоне в результате перестройки и активации генов, кодирующих ТКР, начинается экспрессия обеих цепей ТКР. Параллельно налаживается полноценная экспрессия CD4 и CD8.
В коре тимоциты находятся в непосредственном контакте с кортикальными эпителиальными клетками, которые обладают разветвленными цитоплазматическими выростами, окружающими тимоциты. На эпителиальных клетках хорошо экспрессированы молекулы МНС I и II класса.
Эти межклеточные контакты индуцируют основные селекционные процессы, происходящие в коре тимуса . Полноценная экспрессия ТКР на поверхности кортикальных тимоцитов приводит к образованию огромного количества самых разнообразных по специфичности клонов CD4 + 8 + ТКР + Т-лимфоцитов.
Те клоны, рецепторы которых не комплементарны собственным белкам МНС (а их большинство), погибают в результате апоптоза (запрограммированная гибель клеток). Выживают только клоны, рецепторы которых комплементарны собственным белкам МНС . Эти Т-лимфоциты получают необходимые дифференцировочные сигналы, тем самым они избегают апоптоза и подвергаются дальнейшей дифференцировке. Таким образом происходит отбор клонов Т-лимфоцитов, способных работать в собственном организме (МНС-рестрикция).
Этот процесс называется положительной селекцией . После завершения положительной селекции выживает менее 5% кортикальных тимоцитов, они перемещаются в мезенхиму тимуса через кортико-медуллярную зону.
Каждая из этих клеток способна реагировать либо с белками МНС I класса, либо с белками МНС II класса. В процессе положительной селекции тимоциты, специфичные к белкам МНC I класса, сохраняют корецептор CD8 и перестают экспрессировать CD4. Эти клетки приобретают, таким образом, фенотип цитотоксических Т-лимфоцитов: CD2 + 3 + 8 + (CD8 +).
Тимоциты, специфичные к белкам МНС II класса, сохраняют корецептор CD4 и утрачивают CD8. Они приобретают фенотип Т-хелперов: CD2 + 3 + 4 + (CD4 +) . Так происходит формирование двух основных функционально различных субпопуляций Т-лимфоцитов.
В кортико-медуллярной зоне и в мезенхиме тимуса сохранившиеся в результате положительной селекции клоны Т-лимфоцитов под влиянием ряда цитокинов и тимических гормонов (в первую очередь тимозина), а также межклеточных взаимодействий проходят дальнейшие этапы созревания и подвергаются так называемой отрицательной селекции .
В норме иммунная система организма толерантна (терпима) к собственным антигенам (аутоантигенам). По современным представлениям толерантность к собственным антигенам как раз и является в значительной степени следствием процесса отрицательной селекции в тимусе.
На основании экспериментальных данных большинство исследователей пришли к выводу, что в кортико-медуллярной зоне и в мезенхиме тимуса образовавшиеся CD4 + и CD8 + Т-лимфоциты, еще недостаточно зрелые, вступают в контакт с макрофагами и дендритными клетками, которые «представляют» на своей поверхности собственные антигены организма (после фагоцитоза и пиноцитоза продуктов распада собственных клеток тимуса и попавших в тимус с кровотоком небольших аутологичных белковых молекул) в иммуногенной форме, то есть в комплексе с белками МНС I и II классов. Однако при взаимодействии Т-лимфоцитов с помощью ТКР с этими антигенами Т-клетки получают только один, специфический сигнал, в то время как для того, чтобы избежать апоптоза, они должны получить еще второй, костимулирующий сигнал. Кроме того, необходима экспрессия на поверхности тимоцитов белков Bcl-2 или Bcl-XL, которые являются продуктами соответствующих онкогенов и защищают клетки от апоптоза. Так как экспрессия этих белков и костимулирующих молекул на незрелых тимоцитах отсутствует или крайне незначительна, то имеющие высокоаффинные ксобственным антигенам ТКР клоны Т-лимфоцитов при контакте с этими антигенами, представленными в комплексе с белками МНС на поверхности АПК, подвергаются апоптозу и погибают.
Таким образом, Т-лимфоциты подвергаются апоптозу на всех этапах созревания в тимусе в результате отсутствия необходимых сигналов в виде межклеточных контактов (посредством взаимодействия с костимулирующими молекулами) или гуморальных ростовых факторов.
На этапах клональной селекции апоптоз играет важнейшую роль в устранении ненужных, не поддержанных положительной селекцией (МНС рестрикция) и аутореактивных (отрицательная селекция) клонов. В результате погибает значительное количество клонов Т-лимфоцитов, имеющих ТКР-рецепторы, высокоаффинные к собственным антигенам. Сохраняются и выходят в кровоток те клоны, ТКР-рецепторы которых обладают низкой аффинностью к собственным антигенам. В настоящее время мнение, что клональная делеция (отрицательная селекция) является ведущим механизмом формирования центральной естественной иммунологической толерантности, является общепринятым.
В конце 1990-х - начале 2000-х годов была открыта новая субпопуляция CD4 + Т-лимфоцитов, которые дифференцируются в тимусе в процессе отрицательной селекции в качестве альтернативы клональной делеции аутореактивных CD4 + Т-лимфоцитов с достаточно высокой степенью аффинности ТКР к собственным антигенам. У этих клеток при контакте с антигенами, представленными на поверхности АПК, повышается уровень фактора транскрипции FoxP3 (который регулирует транскрипцию генов, ответственных за дифференцировку Т-лимфоцитов и синтез ими цитокинов), возрастает экспрессия белка CD25 (рецептора к ИЛ-2), и они дифференцируются в регуляторные Т-лимфоциты (Трег. лимфоциты) с фенотипом CD4 + 25 + FoxP3 + . Эти клетки обладают супрессорной активностью по отношению к зрелым эффекторным Т-лимфоцитам той же специфичности, работающим на периферии (Тх1, CD8 + цитотоксическим Т-лимфоцитам).
Большинство Трег. лимфоцитов являются аутореактивными клетками, они подавляют аутоиммунные процессы, в которых участвуют эффекторные Т-лимфоциты, имеющие ТКР той же специфичности. Благодаря этому Трег. лимфоциты играют важную роль в механизмах периферической толерантности . Это доказывают результаты экспериментальных исследований на животных, которые продемонстрировали, что Т-лимфоциты с фенотипом CD4 + 25 + FoxP3 + подавляют развитие аутоиммунных заболеваний, таких как экспериментальный аллергический энцефаломиелит, экспериментальный аутоиммунный колит, эксперментальный аутоиммунный диабет.
Необходимо заметить, однако, что, по-видимому, не все аутоантигены организма попадают в тимус и участвуют в процессе отрицательной селекции. Так, в частности, не попадают в тимус многие органоспецифические антигены. Поэтому определенное количество аутореактивных клонов избегает гибели в тимусе и поступает на периферию. Работа этих клонов в норме блокируется периферическими механизмами толерантности.
Выжившие после отрицательной селекции клоны CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов покидают тимус и мигрируют в периферические лимфоидные органы, где заселяют тимусзависимые зоны и подвергаются при встрече с соответствующими антигенами антигензависимой дифференцировке.
Выжившие в результате положительной и отрицательной селекции в тимусе CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты, а также CD4 + 25 + FoxP3 Трег. лимфоциты, мигрирующие из тимуса, не являются еще функционально зрелыми клетками. Они представляют собой продукт антигеннезависимой дифференцировки в тимусе. Эти клетки, еще не встречавшиеся с антигенами, принято называть «наивными», или «непримированными », лимфоцитами, они являются предшественниками зрелых эффекторных Т-лимфоцитов.
Схема антигеннезависимой дифференцировки Т-лимфоцитов представлена на рис. 28.
Полипотентная гемопоэтическая стволовая клетка (ГСК) малодифференцированный клеточный элемент, способный к самоподдержанию, пролиферации и дифференцировке во все клетки крови.
ГСК локализуются в красном костном мозге (концентрация до 1% среди мононуклеарных клеток), печени эмбриона (до 1%), ГСК циркулируют в пуповинной крови (до 1%), периферической крови (около 0, 1% от всех ядерных клеток)
Этапы развития ГСК Полипотентная стволовая кроветворная клетка (stem cell). Родоначальная стволовая кроветворная клетка (progenitor cell) – ограничена в самоподдержании, но интенсивно пролиферирует. Имеет ограниченное число делений и ограниченный потенциал, коммитированы к дифференцировке, по крайней мере, в двух направлениях (лимфоидном и миелоидном). Клетка предшественник (precursor cell) – коммитирована только в один тип клеток крови (лимфоциты, гранулоциты, моноциты и т. д.). Зрелые клетки (Т-, В-лимфоциты, эритроциты, моноциты и т. п.).
Лимфоидная родоначальная клетка ГСК самоподдержание В-лимфоцит Предшественник В-лимфоцитов Т-лимфоцит NK Предшественник Т-лимфоцитов Миелоидная родоначальная клетка
Клональный принцип организации лимфоцитов Клон лимфоцитов – группа лимфоцитов, имеющих антигенраспознающие рецепторы одной специфичности, т. е. способные распознавать одну АГ детерминанту. 1 КЛОН = 1 АГ-распознающий РЕЦЕПТОР! В иммунной системе формируется множество клонов лимфоцитов способных распознавать огромное количество вариантов антигенных молекул, составляющих антигенный репертуар.
Молекула BCR имеет слишком короткий цитоплазматический хвост, поэтому для трансдукции (передачи) сигнала от BCR к ядру клетки используются вспомогательные молекулы, такие как CD 79 и другие (CD 19, CD 20, CD 21).
Легкие цепи, входящие в состав BCR, могут быть двух видов: κиλ Их строение кодируется генетическими локусами, расположенными во 2 и 22 хромосомах Тяжелые цепи (5 видов, соответствующие классам иммуноглобулинов: μ, γ, δ, ε, α) кодируются в едином локусе 14 хромосомы. Это - зародышевые гены иммуноглобулинов.
В общем виде каждая группа зародышевых генов состоит из 4 -х генных сегментов: ВАРИАБЕЛЬНЫЙ (V), РАЗНООБРАЗНЫЙ (D), СОЕДНИТЕЛЬНЫЙ (J) КОНСТАНТНЫЙ (С)
Для формирования многообразия вариабельных доменов (V-домены) комплементарных различным видам АГ, во время дифференцировки происходит перестройка (реаранжировка) зародышевых генов, в результате которой формируется окончательный вид генов, кодирующих белковую структуру BCR и иммуноглобулинов.
Для перегруппировки генов H- и L-цепей требуются ферменты рекомбиназы RAG-1 и RAG-2 (recombinationactivating genes). Перегруппировка представляет собой вырезание отдельных фрагментов ДНК и сшивку оставшихся частей по принципу образования петель ДНК.
Отрицательная селекция В-лимфоцитов в костном мозгу: реакции незрелых клеток на распознавание аутоантигена – индукция анергии, редактирование V-генов и апоптоз
Дифференцировка В-лимфоцита в плазматическую клетку Плазматическая клетка B-лимфоцит Утрата экспрессии генов В-клетки Блокада клеточного цикла после плазмобласта Увеличение размера, расширение цитоплазмы, развитие шероховатого ЭПР
TCR – гетеродимеры, и или и цепей (Т-клетки и Т-клетки) TCR тесно соединяется с CD 3 – комплексом полипептидных цепей, необходимых для трансдукции сигнала
Схематическая структура CD 4 (4 подобных Ig домена) и CD 8 (αβ – гетеродимер и αα- гомодимер)
В отличие от BCR, распознающего АГ в нативном виде, TCR связывает и распознает АГ только в составе молекул MHC. CD 4 и CD 8 классические корецепторы, распознающие комплекс «пептид-МНС» и участвующие в сигнальной трансдукции. Внеклеточные домены CD 4 и CD 8 связываются с консервативными МНС молекулами на АПК. CD 4 связывается с МНС класса II, а CD 8 – с МНС класса I
Т-хелперы (Th) (CD 4+) Функциональная субпопуляция Т клеток, которые способствуют генерации цитотоксических Т лимфоцитов и участвуют в межклеточной кооперации с В-клетками, активируя их в направлении синтеза антител. Th распознают антиген в ассоциации с молекулами MHC класса II (феномен двойного распознавания)
На их долю приходится до 40% всех лейкоцитов и их подразделяют на 3 размерные группы – малые (5-6 мкм), средние и большие (> 10 мкм). Размеры зависят от функционального состояния и зрелости клеток. По функциям лимфоциты также неоднородны и подразделяются на Т-лимфоциты (70-80%), В-лимфоциты (10-20%) и большие гранулярные лимфоциты (NK, 5-10%). Они различаются совокупностью своих поверхностных рецепторов, что определяет и их разные функции в иммунных реакциях.
Вопрос 3.
Лимфоцитопоэз начинается в красном костном мозге. СКК образует полипотентную КП-лимфопоэза, которая дает начало трем унипотентным предшественникам: КП - В лимфоцитов, КП – Т лимфоцитов и КП-NK-клеток. Для Т- и В-лимфоцитов дальнейшая дифференцировка протекает очень сложно и подразделяется на два этапа : антигеннезависимую и антигензависимую.
I. Антигеннезависимая дифференцировка протекает независимо от присутствия антигенов, в центральных органах иммунных реакций. Для В-лимфоцитов это красный костный мозг , для Т-лимфоцитов – тимус (поэтому Т-лимфоциты на этой стадии развития называют еще тимоцитами) Унипотентные предшественники (пре-В-клетки или пре-Т-клетки) проходят здесь стадии:
Лимфобласт (соответствует большому лимфоциту)
незрелый-лимфоцит (средний)
зрелый лимфоцит (малый).
Главные события антигензависимой дифференцировки – приобретение лимфоцитами специфических поверхностных рецепторов.
Вопрос 4.
Мембранных рецепторов у лимфоцитов очень много и их можно разделить на 2 группы.
А) специфические рецепторы , способные распознавать свои конкретные антигены и связываться с ними.
Поскольку антигенов бесконечное множество, то и эти рецепторы бесконечно разнообразны. Согласно клонально-селекционной теории для каждого антигена образуется своя группа (клон) лимфоцитов со строго специфичным рецептором. У Т-лимфоцитов это семейство ТКР (Т-клеточные рецепторы ), у В-лимфоцитов – это молекулы иммуноглобулинов (антител), встроенные в плазмолемму. В составе всех этих рецепторов есть вариабельная область, которая позволяет создавать их бесконечное разнообразие. Это требует определенной перестройки генома в созревающих клетках, что называют реаранжировкой)
Б) добавочные рецепторы , характерные для групп (субпопуляций) лимфоцитов, выполняющих разные функции. Эти рецепторы называют также поверхностными функциональными маркерами. Они необходимы для взаимодействия между клетками, участвующими в иммунном ответе. Самые важные среди них - CD молекулы , представляющие собой мембранные гликопротеиды. На сегодняшний день их известно более 40 разновидностей и они обозначаются цифровыми символами (CD 4, CD 32 и т.д.).
В ходе антигеннезависимой дифференцировки Т-лимфоцитов на их поверхности появляются специфические Т-клеточные рецепторы, и набор CD-рецепторов, который закономерно изменяется. Зрелые Т-клетки, поступающие из тимуса относятся к 3 функционально разным видам и имеют разные СD-рецепторы.
Т х (хелперы) несут рецептор СD 4,
Т к (киллеры) и Т с (супрессоры) несут рецепторы CD 8 + .
Антигеннезависимая дифференцировка В-лимфоцитов включает экспрессию на поверхности сначала IgM (незрелый В-лимфоцит), а затем к нему добавляется IgD (зрелая клетка). В ходе созревания В-клетка также приобретает CD –рецепторы (19-23, 40).
Вопрос 5 .
Процессы антигеннезависимой дифференцировки очень сложны. Кроме деления клеток и приобретения рецепторов она включает процесс отбора лимфоцитов (селекцию ), в ходе которого значительная часть клеток до (90%) погибает. Запрограммированной гибели подвергаются те клетки, которые имеют специфические рецепторы к белкам собственного организма. Такая селекция предотвращает развитие аутоиммуных реакций.
Все процессы на этой стадии лимфопоэза регулируются клетками тимуса и красного костного мозга, которые создают необходимые для созревания лимфоцитов условия (микроокружение ). Основными факторами микроокружения являются различные цитокины (колониестимулирующий фактор КСФ, интерлейкины, тимозин, тимопоэтин и другие).
Зрелые лимфоциты, завершившие антигеннезависимую дифференцировку, готовы к встрече с антигеном, но еще не встречались с ним. Поэтому их называют наивными или девственными. Наивные лимфоциты выселяются через стенку сосудов в кровоток и таким образом мигрируют из центральных органов кроветворения в периферические органы иммунной системы (селезенку, лимфатические узлы, миндалины, аппендикс и др.). Здесь должна произойти встреча с антигеном и тогда начнется вторая стадия лимфопоэза – антигензависимая дифференцировка. Наивные лимфоциты – короткоживущие клетки, не встретив свой антиген, они погибают. Миграция лимфоцитов происходит строго направлено – не просто в перечисленные органы, но и в определенные зоны внутри этих органов (Тл – в Т-зависимые зоны, Вл – в В-зависимые). Это возможно благодаря опять-таки рецепторам. Наивные лимфоциты имеют специальные хоминг-рецепторы, которые связываются с рецепторами (адрессинами) капилляров в соответствующих зонах нужных органов.
Вопрос 6 .
Чтобы началась антигензависимая дифференцировка, лимфоциту необходима информация о структуре антигена, который необходимо уничтожить. Эта информация предоставляется специальными клетками, которые объединяют под названием антиген-представляющих клеток (АПК). К ним относят моноциты, макрофаги и дендритные АПК . Дендритные АПК это отростчатые клетки, которые встречаются в рвст и в некоторых эпителиях. Это потомки моноцитов крови. По сравнению с макрофагами активность их лизосомальных ферментов более низкая, но фагоцитарная и антигенпредставляющая способности очень высоки. Антигенпредставляющая функция свойственна также и самим В-лимфоцитам . АПК функционируют по единой схеме.
1. Они фагоцитируют антиген и разрушают (процессинг) его настолько, чтобы освободился эпитоп – короткая пептидная цепочка из 8-10 аминокислот, входящая в структуру антигена. Каждый антиген имеет свой специфичный эпитоп (или антигенную детерминанту), который распознается клетками иммунной системы как его визитная карточка.
2. АПК на своей грЭПС синтезируют МНС- молекулы главного комплекса гистосовместимости. Клетки всех высших позвоночных синтезируют набор таких молекул, которые затем включаются в плазмолемму. По ним лимфоциты определяют, своя или чужая клетка. Таков, например, механизм отторжения чужих трансплантатов. У человека они носят название HLA-рецепторы.
3. В цитоплазме АПК МНС-молекулы образуют комплекс с эпитопом, который транспортируется на поверхность клетки, где эпитоп и представляется соответствующему лимфоциту.
МНС-молекулы делят на 2 класса. Молекулы МНС I класса связываются с эпитопами тех антигенов, которые синтезированы внутри клетки (эндогенные антигены). Это, например, вирусные белки в инфицированной клетке или белки опухолевых клеток. Такие комплексы появляются на поверхности любых клеток и даже тромбоцитов и благодаря этому лимфоциты могут уничтожить любую клетку, которая заражена или подвержена опухолевому перерождению. Молекулы МНС II класса образуют комплекс с эпитопом экзогенных антигенов. Ясно, что в этом случае чужеродные частицы сначала должны быть фагоцитированы и подвержены процессингу. Такие комплексы выявляются на поверхности только АПК.
Вопрос 7.
II. Антигензависимая дифференцировка .
Взаимодействие АПК с лимфоцитом инициирует антигензависимую дифференцировку. Она начинается с того, что зрелые лимфоциты возвращаются в стадию активно делящегося бласта – иммунобласта . Этот процесс получил название вторичной бласттрансформации и он обеспечивает резкое увеличение числа именно тех лимфоцитов, которые имеют рецепторы к данному антигену.
Ход дальнейших событий зависит от природы антигена. Клеточные антигены (вирусы, бактерии, грибы, опухолевые или мутантные клетки, чужие пересаженные ткани и т.д.) вызывают реакции клеточного иммунитета. Чужеродные макромолекулы приводят к реакциям гуморального иммунитета.
Вопрос 8 .
Клеточный иммунный ответ обеспечивается Т-лимфоцитами. Для этого комплекс МНС I кл./эпитоп антигена (на поверхности АПК) должен присоединиться к специфическому ТКР и к СD 8-рецептору на поверхности наивного Т-лимфоцита. Это рецепторное взаимодействие двух клеток активирует превращение лимфоцита в Т-иммунобласт, а затем – созревание в эффекторную клетку – Т-киллер .
Т-киллеры или Т-цитотоксические лимфоциты морфологически относятся к малым лимфоцитам. В их цитоплазме содержится 30-50 крупных мембранных гранул с цитотоксическими веществами (гранзимы и перфорин) . Т-киллеры обследуют поверхность клеток в поисках нужного эпитопа, связываются с клеткой-мишенью и оказывают на нее летальное действие, образно называемое «смертельным поцелуем». Т-киллеры используют 2 механизма. 1) выбрасывают из своих гранул белки перфорины. Эти молекулы встраиваются в чужую плазмолемму и формируют в ней сквозные поры, которые постепенно увеличиваются в диаметре. Это нарушает осмотическое равновесие, клетка набухает и гибнет. 2) Через перфориновые поры Т-киллеры также впрыскивают в чужую клетку гранзимы – ферменты, которые запускают апоптоз – программируемую клеточную гибель (самоубийство).
В ходе антигензависимой дифференцировки в случае клеточного иммунитета помимо Т-киллеров образуются также Т-клетки памяти . Они имеют ТКР к тому антигену, который вызвал иммунный ответ. Они соответствуют наивным лимфоцитам, но живут гораздо дольше и их гораздо больше. Годами рециркулируя в организме, они дожидаются, когда антиген попадет в организм повторно – тогда они быстро активируются в эффекторные Т-киллеры и обеспечивают вторичный иммунный ответ.
Вопрос 9.
Антигензависимая дифференцировка В-лимфоцитов происходит в ходе гуморального иммунитета , т.е. при поступлении чужеродных макромолекул – белков, гликопротеидов и т.д. Она проходит с участием регуляторных клеток – Т-хелперов и Т-супрессоров.
Для активации В-лимфоцитов необходимо несколько условий:
1. Контакт с антигеном.
Наивные В-лимфоциты, поступающие из красного костного мозга, несут на своей поверхности молекулы Ig М, представляющие собой специфические антиген-распознающие рецепторы. Благодаря предыдущей реанжировке генома, В-лимфоциты одного организма имеют огромный репертуар этих рецепторов (10 9 вариантов). Кроме того, В-клетки несут маркеры CD 19-23, молекулы МНС I и II классов, Fc- и С3-рецепторы.
В результате дальнейшего фагоцитоза и процессинга на поверхности В-лимфоцита появляется комплекс молекулы МНС II класса/эпитоп антигена.
2. Активация Т-хелпера.
Фагоцитоз антигенов антигенпрезентирующими клетками приводит к экспрессии на их мембране комплексов МНС II класса/ антиген. Этот комплекс на поверхности АПК распознается наивными Т-хелперами посредством ТКР и CD4. При этом АПК выделяет ИЛ-1, активизирующий Т- хелпер.
3. Контакт В-лимфоцита с активированным Т-хелпером.
При контакте с комплексом МНС II класса /антиген на поверхности В-лимфоцита такой активированый Т-хелпер начинает выделять широкий набор интерлейкинов, активируя В-лимфоцит. Активации В-лимфоцитов способствует также контакт их СD 40-рецепторов с лигандом (СD 40L) на поверхности Т-хелпера.
Кроме активации В-лимфоцитов, Т-хелперы оказывают регуляторное воздействие и на другие лейкоциты. На их долю приходится 2/3 всех лимфоцитов. Снижение их числа приводит к состояниям иммунного дефицита. При СПИДе вирус поражает именно Т-хелперы.
Активированные В-лимфоциты претерпевает вторичную бласттрансформацию, пролиферацию и дифференцировку в плазматические клетки.
Вопрос 10.
Плазматическая клетка (плазмоцит) – эффекторная клетка гуморального иммунитета. Главная ее функция – выработка антител . Это неподвижная короткоживущая клетка утрачивает многие рецепторы В-лимфоцита. Ядро округлое, расположено эксцентрично, гетерохроматин распределен радиальными тяжами («спицы в колесе»). Цитоплазма заполнена грЭПС и потому базофильна, за исключением «светлого дворика» вблизи ядра, где расположен комплекс Гольджи. Секреторных гранул нет, поскольку продуцируемые антитела сразу же экзоцитируются при помощи мелких пузырьков. Каждую секунду клетка производит тысячи молекул антител. Молекулы имеет участки, которые специфически связываются с конкретным антигеном. Гены, которые кодируют этот участок, способны перестраиваться (реанжировка) и благодаря этому достигается огромное разнообразие антител. Поэтому каждый плазмоцит начинает вырабатывать иммуноглобулины, строго специфичные для того антигена, который вызвал дифференцировку. Антитела связываются с антигенами и включают разнообразные механизмы их уничтожения (опсонизация, запуск комплемента и т.д.).
Плазмоциты не циркулируют в кровотоке. Они распределяются в тканях периферических лимфоидных органов и рыхлой соединительной ткани, особенно много их в слизистых оболочках и строме экзокринных желез.
Кроме плазматических клеток образуются также долгоживущие В-клетки памяти.
Т-супрессоры угнетают активность иммунных реакций. Это происходит либо при контактном воздействии на клетки-мишени (В-лимфоциты, Т-хелперы и Т-киллеры) либо путем выработки супрессорных факторов.
Итак, все иммунокомпетентные клетки можно разделить на:
1. АПК (дендритные АПК, макрофаги и моноциты, В-лимфоциты)
2. Эффекторные клетки (Т-киллеры клеточного иммунитета, плазматические клетки гуморального иммунитета)
3. Регуляторные клетки (Т-хелперы и Т-супрессоры)
4. Клетки памяти.
Вопрос 11 .
Нулевые лимфоциты .
Это популяция лимфоцитов, которые не имеют ни Т-клеточных, ни В-клеточных рецепторов. Их маркерами служат CD16, CD56 и CD57. Большинство этих клеток относят к так называемым натуральным киллерам – NK-клеткам . Морфологически это большие лимфоциты с бобовидным смещенным ядром и азурофильными гранулами, которые по виду и составу близки гранулам Т-киллеров. Эти клетки также называют большие гранулярные лимфоциты. Клетками-мишенями для них являются опухолевые клетки, клетки, зараженные вирусами, бактериями или простейшими, а также стареющие и поврежденные клетки. Механизм уничтожения сходный с Т-киллерами, но более активный, поскольку не требует распознавания молекул МНС. NK-клетки не обладают антигенной специфичностью и не приобретают иммунологическую память. Они обеспечивают неспецифический противоинфекционный иммунитет, а также являются главным звеном противоопухолевой защиты. Повышение их числа и активности – перспективное направление онкологии.
