В статье представлены результаты экспериментальных исследований по выбору метода и разработке методики количественного определения филлохинона (витамина К1) в растениях. Обосновано преимущество хроматографического метода (обращенно-фазовой ВЭЖХ) перед спектрофотометрическим при определении филлохинона в составе комплекса БАВ растений. В соответствии с рекомендациями Международной конференции по гармонизации технических требований к регистрации лекарственных средств для применения у человека (International Conference Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) была проведена валидация разработанной методики по показателям специфичность, линейность, воспроизводимость и точность. Установлено, что предложенная методика является специфичной, линейной, воспроизводимой и точной. На примере фармакопейных видов сырья, содержащих витамин К1, доказана универсальность применения методики при анализе растительных объектов.
филлохинон
витамин К1
крапивы листья
калины кора
кукурузы столбики с рыльцами
пастушьей сумки трава
валидация
1. Абышев А. З. Синтез, свойства и контроль качества витаминных препаратов и витаминоподобных веществ: учебно-методическое пособие / А. З. Абышев, С.Н. Трусов, Н.И. Котова, М. П. Блинова. – СПб. : Изд-во СПФХА, 2010. – 136 с.
2. ГОСТ Р ИСО 5725-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений» В 6 ч. – Введ. 23.04.02. – М.: Госстандарт России; Изд-во стандартов, 2002.
3. Государственная фармакопея СССР. Вып. 2 Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. – 11-е изд., доп. – М., 1989. – 400 с.
4. Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации. Методические рекомендации МР 2.3.1.2432 -08
5. Носов А. М. Лекарственные растения. – М.: ЭКСМО-Пресс, 1999. – 350 с.
6. Погодин И.С., Лукша Е.А. Разработка методики количественного определения сесквитерпеновых лактонов в траве соссюреи горькой // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 1; URL: www.сайт/107-8426
Введение
Витамин К относится к классу жирорастворимых витаминов, влияющих на систему гемостаза. К природным витаминам группы К относятся два типа метилированных хиноидных соединений с боковыми цепями, представленными изопреноидными звеньями: витамины К 1 и К 2 . В основе структуры указанных витаминов лежит система 1,4-нафтохинона. Витамин К1 (филлохинон) синтезируется всеми фотосинтезирующими организмами. Витамин К 2 (менахинон) синтезируется микрофлорой толстого кишечника. Биологическая роль витаминов группы К заключается в активации факторов свертывающей и противосвертывающей систем млекопитающих .
В настоящее время определена физиологическая потребность в витамине К для взрослых - 120 мкг/сутки и для детей - от 30 до 75 мкг/сутки .
В медицинской практике препараты растительного происхождения, содержащие филлохинон, используются для коррекции геморрагических осложнений. В Государственную фармакопею 11 издания включены следующие виды лекарственного растительного сырья, обладающие гемостатическим витамин К-зависимым эффектом: кора калины (Соrtex Viburni), столбики с рыльцами кукурузы (Styli cum stigmatis Zeae maydis), листья крапивы (Folia Urticae), трава пастушьей сумки (Herba Bursae pastoris) . Установлено, что витамин К 1 также содержится в траве тысячелистника, горца перечного, горца почечуйного и спорыша, что определяет возможность применения указанного сырья при желудочных, маточных и геморроидальных кровотечениях . В Государственной фармакопее, в настоящее время, отсутствуют методики определения филлохинона в растительном сырье. Для оценки целесообразности использования лекарственного растительного сырья в качестве источников витамина К1, актуальной проблемой является решение вопросов стандартизации и разработки методик, направленных на определение содержания филлохинона в растительных объектах.
Цель работы : разработка методики определения витамина К1 в лекарственном растительном сырье.
Материалы и методы исследования
Объектами исследования являлись официнальные виды лекарственного растительного сырья: кора калины, столбики с рыльцами кукурузы, листья крапивы, трава пастушьей сумки. Все виды сырья были приобретены через аптечные сети. Выбор рационального способа определения витамина К 1 проводили на основании оценки валидационных характеристик, полученных с помощью хроматографических и спектрофотометрических методов анализа. Для разработки методики количественного определения филлохинона в растительном сырье использовали метод обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) с диодно-матричным детектором на приборе Shimadzu LC-20 Prominence в изократическом режиме в следующих условиях: аналитическая колонка, заполненная сорбентом PerfectSil 300 ODS C18, 4,6х250 мм, с размером частиц 5 мкм; состав подвижной фазы: ацетонитрил-изопропанол-вода в соотношении 75:20:5; детектирование при длине волны 254 нм; температура колонки - комнатная; скорость подвижной фазы 1 мл/мин; объем вводимой пробы 20 мкл. Оценку результатов проводили по величине времени удерживания (t r) филлохинона, совпадающим с показателем t r РСО (20.00±1.00 мин.) и по величине площади пика филлохинона. Обработку результатов производили с использованием программного обеспечения LC Solutions.
Спектрофотометрическое определение содержания витамина К 1 проводили на приборе UNICO 2802S в кварцевой кювете с толщиной слоя 1 см.
Обработку результатов выполняли с использованием программы STATISTICA 8.0. Для описания полученных результатов, после проверки нормальности распределения, приводили значение среднего (X ср), стандартного отклонения (S), относительного стандартного отклонения (RSD), дисперсии (S 2), доверительного интервала среднего (Δx ср) при уровне значимости α=0,05.
В качестве стандартного образца использовали рабочий стандартный образец (РСО) витамина К 1 , выделенного методом препаративной колоночной хроматографии из гексанового извлечения листьев крапивы двудомной. Рабочий стандартный образец представляет собой желтую вязкую невысыхающую маслянистую жидкость, практически не растворимую в воде, растворимую в органических растворителях и растительных маслах, температура плавления -20ºС. Спектральные характеристики спиртового раствора рабочего стандартного образца (после удаления гексана) представлены на рис. 1.
Рис. 1. Спектр в УФ- и видимой области раствора РСО филлохинона (витамина К1)
Для максимального извлечения витамина К1 из исследуемых образцов подбирали следующие параметры пробоподготовки: степень измельченности сырья, вид экстрагента, количественные соотношения сырья и экстрагента, время и кратность экстракции, температурный и световой режим экстрагирования.
Результаты и обсуждение . С целью разработки рационального метода определения содержания витамина К 1 были подобраны условия для его извлечения из сырья. В качестве объекта для разработки методики служили листья крапивы. С учетом неустойчивости филлохинона к воздействию световой энергии, все этапы исследования проводили в условиях, предполагающих защиту извлечений от света. Полноту извлечения определяли методом ВЭЖХ по величине площади пика с t r 20.00±2.00 мин. В результате оценки влияния факторов пробоподготовки на полноту извлечения филлохинона были подобраны следующие параметры и условия: измельченность сырья - частицы, проходящие сквозь сито с величиной диаметра отверстий 0,5 мм; экстрагент - гексан; количественное соотношение «сырье:экстрагент» - 1:25; однократная экспозиция в течение 60 мин.; температурный режим - комнатная температура (20-22ºС).
Для разработки методики определения витамина К 1 в растениях спектрофотометрическим методом, предварительно был проведен сравнительный анализ спектров поглощений извлечений из фармакопейного сырья (рис. 2) и раствора РСО филлохинона (рис. 1). В результате было установлено, что доказать присутствие витамина К1 в сырье по референтному максимуму (249 нм) не представляется возможным, ввиду отсутствия данного максимума в спектре всех исследуемых объектов. Следовательно, методика определения витамина К1 в суммарном комплексе биологически активных веществ растительного сырья прямым спектрофотометрическим методом изначально не может быть положительно провалидирована по показателю «специфичность». Повысить показатель специфичности методики при использовании спектрофотометрии возможно при условии извлечения из сырья очищенного филлохинона, что требует введения дополнительных препаративных манипуляций на стадии пробоподготовки объекта исследования. Дополнительная очистка извлечения может отрицательно повлиять на экспрессность и точность методики в конечном результате.
Рисунок 2 - Спектры поглощения извлечений из лекарственного растительного сырья, содержащего филлохинон (Кр - листья крапивы, К - кора калины, Ку - столбики с рыльцами кукурузы, П - трава пастушьей сумки)
Наиболее приемлемым вариантом для определения витамина К 1 в растительном сырье представляется использование метода обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) с диодно-матричным детектором. По разработанным параметрам пробоподготовки сырья к анализу была разработана следующая методика: аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую колбу вместимостью 50 мл, заливают 25 мл гексана, закрывают пробкой и перемешивают на механическом встряхивателе в течение 60 минут. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр в круглодонную колбу и отгоняют гексан на ротационном испарителе. Остаток количественно переносят в мерную колбу на 5 мл (пикнометр) с помощью 4 мл этанола. Доводят объем раствора до метки тем же растворителем и перемешивают. 0,02 мл раствора вводят в хроматограф.
Приготовление стандартного образца: К 0,0005 г (точная навеска) РСО филлохинона приливают 4 мл этанола, переносят в мерную колбу вместимостью 5 мл. Доводят объем раствора до метки растворителем и перемешивают. 0,02 мл раствора вводят в хроматограф.
Содержание филлохинона (X) в абсолютно сухом сырье в процентах вычисляют по формуле:
где S o - площадь пика на хроматограмме раствора РСО филлохинона; S - площадь пика филлохинона на хроматограмме испытуемого раствора; m o - навеска РСО филлохинона, в г; m - навеска сырья, в г; W - потеря в массе при высушивании сырья, в %; Р - содержание филлохинона в РСО филлохинона, в %.
По результатам количественного определения филлохинона методом обращенно-фазовой ВЭЖХ было определено содержание витамина К1 в листьях крапивы (табл. 1).
Таблица 1 - Метрологическая характеристика метода количественного определения филлохинона в листьях крапивы (%) (n=6)
|
Xср ± Δхср |
||||||
|
0,00425 ± 0,00021 |
Ввиду малого содержания витамина К1 в сырье предлагаем производить расчеты в мг%, для этого необходимо внести изменения в расчетную формулу для перевода единиц измерения (г в мг):
Валидационную оценку методики проводили по показателям - специфичность, линейность, прецизионность (воспроизводимость) и точность .
Специфичность. Идентификация филлохинона подтверждалась совпадением времени удерживания анализируемого компонента в сырье и РСО филлохинона (рис. 3). Пики сопутствующих соединений, входящих в состав извлечений растительного сырья, хорошо разделяются с пиком филлохинона, и не влияют на аналитическое определение.
Рис. 3. Хроматограмма извлечения листьев крапивы (А - пик 17,tr =20.37 мин соответствует филлохинону) и рабочего стандартного образца филлохинона (Б - пик 22 ,tr =20.71 мин)
Линейность и аналитическая область методики была подтверждена анализом 7 проб разных концентраций в диапазоне от 13 до 417 % от концентрации (0,12 мг/мл), принятой за 100 %. Сравнение зависимости между содержанием филлохинона (мг/мл) в испытуемых растворах и величинами площадей хроматографических пиков показало, что она имеет линейный характер и описывается уравнением y = 5104417,9 x + 10944,88. Коэффициент корреляции (rxy) равен 0,999, что позволяет использовать данную методику для количественного определения филлохинона в растительных объектах в диапазоне концентраций от 0,016 до 0,5 мг/мл.
Воспроизводимость (прецизионность) определялась путем проведения анализа разными (двумя) аналитиками на одной серии сырья в разное время. Число повторностей для каждого аналитика - 3, общее число повторностей - 6. Относительное стандартное отклонение, выраженное в процентах (RSD, %), не должно превышать 5 % . По результатам проведенных исследований RSD составило 1,21 %, что характеризует надежность анализа в выбранных условиях (табл. 2).
Таблица 2 - Результаты определения прецизионности методики
|
Повторность |
Аналитик |
Определено в образце, мг% |
Метрологические характеристики |
|
|
Xср = 4,00525 мг % S = 0,04850 мг % |
||||
Для определения точности методики анализировали образцы листьев крапивы из одной партии сырья в 3 уровнях навесок (по 0,5, 1,0 и 1,5 г), трижды проводя отбор проб для каждого уровня. Содержание витамина К1 определяли в мг в навеске сырья. Предварительно рассчитывали ожидаемую (теоретическую) величину, исходя из установленного среднего показателя по содержанию витамина К1 в листьях крапивы, равного 4,1 мг%. Теоретический показатель значения сравнивали с фактическим. Для оценки полученных результатов использовали показатель «открываемость» (R), критерий приемлемости для которого принят в пределах 98-102 % от расчетной величины .
Таблица 3 - Результаты определения точности методики
|
Навеска сырья, |
Фактическое |
Расчетное |
Открываемость |
Метрологические характеристики |
||||
Результаты определения точности методики, представленные в таблице 3, показали, что открываемость R составляет 98,73 %, величина относительного стандартного отклонения (RSD) не превышает 5 %, что характеризует точность методики как удовлетворительную.
Таким образом, установлено, что предлагаемая методика количественного определения витамина К1 методом ВЭЖХ в листьях крапивы является специфичной, воспроизводимой и точной. Данная методика была воспроизведена для определения витамина К1 в других видах лекарственного растительного сырья (табл. 4).
Таблица 4 - Содержание витамина К1 (мг%) в лекарственном растительном сырье
|
Объект (n=6) |
Xср ± Δхср |
||||
|
Столбики с рыльцами кукурузы |
|||||
|
Трава пастушьей сумки |
|||||
|
Кора калины |
Проведенные исследования показали целесообразность использования метода обращенно-фазовой ВЭЖХ для определения филлохинона в растительном сырье. Преимуществом метода ВЭЖХ является возможность проведения оценки качественного и количественного содержания филлохинона в одной навеске сырья, что существенно экономит временные затраты на анализ. Разработанная методика может быть использована для определения содержания витамина К1 в растительных объектах.
Рецензенты:
Гришин А.В. д.фарм.н., профессор, зав. кафедрой фармации ГБОУ ВПО ОмГМА Минздрава России, г.Омск.
Пеньевская Н.А. д.м.н., доцент, зав. кафедрой фармацевтической технологии с курсом биотехнологии ГБОУ ВПО ОмГМА Минздрава России, г.Омск.
Библиографическая ссылка
Лукша Е.А., Погодин И.С., Калинкина Г.И., Коломиец Н.Э., Величко Г.Н. РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИЛЛОХИНОНА (ВИТАМИНА К1) В РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ // Современные проблемы науки и образования. – 2014. – № 3.;URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=13736 (дата обращения: 02.09.2019). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
Опыт 1. Количественное определение витамина С.
Принцип метода. Метод основан на способности витамина С восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенол, который в кислой среде имеет красную окраску, а при восстановлении обесцвечивается; в щелочной среде окраска синяя. Для предохранения витамина С от разрушения исследуемый раствор титруют в кислой среде щелочным раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолом до появления розового окрашивания.
Для расчета содержания аскорбиновой кислоты в таких продуктах, как капуста, картофель, хвоя, шиповник и др., используют формулу:
где Х – содержание аскорбиновой кислоты в миллиграммах на 100 г продукта; 0,088 – содержание аскорбиновой кислоты, мг; А – результат титрования 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола, мл; Б – объем экстракта, взятый для титрования, мл; В – количество продукта, взятое для анализа, г; Г – общее количество экстракта, мл; 100 – пересчет на 100 г продукта.
Вывод: записать результаты опыта и расчётных данных.
Опыт 1.1. Определение содержания витамина С в капусте.
Порядок выполнения работы.
Отвешивают 1 г капусты, растирают в ступке с 2 мл 10% раствора хлористоводородной кислоты (HCl – Соляная кислота, хлористоводородная кислота, хлороводородная кислота), приливают 8 мл воды и фильтруют. Отмеривают для титрования 2 мл фильтрата, добавляют 10 капель 10% раствора хлористоводородной кислоты и титруют 2,6-дихлорфенолиндофенолом до розовой окраски, сохраняющейся в течение 30 с, на этом основан принцип метода реакции. Вычисляют содержание аскорбиновой кислоты в 100 г капусты по формуле, указанной выше. В 100 г капусты содержится аскорбиновой кислоты 25-60 мг, в 100 г шиповника 500-1500 мг, а в хвое 200-400 мг.
Опыт 1.2. Определение содержания витамина С в картофеле.
Порядок выполнения работы.
Отвешивают 5 г картофеля, растирают в ступке с 20 каплями 10 % раствора хлористоводородной кислоты (чтобы картофель не темнел). Постепенно приливают дистиллированную воду – 15 мл. Полученную массу сливают в стаканчик, ополаскивают ступку водой, сливают ее по стеклянной палочке в стаканчик и титруют 0,001 н. раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до розовой окраски, на этом основан принцип метода реакции. В 100 г картофеля содержится витамина С 1-5 мг.
Вывод: записать результаты опыта.
Опыт 1.3. Определение содержания витамина С в моче.
Определение содержания витамина С в моче дает представление о запасах этого витамина в организме, так как наблюдается соответствие между концентрацией витамина С в крови и количеством этого витамина, выделяемым с мочой. Однако при гиповитаминозе С содержание аскорбиновой кислоты в моче не всегда понижено. Часто оно бывает нормальным, несмотря на большой недостаток этого витамина в тканях и органах.
У здоровых людей введение per os 100 мг витамина С быстро приводит к повышению его концентрации в крови и моче. При гиповитаминозе С ткани, испытывающие недостаток в витамине, задерживают принятый витамин С и его концентрация в моче не повышается. Моча здорового человека содержит 20-30 мг витамина С или 113,55-170,33 мкмоль/сут. У детей уровень этого витамина понижается при цинге, а также острых и хронических инфекционных заболеваниях.
Методы количественного определения витаминов основаны на их физико-химических свойствах, таких как окислительно-восстановительные свойства, способность флуоресцировать в УФ-свете. Применяют различные методы определения: титрометрические, фотоколориметрические, спектрофотометрические, флуорометрические и др.
Количественное определение витамина К
Витамин К в листьях крапивы определяют методом СФМ (таблица 3).
Таблица 3 . Количественное определение витамина K в листьях крапивы (авторский метод)
Количественное определение БАВ в плодах шиповника.
Аскорбиновую кислоту можно определять титрометрическим методом, который основан на восстановлении 2,6-дихлорфенолиндофенола. С этим же реактивом можно провести фотоколориметрическое определение аскорбиновой кислоты. Для этого проводят экстракцию сырья 2 % метафосфорной кислотой, добавляют раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола. Через 35 сек. проводят фотоколориметрирование. Параллельно колориметрируют контрольный раствор 2 % метафосфорная кислота с 2,6-дихлорфенолиндофенолом. Интенсивность окраски пропорциональна количеству аскорбиновой кислоты.
Количественное определение аскорбиновой кислоты можно провести фотоколориметрическим методом с помощью гексацианоферрита калия. В кислой среде аскорбиновая кислота восстанавливает гексацианоферрит калия до гексацианоферрата калия, который в присутствии ионов железа (Ш) образует берлинскую лазурь, с последующим ее фотоколориметрированием.
Метод количественного определения аскорбиновой кислоты (по ГФ XI, вып. 2, стр. 294) основан на ее способности окисляться до дегидроформы раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята и восстанавливать последний до лейкоформы. Точка эквивалентности устанавливается появлением розового окрашивания, которое свидетельствует об отсутствии восстановителя, т. е кислоты аскорбиновой (2,6-дихлорфенолиндофенол имеет в щелочной среде синее окрашивание, в кислой - красное, а при восстановлении обесцвечивается):
1. Определение содержания аскорбиновой кислоты. (таблица 4). Из грубо измельченной аналитической пробы плодов берут навеску массой 20 г, помещают в фарфоровую ступку, где тщательно растирают со стеклянным порошком (около 5 г), постепенно добавляя 300 мл воды, и настаивают 10 мин. Затем смесь размешивают и извлечение фильтруют. В коническую колбу вместимостью 100 мл вносят 1 мл полученного фильтрата, 1 мл 2%раствора хлористоводородной кислоты, 13 мл воды, перемешивают и титруют из микробюретки раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л) до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30-60 с. Титрование продолжают не более 2 мин. В случае интенсивного окрашивания фильтрата или высокого содержания в нем аскорбиновой кислоты [расход раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолятанатрия (0,001 моль/л) более 2 мл], обнаруженного пробным титрованием, исходное извлечение разбавляют водой в 2 раза или более.
где 0,000088 - количество аскорбиновой кислоты, соответствующее 1мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л), в граммах; V - объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л), пошедшего на титрование, в миллилитрах; m - масса сырья в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.
Примечания . Приготовление раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л): 0,22 г 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия растворяют в 500 мл свежепрокипяченной и охлажденной воды при энергичном взбалтывании (для растворения навески раствор оставляют на ночь). Раствор фильтруют в мерную колбу вместимостью 1 л и доводят объем раствора водой до метки. Срок годности раствора не более 7 сут при условии хранения в холодном, темном месте.
Установка титра. Несколько кристаллов (3-5) аскорбиновой кислоты растворяют в 50 мл 2 % раствора серной кислоты; 5 мл полученного раствора титруют из микробюретки раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до появления розового окрашивания, исчезающего в течение 1-2 нед. Другие 5 мл этого же раствора аскорбиновой кислоты титруют раствором калия йодата (0,001 моль/л) в присутствии нескольких кристаллов (около 2 мг) калия йодида и 2-3 капель раствора крахмала до появления голубого окрашивания. Поправочный коэффициент вычисляют по формуле:
где V - объем раствора калий йодата (0,001 моль/л), пошедшего на титрование, в миллилитрах; V1-объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, пошедшего на титрование, в миллилитрах.
2. Определение содержания свободных органических кислот. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. 25 г измельченных плодов шиповника помещают в колбу вместимостью 250 мл, заливают 200 мл воды и выдерживают в течение 2 ч на кипящей водяной бане, затем охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл, доводят объем извлечения водой до метки перемешивают. Отбирают 10 мл извлечения, помещают в колбу вместимостью 500 мл, прибавляют 200-300 мл свеже-прокипяченной воды, 1 мл 1% спиртового раствора фенолфталеина, 2 мл 0,1 % раствора метиленового синего и титруют раствором натра едкого (0,1 моль/л) до появления в пене лилово- красной окраски.
где 0,0067-количество яблочной кислоты, соответствующее 1 мл раствора натра едкого (0,1 моль/л), в граммах; V - объем раствора натра едкого (0,1 моль/л), пошедшего на титрование, в миллилитрах; m - масса сырья в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.
Таблица 4. Количественное определение аскорбиновой кислоты в плодах шиповника (фармакопейный метод)
Количественное определение химических веществ в цветках календулы.
Каротиноиды определяют в лекарственном сырье фотоколориметрическим методом, основанном на измерении интенсивности их природной окраски. Разработан спектрофотометрический метод определения каротиноидов. Каротиноиды из сырья экстрагируют петролейным эфиром, затем хроматографируют на пластинке "Силуфол" в системе петролейный эфир-бензол-метанол (60:15:4), элюируют хлороформом и спектрофотометрируют при длине волны 464 нм (-каротин) при 456 нм (в-каротин).
- 1. Около 1 г (точная навеска) измельченных цветков ноготков, просеянных сквозь сито с отверстиями размером 1 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 50 мл спирта 70 %, колбу закрывают пробкой, взвешивают (с погрешностью ± 0,01 г) и оставляют на 1 ч. Затем колбу соединяют с обратным холодильником, нагревают, поддерживая слабое кипение в течение 2 ч. После охлаждения колбу с содержимым вновь закрывают той же пробкой, взвешивают и потерю в массе восполняют растворителем. Содержимое колбы тщательно взбалтывают и фильтруют через сухой бумажный фильтр, отбрасывая первые 20 мл, в сухую колбу вместимостью 200 мл (раствор А).
- 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл раствора алюминия хлорида, 0,1 мл кислоты уксусной и доводят объем раствора спиртом 96 % до метки и оставляют на 40 минут (раствор Б).
Через 40 минут измеряют оптическую плотность испытуемого раствора Б и раствора стандартного образца Б 1 на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны (408 + 2) нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя растворы сравнения для испытуемого раствора и стандартного образцов.
где: А - оптическая плотность испытуемого раствора;
А о - оптическая плотность раствора стандартного образца рутина;
а - навеска сырья, г;
а о - навеска стандартного образца рутина, г;
W - влажность сырья, %;
Допускается проводить определение содержания суммы флавоноидов с использованием удельного показателя поглощения рутина.
МОТИВАЦИОННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕМЫ
Рациональное питание человека требует сбалансированности не только по содержанию белков, жиров, углеводов, но и по содержанию микронутриентов. Результаты изучения фактического питания различных групп населения свидетельствуют о значительной распространенности полигиповитаминозов, недостаточности основных минеральных веществ и пищевых волокон. Устранение недостаточностей микронутриентов не может быть достигнуто простым увеличением потребления продуктов питания. Современные условия жизни и труда большинства населения приводят к уменьшению энергетических затрат, что обусловливает необходимость снижения количества потребляемой пищи и влечет за собой недостаточное потребление содержащихся в ней микронутриентов. Знания клинических проявлений недостаточностей микронутриентов, источников витаминов, минеральных веществ и пищевых волокон в питании, способах сохранения витаминной ценности продуктов, приемах профилактической витаминизации позволяют врачу оптимизировать статус питания пациентов.
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: ознакомить с биологической ролью, нормированием и источниками в питании микронутриентов и пищевых волокон; научить определению химического состава рациона питания по содержанию витаминов, минеральных веществ, пищевых волокон расчетным методом (на примере анализа меню-раскладки суточного рациона питания студента-медика), витаминосберегающим способам хранения и кулинарной обработки продуктов, профилактической витаминизацией.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ НА ЗАНЯТИИ
1. Определение качественного состава суточного рациона питания студента по содержанию витаминов, минеральных веществ, пищевых волокон расчетным методом (по меню-раскладке, составленной к теме 3.2.) с использованием «Таблиц химического состава и энергетической ценности пищевых продуктов».
2. Решение ситуационных профессионально ориентированных задач двух типов, оформление решения в протоколе.
3. Лабораторная работа по определению содержания витамина С в овощах. 3.1. Определение содержания витамина С в сыром и вареном картофеле; расчет процента потери витамина С при кулинарной обработке.
3.2. Определение содержания витамина С в капусте; расчет процента потери витамина С при хранении.
4. Заслушивание и обсуждение рефератов, подготовленных студентами
по индивидуальному заданию преподавателя.
ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ
1.Биологическая роль, нормирование, источники в питании водорастворимых витаминов.
2.Биологическая роль, нормирование, источники в питании жирорастворимых витаминов.
3. Виды витаминных недостаточностей.
4. Причины гиповитаминозов, их проявления.
5.Приемы сохранения и повышения витаминной ценности рационов питания, профилактика гиповитаминозов.
6.Биологическая роль, нормирование, источники в питании минеральных веществ.
7.Биологическая роль, нормирование, источники в питании пищевых волокон.
ПРОТОКОЛ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
"_____"___________20___г.
Таблица 46
Качественный состав суточного рациона питания студента
| Наименования блюд меню, набор продуктов на порцию | Масса, г | Витамины | Минеральные вещества | Пище-вые волок- на, г | ||||||||
| С мг | В мг | В мг | А мкг | D мкг | Ca мг | P мг | К мг | Fe мг | J мкг | |||
| ЗАВТРАК: | ||||||||||||
| 2-ой ЗАВТРАК: | ||||||||||||
| ОБЕД: | ||||||||||||
| УЖИН: | ||||||||||||
| ВСЕГО ЗА СУТКИ: |
2. Решение ситуационной задачи (тип 1) №____
__________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
Решение ситуационной задачи (тип2) №___
__________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
3. Определение содержания витамина С в овощах:
вид продукта _____________, навеска продукта ____________г,
количество 0,0001н. раствора иодноватокислого калия, пошедшего на тит-
рование пробы _____мл;
Формула для расчета:
а) сырой картофель _______ м, вареный картофель _______ мг,
потеря витамина С при кулинарной обработке _________%
б) капуста ______ мг, среднее содержание в капусте _____ мг,
потеря витамина С при хранении _____ %.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
Работу выполнил __________________
Подпись преподавателя _____________
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Дефиниции темы
АВИТАМИНОЗ - полное истощение витаминных ресурсов организма.
АНТИВИТАМИНЫ - соединения, частью или полностью выключающие витамины из обменных реакций организма путем их разрушения, инактивации или препятствуя их ассимиляции. Антивитамины делятся на 2 группы:
а) структуроподобные соединения (конкурентные ингибиторы; вступают с витаминами или их производными в конкурирующие отношения в соответствующих биохимических реакциях обмена веществ), к ним относятся сульфаниламиды, дикумарин, мегафен, изониазид и др.
б) структуроразличные соединения (природные антивитамины; вещества,
которые путем изменения молекулы или комплексного соединения с метаболитами частично или полностью лишают витамин его действия), к ним относятся тиаминаза, аскорбиназа, авидин и др.
ВИТАМИНЫ - необходимые для нормальной жизнедеятельности низкомолекулярные органические соединения с высокой биологической активностью, которые не синтезируются (или синтезируются в недостаточном количестве) в организме и поступают в организм с пищей. Биологическая роль водорастворимых витаминов определяется их участием в построении различных коферментов, жирорастворимых витаминов - в контроле функционального состояния мембран клетки и субклеточных структур.
ВИТАМИНЫ-АНТАГОНИСТЫ: В 1 и В 2 ; А и Д; никотиновая кислота и холин; тиамин и холин (при длительном введении с лечебными целями одного витамина обнаруживаются симптомы недостаточности другого).
ВИТАМИНЫ-СИНЕРГИСТЫ: С и Р; Р, С, К; В 12 и фолиевая кислота; С, К, В 2 ; А и Е; Е и инозит (при комплексном применении в поливитаминных препаратах могут усиливать биологический эффект друг друга). ГИПОВИТАМИНОЗ - резкое снижение обеспеченности организма тем или иным витамином.
СКРЫТАЯ (ЛАТЕНТНАЯ) ФОРМА ВИТАМИННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ не имеет каких-либо внешних проявлений и симптомов, однако, оказывает отрицательное влияние на работоспособность, устойчивость организма к различным неблагоприятным факторам, удлиняет выздоровление после перенесенного заболевания.
ПИЩЕВЫЕ ВОЛОКНА – высокомолекулярные углеводы (целлюлоза, гемицеллюлоза, пектины, лигнин, хитин и др.) главным образом растительного происхождения, устойчивые к перевариванию и усвоению в тонком кишечнике, но подвергающиеся полной или частичной ферментации в толстом кишечнике.
ВАЖНЕЙШИЕ ПРИЧИНЫ ГИПОВИТАМИНОЗОВ И АВИТАМИНОЗОВ
1. Недостаточное поступление витаминов с пищей.
1.1. Низкое содержание витаминов в рационе.
1.2. Снижение общего количества потребляемой пищи в связи с низкими энерготратами.
1.3. Потеря и разрушение витаминов в процессе технологической переработки продуктов питания, их хранения и нерациональной кулинарной
обработки.
1.4. Отклонения от сбалансированной формулы питания (преимущественно углеводное питание требует дополнительного количества тиамина;
при недостаточном введении полноценных белков витамины С, РР, В 1 быстро выводятся с мочой, не участвуют в обменных процессах, задерживается превращение каротина в витамин А).
1.5. Анорексия.
1.6. Присутствие витаминов в некоторых продуктах в неутилизируемой форме (инозит в виде фитина зерновых продуктов).
2. Угнетение кишечной микрофлоры, продуцирующей некоторые витамины (В 6 , К).
2.1. Болезни желудочно-кишечного тракта.
2.2. Последствия химиотерапии (дисбактериозы).
3. Нарушение ассимиляции витаминов.
3.1. Нарушение всасывания витаминов в желудочно-кишечном тракте
при заболеваниях желудка, кишечника, поражениях гепатобилиарной системы, а также в пожилом возрасте (нарушение секреции желчи, необходимое для всасывания жирорастворимых витаминов).
3.3. Нарушение обмена витаминов и образования их биологически активных (коферментных) форм при различных заболеваниях, действии токсических и инфекционных агентов, химиотерапии, в пожилом возрасте.
4. Повышенная потребность в витаминах.
4.1. Особые физиологические состояния организма (интенсивный рост, беременность, лактация).
4.2. Особые климатические условия (потребность в витаминах повышается на 30-60% в связи с повышенными энерготратами при низкой температуре воздуха в климатической зоне Севера).
4.4. Значительная нервно-психическая нагрузка, стрессовые состояния.
4.5. Воздействие вредных факторов производства (Рабочим горячих цехов в условиях воздействия высоких температур /32 градуса/ при одновременной физической нагрузке требуется вдвое больше витаминов С, В 1 , В 6 , пантотеновой кислоты, чем при 18 градусах).
4.6. Инфекционные заболевания и интоксикации (При тяжелых септических процессах потребность организма в витамине С достигает 300-500 мг в сутки).
4.7. Заболевания внутренних органов и эндокринных желез.
4.8. Повышенная экскреция витаминов.
5. Врожденные, генетически обусловленные нарушения обмена и функций витаминов.
5.1. Врожденные нарушения всасывания витаминов.
5.2. Врожденные нарушения транспорта витаминов кровью и через клеточные мембраны.
5.3. Врожденные нарушения биосинтеза витаминов (никотиновой кислоты из триптофана).
5.4. Врожденные нарушения превращения витаминов в коферментные
формы, простетические группы и активные метаболиты.
5.5. Нарушение включения витаминов в состав активного центра фермента.
5.6. Нарушение структуры апофермента, затрудняющее его взаимодействие с коферментом.
5.7. Нарушение структуры апофермента, приводящее к полной или частичной утрате ферментативной активности вне зависимости от взаимодействия с коферментом.
5.8. Усиление катаболизма витаминов.
5.9. Врожденные нарушения реабсорбции витаминов в почках.
Таблица 47
(в 100 г съедобной части)
| Продукты | В 1 | В 2 | РР | В 6 | С | Е | А | В-ка-ро-тин | D | В 12 | Фо-лие-вая кисл. | ||||
| Мг/100г | Мкг/100 г | ||||||||||||||
| Хлеб ржаной | 0,18 | 0,11 | 0,67 | 0,17 | - | 2,2 | - | - | - | - | |||||
| Хлеб пшенич. | 0,21 | 0,12 | 2,81 | 0,3 | - | 3,8 | - | - | - | - | |||||
| Крупа овсян. | 0,49 | 0,11 | 1,1 | 0,27 | - | 3,4 | - | - | - | - | |||||
| Крупа манная | 0,14 | 0,07 | 1,0 | 0,17 | - | 2,5 | - | - | - | - | |||||
| Крупа рисовая | 0,08 | 0,04 | 1,6 | 0,18 | - | 0,4 | - | - | - | - | |||||
| Крупа гречнев. | 0,53 | 0,2 | 4,19 | 0,4 | - | 6,6 | - | - | - | - | |||||
| Пшено | 0,62 | 0,04 | 1,55 | 0,52 | - | 2,6 | - | 0,15 | - | - | |||||
| Макароны | 0,17 | 0,08 | 1,21 | 0,16 | - | 2,1 | - | - | - | - | |||||
| Говядина | 0,07 | 0,18 | 3,0 | 0,39 | Сл | - | - | - | - | 2,8 | 8,9 | ||||
| Свинина | 0,52 | 0,14 | 2,4 | 0,33 | Сл | - | - | - | - | - | 5,5 | ||||
| Печень говяж. | 0,3 | 2,19 | 6,8 | 0,7 | 1,3 | 3,8 | 1,0 | - | |||||||
| Колбаса варен. | 0,25 | 0,18 | 2,47 | 0,19 | - | - | - | - | - | - | |||||
| Куры | 0,07 | 0,15 | 3,6 | 0,61 | - | - | 0,1 | - | - | - | 5,8 | ||||
| Яйца куриные | 0,07 | 0,44 | 0,2 | 0,14 | - | 0,3 | - | 4,7 | 0,1 | 7,5 | |||||
| Треска | 0,09 | 0,16 | 2,3 | 0,17 | Сл. | 0,9 | Сл. | - | - | 1,6 | 11,3 | ||||
| Икра осетр. | 0,3 | 0,36 | 1,5 | 0,29 | 7,8 | - | 0,2 | - | - | ||||||
| Молоко Пастер. | 0,03 | 0,13 | 0,1 | - | 1,0 | - | Сл. | 0,01 | - | - | - | ||||
| Кефир | 0,03 | 0,17 | 0,14 | 0,06 | 0,7 | 0,1 | Сл. | 0,01 | - | 0,4 | 7,8 | ||||
| Сметана | 0,02 | 0,1 | 0,07 | 0,07 | 0,2 | 0,5 | 0,2 | 0,1 | 0,1 | 0,36 | 8,5 | ||||
| Творог | 0,04 | 0,27 | 0,4 | 0,11 | 0,5 | 0,4 | 0,1 | 0,03 | - | 1,0 | 35,0 | ||||
| Сыры твердые | 0,02 | 0,3 | 0,3 | 0,1 | 1,6 | 0,5 | 0,2 | 0,1 | - | 2,5 | 10-45 | ||||
| Масло сливоч. | Сл | 0,01 | 0,1 | - | - | - | 0,5 | 0,34 | - | - | - | ||||
| Масло подсолнечное рафинирован. | _ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |||||
| Горох | 0,81 | 0,15 | 2,2 | 0,27 | - | 9,1 | - | 0,07 | - | - | |||||
| Картофель | 0,12 | 0,05 | 0,9 | 0,3 | 0,1 | - | 0,02 | - | - | ||||||
| Капуста белокачанная | 0,06 | 0,05 | 0,4 | 0,14 | 0,1 | - | 0,02 | - | - | ||||||
| Лук зеленый | 0,02 | 0,1 | 0,3 | 0,15 | - | - | - | ||||||||
| Томаты | 0,06 | 0,04 | 0,53 | 0,1 | 0,4 | - | 1,2 | - | - | ||||||
| Огурцы | 0,03 | 0,04 | 0,2 | 0,04 | 0,1 | - | 0,06 | - | - | ||||||
| Свекла | 0,02 | 0,04 | 0,2 | 0,07 | 0,1 | - | 0,01 | - | - | ||||||
| Морковь | 0,06 | 0,07 | 0,13 | 0,6 | - | - | - | ||||||||
| Грибы белые | 0,02 | 0,3 | 4,6 | 0,07 | 0,6 | - | - | - | - | ||||||
| Яблоки | 0,01 | 0,03 | 0,3 | 0,08 | 0,6 | - | 0,03 | - | - | 1,6 | |||||
| Абрикосы | 0,03 | 0,06 | 0,07 | 0,05 | 0,9 | - | 1,6 | - | - | ||||||
| Вишни | 0,03 | 0,3 | 0,4 | 0,05 | 0,3 | - | 0,1 | - | - | ||||||
| Малина | 0,02 | 0,05 | 0,6 | 0,07 | 0,6 | - | 0,2 | - | - | ||||||
| Земляника | 0,03 | 0,05 | 0,3 | 0,06 | 0,5 | - | 0,03 | - | - | ||||||
| Смородина чер. | 0,02 | 0,02 | 0,3 | 0,13 | 0,7 | - | 0,1 | - | - | ||||||
| Облепиха | 0,1 | 0,05 | 0,6 | 0,11 | - | - | - | ||||||||
| Шиповник сух. | 0,15 | 0,84 | 1,5 | - | - | - | 6,7 | - | - | - | |||||
| Виноград | 0,05 | 0,02 | 0,3 | 0,09 | - | - | Сл. | - | - | ||||||
| Лимоны | 0,04 | 0,02 | 0,1 | 0,06 | - | - | 0,01 | - | - | ||||||
| Апельсины | 0,04 | 0,03 | 0,2 | 0,06 | 0,2 | - | 0,05 | - | - | ||||||
| Пирожные, торты | 0,75 | 0,1 | 0,7 | - | - | - | 0,1 | 0,14 | - | - | - | ||||
| Дрожжи прессован. | 0,6 | 0,68 | 11,4 | 0,58 | - | - | - | - | - | - | |||||
Количественное определение аскорбиновой кислоты в исследуемом материале часто осуществляют с помощью раствора 2,6-дихлофенолиндофенола натрия, который в щелочной среде имеет синюю окраску, в кислой – розовую. Химизм реакции можно выразить в виде следующего уравнения.
Принцип метода основан на способности аскорбиновой кислоты восстанавливать индофеноловый реактив. При титровании вытяжки исследуемого материала раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола происходит окисление аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбиновую и восстановление индофенолового реактива. Конец титрования можно установить по изменению окраски. Окисленная форма 2,6-дихлорфенолиндофенола имеет синюю окраску в нейтральной и щелочной среде, восстановленная форма – приобретает розовую окраску в кислой среде.
Аскорбиновую кислоту извлекают из исследуемого материала 1 % раствором соляной кислоты и титруют раствором индофенолового реактива. По количеству краски, затраченной на титрование, рассчитывают содержание аскорбиновой кислоты.
Следует заметить, что точному определению содержания аскорбиновой кислоты в биологических объектах мешают другие, легко окисляемые вещества: глютатион, цистеин и т.п.
7.7.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ВИТАМИНА С В
РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ
Берут навеску исследуемого материала 5-20 г (в зависимости от предполагаемого содержания аскорбиновой кислоты), нарезают мелкими кусочками (картофель, морковь, черемша, яблоки и т.п.) тщательно растирают в ступке со щепоткой стекла или кварцевого песка, добавляя порциями по 4-5 мл раствора с массовой долей метафосфорной или соляной кислоты 2 % до получения однородной жидкой кашицы. Смесь из ступки количественно, с помощью раствора используемой при растирании кислоты, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и общий объем экстракта доводят до метки тем же раствором кислоты. Содержимое хорошо перемешивают, настаивают 5-7 мин и фильтруют через бумажный фильтр. Полученный фильтрат должен быть совершенно прозрачным.
Используемые для экстракции кислоты (соляная, метафосфорная, щавелевая) извлекают из исследуемого материала как свободную, так и связанную аскорбиновую кислоту, а также способствуют устойчивости аскорбиновой кислоты в экстрактах.
Берут две конические колбочки вместимостью 100-150 мл и в одну пипеткой вносят 20 мл полученного фильтрата, в другую – 20 мл раствора кислоты, используемой для растирания исследуемого материала. Содержимое колбочек титруют индофеноловым реактивом до слабо-розового цвета, удерживающегося 30 секунд. Результаты записывают, и титрование повторяют с новыми порциями того же фильтрата. На основании средней величины, полученной из 2-3 определений, рассчитывают содержание аскорбиновой кислоты по формуле:
,
(a-b) – разность между объемами индофенолового реактива, пошедшими на титрование опытной (а) и контрольной (b) проб, мл;
u - общий объем экстракта, мл;
u 1 – объем фильтрата, взятого для титрования, мл;
m – масса исследуемого материала, г,
100 – пересчет на 100г материала.
В растительных тканях в некоторых количествах содержатся и другие редуцирующие вещества, восстанавливающие 2,6-дихлорфенолиндофенол, поэтому при необходимости проведения особо точного анализа следует принять это в расчет. Для этого к двум другим порциям по 10-20 мл исследуемой вытяжки прибавляют по 0,1 или 0,2 мл 10 % раствора сернокислой меди и нагревают в термостате или сушильном шкафу 10 мин при температуре 110 ˚С. Охлаждают и титруют индофеноловым реактивом. В присутствии солей меди и при нагревании аскорбиновая кислота разрушается полностью. Полученную поправку вычитают из данных титрования опытных проб.
При анализе многих плодов и ягод, некоторых овощей получают окрашенные экстракты, что затрудняет определение аскорбиновой кислоты. Для определения аскорбиновой кислоты, окрашенную вытяжку переносят в широкую пробирку, приливают 2-5 мл дихлорэтана или хлороформа и титруют при взбалтывании раствором индофенолового реактива до появлении в слое дихлорэтана или хлороформа розового окрашивания, не исчезающего 30 сек.
При определении необходимо учитывать редуцирующую способность применяемых для экстракции кислот (смесь 20 мл 1 % соляной кислоты и 80 мл 2 % метафосфорной или 1 % щавелевой кислоты). Для этого две порции смеси кислот по 10 мл титруют индофеноловым реактивом до розового окрашивания. Полученную поправку (обычно не превышающую 0,08-0,10 мл раствора краски) вычитают из данных титрования опытных растворов.
|
2,6-ДИХЛОРФЕНОЛИНДОФЕНОЛА НАТРИЯ (ПО АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЕ)
|
|
Мaccy аскорбиновой кислоты (в мг), соответствующую 1 мл индофенолового реактива (раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола натрия), рассчитывают пo формуле:
где М – масса аскорбиновой кислоты в мг, соответствующая 1 мл индофенолового реактива;
(u-u 1) - разность между объемами индофенолового реактива, пошедшими на титрование пробы с аскорбиновой кислотой (u) и пробы без аскорбиновой кислоты (u 1), мл;
2 – масса аскорбиновой кислоты в мг, содержащаяся в опытной пробе (основной опыт).
7.7.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ВИТАМИНА С В МОЛОКЕ
Для определения аскорбиновой кислоты в молоке предварительно осаждают белки.
В колбочку наливают 50 мл молока и добавляют 4 мл насыщенного раствора щавелевой кислоты, взбалтывают, приливают 10 мл насыщенного раствора хлорида натрия, взбалтывают и оставляют при комнатной температуре на 5 мин. Затем содержимое колбочки фильтруют через бумажный складчатый фильтр, отмеривают пипеткой 20 мл фильтрата и титруют его индофеноловым реактивом до слабо-розового цвета, сохраняющегося 30 секунд. Берут еще 20 мл фильтрата и титрование повторяют. Для расчета берут средний результат.
Параллельно проводят контрольное определение, для чего в колбочке смешивают 50 мл воды, 4 мл насыщенного раствора щавелевой кислоты и 10 мл насыщенного раствора хлорида натрия. Далее поступают как в основном опыте.
,
где (a-b) – разность между объемами индофенолового реактива, пошедшего на титрование опытной и контрольной проб, мл;
64 – общий объем молока после добавления осадителей белка и жира;
М – масса аскорбиновой кислоты, соответствующая 1 мл индофенолового реактива (см. пункт 7.7.2.), мг;
u - объем фильтрата, взятого для титрования, мл;
u 1 - объем молока, взятого для анализа, мл.
РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; молоко свежее; картофель (лимоны,морковь, яблоки, капуста, черемша и т.п.); раствор с массовой долей метафосфорной или соляной кислоты 2 %; насыщенный раствор щавелевой кислоты; насыщенный раствор хлорида натрия; свежеприготовленный стандартный раствор аскорбиновой кислоты (в мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 100 мг аскорбиновой кислоты квалификации «медицинская» и, растворяя, объем доводят до метки раствором с массовой долей метафосфорной или соляной кислоты 2 %; индофеноловый реактив (в мерную колбу вместимостью 500 мл вносят 140-150 мг 2,6-дихлорфенолиндофенола натрия и 200-300 мл воды, энергично встряхивают до растворения краски, объем доводят до метки водой, перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр в сухую склянку из темного стекла; раствор хранят в холодильнике не более трех суток).
