La rabbia è una delle malattie infettive più pericolose e gravi ad eziologia virale. L'agente eziologico della rabbia (virus Neuroiyctes rabid) provoca danni gravi e irreversibili al sistema nervoso centrale. Il virus è resistente agli antibiotici, alle basse temperature, ma viene distrutto dal riscaldamento e dall'interazione con gli alcali. La maggior parte delle infezioni sono fatali.

Esistono la rabbia naturale, il cui meccanismo di trasmissione è associato all'attività degli animali selvatici (pipistrelli, lupi, volpi, puzzole, cani procione, ecc.) e il tipo urbano della malattia (animali coinvolti nell'agricoltura, gatti, cani). . Il tasso di mortalità più alto è nella percentuale di persone infette attraverso i morsi. cani randagi o domestici.

L'infezione da rabbia avviene attraverso il morso di un animale o il contatto con una ferita aperta della sua saliva infetta. Dopo l'introduzione del virus, si diffonde rapidamente attraverso tutti i messaggi e i sistemi del corpo umano. Attraverso i tronchi nervosi penetra nel sistema nervoso centrale e periferico, colpendo tutti i suoi dipartimenti. Le caratteristiche del virus indicano che si diffonde anche per via ematogena e linfogena.

"Gli animali sono la principale fonte di rabbia"

Sintomi

Il periodo di incubazione di questa malattia è di circa 1-2 mesi(in rari casi fino a un anno). Il termine dipende dalla posizione della lesione, dalla sua distanza dal cervello del paziente, dal numero di molecole virali entrate nella ferita. Dalla zona lesa, il virus della rabbia entra nel midollo allungato, dove provoca l'encefalite. La velocità con cui il virus si muove lungo le fibre nervose è di 3 mm/ora.

Ci sono tre fasi della rabbia negli esseri umani. Ognuno di essi è caratterizzato da sintomi specifici.

Periodo iniziale o prodromico

La sua durata va dalle 24 ore ai 3 giorni. I seguenti sintomi sono caratteristici:

• I primi segnali arrivano dal lato della ferita. Se a questo punto il sito del morso dell'animale è già guarito, il paziente avverte ancora una sensazione di bruciore o prurito. L'epidermide si infiamma;
• Appare una temperatura subfibrillare (37-37,3 ° C). Non oscilla ancora al di sopra di un dato livello;
• Si uniscono segni di malessere generale: mal di testa, debolezza, nausea, che si trasforma in vomito;
• Spesso il morso cade sul viso. In questo caso, la malattia si manifesta sotto forma di varie anomalie psicologiche. Ci sono allucinazioni visive o olfattive. Il paziente è perseguitato da immagini e odori inesistenti. Un brusco cambiamento di umore provoca uno stato depressivo, isolamento o, al contrario, aggressività, ansia;
• Mancanza di appetito, disturbi del sonno. I terrori notturni contribuiscono all'insonnia.

Fase di eccitazione

In questa fase, il virus si diffonde attivamente in tutti i sistemi umani. La sua durata è variabile da 2 a 3 giorni. I seguenti sintomi sono considerati tipici:

1. Un segno caratteristico della progressione della malattia è l'idrofobia nella rabbia. Se vuoi bere un sorso di liquido, la vittima sviluppa uno spasmo incontrollato dei muscoli della deglutizione e della respirazione. La loro compressione è così forte che può verificarsi il vomito.
2. Le condizioni del paziente sono caratterizzate da una maggiore sensibilità ai suoni forti, alle luci intense e ad altri stimoli esterni. La loro azione provoca aggressività, allucinazioni, forte eccitazione, delirio. Gli attacchi possono verificarsi periodicamente, durante il picco in cui il battito cardiaco di una persona si ferma per alcuni secondi, non c'è respirazione. Non appena passa l'attacco di rabbia, il paziente diventa di nuovo adeguato, il suo discorso viene compreso dagli altri.
3. Il polso di una persona infetta durante un attacco di panico accelera, la saliva scorre abbondantemente dalla cavità orale.
4. Ci sono convulsioni. Colpiscono, prima di tutto, i muscoli facciali.
5. La temperatura corporea sale anche fino a 40°C.

Stadio di paralisi

In questa fase, la malattia copre completamente l'intero corpo umano. La sua durata non è più di un giorno. Convulsioni e allucinazioni cessano di disturbare il paziente, sembra calmo, il che viene spesso percepito dagli altri come il progresso della guarigione. Dopo un breve periodo, si avverte un suono significativo e acuto salto di temperatura fino a 42°С. Allo stesso tempo, la pressione sanguigna scende al di sotto del livello critico, il battito cardiaco accelera. La morte avviene a causa della paralisi del miocardio o del centro respiratorio.

Nella maggior parte dei casi clinici, l’intero ciclo della malattia di una persona infetta dura dai 3 ai 7 giorni. A volte la morte per rabbia avviene il primo giorno dell'infezione, quando il quadro clinico è offuscato e la malattia progredisce rapidamente.

Diagnostica

Come dimostra la pratica, la diagnosi di laboratorio di questo virus negli esseri umani durante la vita è praticamente impossibile. Il test della rabbia viene spesso eseguito sulla base dei sintomi clinici. Questi includono:

• il fatto di un morso o il contatto con la saliva di un animale potenzialmente pericoloso sulla pelle umana;
• dolore al sito del morso anche dopo la completa guarigione dei tessuti molli;
• idrofobia, fotofobia;
• spasmi dei principali gruppi muscolari;
• paralisi;
• violazione della funzione respiratoria, deglutizione.

Un esame del sangue per la rabbia negli esseri umani rivela un numero elevato di globuli bianchi, un livello di emoglobina anormalmente alto e un numero di globuli rossi. Lo studio del biomateriale sanguigno registrerà anche un aumento dell'ematocrito.

Un metodo altamente accurato e altamente sensibile per la diagnosi in vivo della rabbia è uno studio ELISA della zona cutanea del collo, prelevata mediante biopsia (lungo l'attaccatura dei capelli). Il metodo consente di determinare in modo affidabile e rapido l'antigene del virus della rabbia, che è localizzato nelle terminazioni nervose adiacenti ai follicoli piliferi.

Trattamento

La malattia è incurabile se compaiono i suoi segni caratteristici. La profilassi post-esposizione (o PEP) può ridurre la dose del virus entrato nell’organismo.

Il suo obiettivo principale è fornire il primo soccorso corretto e tempestivo a una persona che ha subito un morso o un contatto che comporta il rischio di infezione da rabbia. Queste misure impediranno la penetrazione del virus nelle cellule del sistema nervoso centrale, che di solito porta inevitabilmente alla morte di una persona. La prevenzione dell’emergenza consiste nelle seguenti operazioni:

1. Abbondante disinfezione (lavaggio) e trattamento locale del sito del morso. Le manipolazioni devono essere eseguite immediatamente dopo il contatto! Utilizzare acqua e sapone, soluzioni contenenti iodio.
2. Rafforza le tue difese immunitarie con un vaccino antivirale potente ed efficace che soddisfa gli attuali standard dell'OMS.
3. L'introduzione dell'AIH (immunoglobulina antirabbica). Eseguito solo in presenza di determinate indicazioni.

Gli anticorpi contro il virus appariranno nel corpo non prima di 2 settimane dopo la prima vaccinazione. E il loro numero maggiore sarà notato un mese dopo la vaccinazione. Se esiste anche un piccolo rischio di accorciamento del periodo asintomatico, al paziente viene somministrata l'AIH. Non appena il corso sarà completato, il sistema immunitario della vittima si attiverà e inizierà a funzionare.

Viene effettuato anche un trattamento sintomatico intensivo. Durante il periodo di manifestazione di evidenti segni di rabbia, al paziente vengono prescritti antidolorifici, stimolanti cardiaci, sonniferi e sedativi. Nelle ultime fasi diventa necessario collegarsi ad un ventilatore.

Nonostante i farmaci e le pillole contro la rabbia sviluppati utilizzando le ultime tecnologie per l'uomo, le vittime continuano a morire a causa del terribile virus. I medici sono sicuri che la colpa sia della disattenzione delle persone e della loro mancanza di consapevolezza del pericolo della malattia.

Durante il periodo di trattamento, al paziente è vietato bere alcolici, ipotermia, rimanere in condizioni di temperature elevate (al sole, in un bagno). L'attività fisica pesante è altamente indesiderabile. Tutti questi fattori sono associati ad una diminuzione del tasso di produzione di anticorpi, ad un calo delle difese dell'organismo.

Prevenzione

Le misure che prevengono la rabbia negli animali domestici sono:

• rispetto delle regole stabilite per tenere i cani, registrarli, camminare con la museruola, tenere nelle voliere;
• vaccinazione obbligatoria (obbligatoria) contro la rabbia, che viene effettuata una volta all'anno.

La terapia immunitaria preventiva è indicata per le persone le cui attività professionali sono legate ad animali selvatici o domestici (cacciatori, veterinari, addetti alle trappole).

Se vieni comunque morso da un animale di strada o da compagnia di cui non conosci lo stato di salute, dovresti adottare le seguenti misure preventive:

1. lavare la ferita con una soluzione calda con sapone da bucato.
2. trattare i bordi dei tessuti molli danneggiati con alcool farmaceutico.
3. indossare una benda allentata e cercare un aiuto qualificato.

Al pronto soccorso il medico deciderà se il paziente ha bisogno di essere vaccinato. La sua attuazione è obbligatoria nei seguenti casi:

• contatto con la saliva di un animale sulle mucose di una persona;
• morsi di qualsiasi gravità e profondità che cadono sulla testa, sul viso, sulle mani;
• morsi profondi o multipli di un animale domestico;
• qualsiasi lesione o danno inflitto da animali selvatici (inclusa la saliva).

CONSIGLIO INTERSTATALE PER LA STANDARDIZZAZIONE. METROLOGIA E CERTIFICAZIONE

CONSIGLIO INTERSTATALE PER LA STANDARDIZZAZIONE. METROLOGIA E CERTIFICAZIONE

INTERSTATALE

STANDARD

ANIMALI

Edizione ufficiale

Modulo standard

Prefazione

Gli obiettivi, i principi di base e la procedura di base per lo svolgimento dei lavori sulla standardizzazione interstatale sono stabiliti da GOST 1.0 - 92 “Sistema di standardizzazione interstatale. Fondamenti delle disposizioni” e GOST 1.2-2009 “Sistema di standardizzazione interstatale. Standard interstatali. regole e raccomandazioni per la standardizzazione interstatale. Regole di sviluppo. accettazione, domanda, rinnovo e cancellazione"

A proposito della norma

1 SVILUPPATO dall'Istituto federale di bilancio dello Stato "Centro statale panrusso per la qualità e la standardizzazione dei medicinali per animali e mangimi" (FGBU "VGNKI")

2 INTRODOTTO dall'Agenzia Federale per la Regolazione Tecnica e la Metrologia della Federazione Russa

3 ADOTTATO dal Consiglio interstatale per la standardizzazione, la metrologia e la certificazione (verbale del 27 giugno 2013 n. 57-P)

Nome abbreviato del paese secondo MK (ISO 3166) 004-97	Codice paese n. MK (ISO 3166) 004-97	Nome abbreviato dell'ente nazionale di normalizzazione
		Ministero dell'Economia della Repubblica d'Armenia
Bielorussia		Stendardo statale della Repubblica di Bielorussia
Kirghizistan		Standard kirghiso
		Standard Moldavia
		Gosstandard
Uzbekistan		Uzsgandart

4 Con ordinanza dell'Agenzia federale per la regolamentazione tecnica e la metrologia del 30 settembre 2013 n. 1127-st, lo standard interstatale GOST 26075-2013 è stato adottato come standard nazionale della Federazione Russa dal 1 gennaio 2015

5 INVECE DI GOST 26075-54

Le informazioni sulle modifiche a questo standard sono pubblicate nell'indice informativo pubblicato annualmente "Norme nazionali" e il testo delle modifiche e degli emendamenti - nell'indice informativo pubblicato mensilmente "Norme nazionali". In caso di revisione (sostituzione) o cancellazione della presente norma, un avviso corrispondente sarà pubblicato nell'indice informativo pubblicato mensilmente "Norme nazionali". Informazioni, notifiche e testi rilevanti sono pubblicati anche nel sistema informativo pubblico - sul sito web ufficiale dell'Agenzia federale per la regolamentazione tecnica e la metrologia su Internet

© Standartinform, 2014

Nella Federazione Russa, questo standard non può essere riprodotto né completamente né parzialmente. replicato e distribuito come pubblicazione ufficiale senza il permesso dell'Agenzia federale per la regolamentazione tecnica e la metrologia

STANDARD INTERSTATALE

ANIMALI

Metodi per la diagnosi di laboratorio della rabbia

Metodi di diagnostica di laboratorio della rabbia

Data di introduzione - 2015 - 01 - 01

1 zona di utilizzo

La norma si applica a tutte le specie di mammiferi e stabilisce i seguenti metodi per la diagnosi di laboratorio della rabbia:

Metodo degli anticorpi fluorescenti (MFA);

Metodo per isolare il virus della rabbia in una coltura cellulare di neuroblastoma di topo CCL-131 (o neurinoma del nodo di Gasser del ratto - NGUK-1);

Saggio biologico su topi bianchi:

Metodo di dosaggio immunoassorbente legato a un enzima (ELISA);

Reazione di precipitazione diffusiva (RDP).

Appunti

1 Questi metodi sono applicabili a tutti i membri del genere Lyssavwus.

2 Il virus della rabbia di strada appartiene a microrganismi della 2a classe di patogenicità (rappresenta un pericolo mortale per l'uomo e gli animali).

3 Se è necessario genotipizzare il virus della rabbia utilizzando sistemi di test già pronti, viene utilizzato il metodo della reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa (RT-PCR).

2 Riferimenti normativi

Questo standard utilizza riferimenti normativi ai seguenti standard:

GOST ISO/IEC 17025 - 2009 Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e taratura

GOST 12.0.004 - 90 Sistema di standard di sicurezza sul lavoro. Organizzazione della formazione sulla sicurezza del lavoro. Disposizioni generali

GOST 12.1.005-68 Sistema di norme sulla sicurezza del lavoro. Requisiti sanitari e igienici generali per l'aria dell'area di lavoro

GOST 12.1.008 - 76 Sistema di standard di sicurezza sul lavoro. sicurezza biologica. Requisiti generali

GOST 12.4.011 - 89 Sistema di standard di sicurezza sul lavoro. Mezzi di tutela per i lavoratori. Requisiti generali e classificazione

GOST 17.0.0.01 - 76 Sistema di standard nel campo della protezione della natura e del miglioramento dell'uso delle risorse naturali. Punti chiave

GOST 177-88 Perossido di idrogeno. Specifiche GOST 2603 - 79 Reagenti. Acetone. Specifiche GOST 2768 - 84 Acetone tecnico. Specifiche GOST 4204 - 77 Reagenti. Acido solforico. Specifiche GOST 6709 - 72 Acqua distillata. Specifiche.

GOST ISO 7218 - 2011 Microbiologia degli alimenti e dei mangimi. Requisiti generali e raccomandazioni per gli studi microbiologici

GOST 8074 - 82 Microscopi strumentali. Tipi, parametri di base e dimensioni. Requisiti tecnici.

GOST 9147 - 80 Vetreria e attrezzature in porcellana da laboratorio. Specifiche GOST 9284-75 Vetrini per microscopio. Specifiche GOST 12026 - 76 Carta da filtro da laboratorio. Specifiche GOST 13739-78 Olio da immersione per microscopia. Requisiti tecnici. Metodi di prova

GOST 16317-87 Apparecchi elettrici di refrigerazione domestici. Specifiche generali

GOST 21241-69 Pinzetta medica. Specifiche generali.

GOST 22967 - 90 Siringhe per iniezione medica per uso multiplo. Requisiti tecnici generali e metodi di prova

GOST 24661 - 91 (ISO 7866 84) Siringhe per iniezione monouso

GOST 25046 - 81 (ISO 7864-81) Aghi per iniezione monouso. Dimensioni principali. Requisiti tecnici. Metodi di prova

GOST 25336 - 82 Vetreria e attrezzature da laboratorio. Tipologie, parametri fondamentali e dimensioni

GOST 29230 - 91 (ISO 835-4-81) Vetreria da laboratorio. Pipette graduate. Parte 4. Pipette per soffiaggio

Nota - Quando si utilizza questo standard, è consigliabile verificare la validità degli standard di riferimento nel sistema di informazione pubblica - sul sito web ufficiale dell'Agenzia federale per la regolamentazione tecnica e la metrologia su Internet o secondo l'indice di informazione annuale "Norme nazionali" , che è stato pubblicato a partire dal 1 gennaio dell'anno in corso, e lo emissioni dell'indice informativo mensile "Norme nazionali" per l'anno in corso. Se lo standard di riferimento viene sostituito (modificato), quando si utilizza questo standard è necessario essere guidati dallo standard sostitutivo (modificato). Se la norma richiamata viene cancellata senza sostituzione, si applica la disposizione in cui è dato il riferimento alla stessa, nella misura in cui tale riferimento non viene pregiudicato.

3 Termini, definizioni e abbreviazioni

3.1 I seguenti termini sono utilizzati nel presente standard con le rispettive definizioni:

3.1.1 rabbia: malattia infettiva dell'uomo e degli animali causata da membri della famiglia Rhabdoviridae del genere Lyssavirus (rhabDovirus) che porta alla morte nel 100% dei casi.

3.1.2 Virus della rabbia: agente eziologico di una malattia infettiva nell'uomo e negli animali.

3.1.3 antigene del virus della rabbia strutture proteiche superficiali del virus della rabbia contro le quali vengono prodotti anticorpi.

3.1.2 Metodo con anticorpi fluorescenti (MFA): metodo per rilevare l'antigene del virus della rabbia con anticorpi antirabbica marcati con fluoresceina eotiocianato, con la formazione di caratteristici complessi di inclusioni luminose che vengono rilevati nel campo visivo di un microscopio a fluorescenza .

3.1.3 metodo per l'isolamento del virus della rabbia in coltura cellulare di neuroblastoma murino CCL-131 (o neurinoma del ganglio di Gasser di ratto - NGUK-1): Metodo per l'isolamento dell'antigene del virus della rabbia. basato sulla riproduzione del virus in coltura cellulare e sulla sua identificazione mediante il metodo degli anticorpi fluorescenti.

3.1.3 saggio biologico: metodo per isolare il virus della rabbia nei topi bianchi iniettando loro una sospensione di materiale patologico, seguito dall'identificazione del virus con il metodo degli anticorpi fluorescenti.

3.1.4 Metodo di dosaggio immunoassorbente enzimatico (ELISA) per la rilevazione dell'antigene del virus della rabbia basato sulla sua interazione specifica con un anticorpo antirabbico immobilizzato su un supporto solido, seguita dal rilevamento dell'antigene legato utilizzando un secondo anticorpo marcato con un enzima mediante colorazione del prodotto della reazione con un cromogeno.

3.1.5 test di diffusione e precipitazione (RDP): un metodo per il rilevamento del virus della rabbia basato sulla capacità degli anticorpi e dell'antigene virale della rabbia di diffondere in un gel di agar e, in seguito a un'interazione specifica, formare un complesso antigene-anticorpo visibile a nudo occhio sotto forma di linea di precipitazione.

3.1.6 Metodo di reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa (RT-PCR) per rilevare il genoma del virus della rabbia traducendo la sequenza specifica di RNA del virus in DNA, seguita da ripetute copie del DNA risultante e rilevamento dei prodotti della reazione, effettuata in vitro .

3.2 Nella presente norma vengono utilizzate le seguenti abbreviazioni:

FAG - immunoglobulina antirabbica fluorescente;

ANG - globulina antirabbica;

CFG: controlla la globulina fluorescente;

PBS - soluzione tampone fosfato;

NGUK-1-neurinoma Nodo di Gasser del ratto;

FITC - isotiocinato di fluoresceina:

RNA - acido ribonucleico:

DNA - acido desossiribonucleico:

CCN31 - coltura cellulare di neuroblastoma murino:

OFD - ortofenildiammina;

TMB - tetrametilbenzidina.

4 Condizioni di ricerca e requisiti di sicurezza

4.1 Condizioni di ricerca

4.1.1 Requisiti generali per l'analisi microbiologica e il lavoro con microrganismi dei gruppi di patogenicità I - II - secondo GOST ISO 7218.

4.1.2 Requisiti generali per i locali - secondo GOST ISO 7218.

4.1.3 Requisiti per il personale - secondo GOST ISO 7218, GOST ISO / IEC 17025. (1).

I dipendenti qualificati con esperienza nel lavoro con microrganismi dei gruppi di patogenicità I-II, che hanno studiato i metodi di lavoro microbiologico, possono condurre ricerche. vaccinato contro la rabbia.

4.2 Requisiti di sicurezza

4.2.1 Requisiti generali di sicurezza per il lavoro in conformità con GOST 12.1.008.

4.2.2 I dispositivi di protezione per i lavoratori devono essere conformi ai requisiti di GOST 12.4.011.

4.2.3 L'aria dell'area di lavoro deve essere conforme ai requisiti di GOST 12.1.005.

4.2.4 Formazione del personale addetto alla sicurezza sul lavoro in conformità con GOST 12.0.004.

4.2.5 Smaltimento del materiale ottenuto per lo studio, nonché dei dispositivi di protezione individuale utilizzati, degli strumenti, ecc. effettuata mediante ebollizione per 30 minuti o autoclavaggio per 15 minuti ad una pressione di (0,11 ± 0,20) MPa.

5 Strumenti di misura, attrezzature, materiali, reagenti e animali

5.1 Per uso di ricerca:

Spettrofotometro a scansione con un intervallo spettrale di lunghezze d'onda da 190 a 1100 nm con un errore non superiore a ± 0,5 nm e un intervallo di misurazioni della densità ottica (OD) da 0,1 a 3,0;

Piastre per reazioni immunologiche da 96 pozzetti:

Termostato che mantiene la temperatura da 20"-C a 50°C:

Frigorifero domestico, che garantisce il mantenimento della temperatura da 0 ° C a 10 ° C secondo GOST 16317:

centrifuga da laboratorio;

bagnomaria;

Microscopio luminescente invertito secondo GOST 8074:

Mortai in porcellana con pestello secondo GOST 9147 o omogeneizzatore secondo GOST ISO/IEC 17025;

Diapositive secondo GOST 9284:

Provette in vetro secondo GOST 25336;

Piastre Petri secondo GOST 25336;

Cuvetta secondo GOST 25336;

Pipette con una capacità di 1,0; 2,0 e 10,0 cm 3 secondo GOST 29230;

Pipette automatiche con capacità da 0,05 a 0,20 cm 3 con puntali:

Pinzette mediche secondo GOST 21241:

Siringhe da insulina con una capacità di 1,0 cm 3 secondo GOST 22967 o GOST 24861;

Aghi per iniezione secondo GOST 25046:

Bicchieri per coltura a otto fori;

Gabbie per topi;

Acetone secondo GOST 2603 o GOST 2768;

Immunoglobulina antirabbica fluorescente (FAG);

Globulina antirabbica (AnG);

Globulina fluorescente di controllo (CFG);

Olio per immersione non fluorescente secondo GOST 13739;

Acqua distillata secondo GOST 6709;

Soluzione tampone fosfato con una concentrazione molare di 0,01 mol/dm 3 (PBS). pH 7,2 - 7,4;

- soluzione sterile di cloruro di sodio 0,9% isotonica:

Coltura cellulare di neuroblastoma murino CC31 o non erinoma del nodo di Gasser del ratto -

Penicillina;

Streptomicina;

Medium Needle MEM con doppio set di aminoacidi e vitamine (DMEM), pH 7,2;

Soluzione di trypsin 0,25%;

Siero di sangue embrionale di bovino per colture cellulari 10%;

Glutammina 3%;

Perossido di idrogeno 3% secondo GOST 177;

Una serie di preparativi per la diagnosi di laboratorio della rabbia animale mediante ELISA;

Una soluzione di acido solforico con una concentrazione molare di 2 mol / dm 3 secondo GOST 4204;

Carta da filtro secondo GOST 12026;

Timbro per realizzare pozzi;

Mertiolato;

Agar "Difko" o simile;

Soluzione di arancio metilico all'1% in etanolo al 50%:

Antigeni positivi e negativi;

Siero o immunoglobulina antirabbica;

Topi bianchi clinicamente sani del peso di 6-8 g.

5.2 È consentito l'uso di altri strumenti di misura con caratteristiche metrologiche e apparecchiature con caratteristiche tecniche non peggiori, nonché reagenti e materiali di qualità non inferiore a quelli sopra indicati. Sono consentite stoviglie usa e getta.

6 Campionamento

6.1 Per condurre ricerche sulla presenza del virus della rabbia, al laboratorio viene inviato materiale patologico: un cadavere fresco o una testa di piccoli animali, la testa o il cervello di animali di grandi dimensioni.

6.2 Il materiale patologico selezionato per la ricerca viene confezionato in un contenitore resistente all'umidità e consegnato al laboratorio in contenitori metallici. Il materiale congelato viene posto in un criocontenitore.

6.3 Il materiale patologico è accompagnato da un documento contenente i seguenti dati; nome e indirizzo del mittente, tipologia dell'animale, dati anamnestici e clinici ed eliootologici.

6.4 Gli studi di laboratorio vengono eseguiti immediatamente dopo il ricevimento del materiale patologico.

6.5 Per la ricerca, pezzi di tessuto da ciascuna parte del cervello (corna di Ammon, cervelletto, corteccia cerebrale, midollo allungato) di dimensioni pari a 0,5 - 1,0 cm vengono prelevati da animali di grandi dimensioni. Il cervello di piccoli animali, come i topi, viene esaminato come un'intera.

Solo campioni di tessuto cerebrale freschi o appena congelati sono adatti per lo studio dell'MFA e per il metodo di isolamento del virus della rabbia in una coltura cellulare di neuroblastoma murino CCL-131 (o NGUK-1). I campioni di cervello animale in decomposizione (nella fase di decadimento), conservati con glicerina, fissati con alcol metilico, formalina o altri mezzi che promuovono la comparsa di fluorescenza non specifica non sono ammessi alla ricerca.

Per l'impostazione di un test biologico è consentito utilizzare campioni di cervello conservati in una soluzione di glicerolo al 30%-50%*. Non è consentito l'uso di altri conservanti. Per la conservazione, il materiale patologico può essere congelato a una temperatura non superiore a meno 10 C.

7 Metodo con anticorpi fluorescenti (MFA)

7.1 Essenza del metodo

L'essenza del metodo degli anticorpi fluorescenti risiede nell'interazione specifica degli anticorpi antirabbici fluorescenti con l'antigene omologo del virus della rabbia. Il complesso antigene-anticorpo risultante marcato con FITC. viene rilevato visivamente da un caratteristico bagliore nel campo visivo quando osservato al microscopio a fluorescenza.

7.2 Preparazione allo studio

7.2.1 Preparazione del campione

7.2.1.1 Dai pezzi di tessuto selezionati secondo 6.5 su vetrini di vetro accuratamente sgrassati vengono preparati almeno tre preparati (impronte o strisci) da ciascuna parte del cervello. Se le condizioni del materiale patologico lo consentono, vengono preparate le stampe, in altri casi vengono realizzati degli strisci.

7.2.1.2 Preparazione delle stampe

Pezzi di tessuto selezionati secondo 6.5. mettere su carta da filtro piegata in quattro o sei strati. Il cervello di piccoli animali viene tagliato, catturando tutti i suoi dipartimenti, e messo con il lato tagliato rivolto verso l'alto su carta da filtro piegata in quattro o sei strati. La superficie tagliata viene toccata con un vetrino, premendolo leggermente fino ad ottenere una sottile impronta sul vetro.

7.2.1.3 Preparazione degli strisci

Un pezzo di tessuto da ciascuna parte del cervello (nei piccoli animali l'intero cervello), selezionato secondo 6.5. strofinato in un mortaio di porcellana con un pestello fino a formare una massa omogenea, dalla quale vengono realizzati strisci su vetrini.

7.2.1.4 Come controllo, si effettuano tamponi o impronte dal cervello di topi bianchi sani, esenti da rabbia e non vaccinati, come descritto ai punti 7.3.1.2 e 7.3.1.3.

7.2.1.5 Dopo la preparazione, gli strisci o le stampe vengono asciugati all'aria per 20-30 minuti. fissato in acetone refrigerato ad una temperatura di 4'C per 4 - 12 ore o ad una temperatura di meno 20 * C per 1 ora, dopodiché viene rimosso dall'acetone ed essiccato all'aria per 10 - 15 mJ.

7.2.2 Preparazione dei reagenti

FAG. Ang e KFG vengono sciolti con acqua distillata al volume iniziale indicato sull'etichetta della fiala. Periodo di validità degli acidi grassi disciolti. AnH e CFG a una temperatura di (5 ± 2) C - non più di due settimane.

Direttamente per lo studio, la quantità richiesta di FAG disciolto. AnG e KFG sono diluiti con FBI alla diluizione operativa indicata sull'etichetta della fiala. Diluizioni di lavoro dei FAG disciolti. Ang e CFG vengono utilizzati il ​​giorno della preparazione.

7.3 Conduzione dello studio

I vetrini con preparati (strisci o impronte) secondo 7.2.1 vengono posti in una camera umida (piastra Petri o cuvetta con fondo inumidito). Quindi, una delle tre preparazioni preparate viene rivestita con FAG in una diluizione di lavoro uniformemente su tutta la superficie dello striscio o dell'impronta utilizzando una pipetta. Alla seconda preparazione viene applicata la diluizione di lavoro di KFG. Chiudere la camera con i farmaci. posto in termostato alla temperatura di (37±1)*C e conservato per 30

min. Le preparazioni di controllo vengono colorate in parallelo. Al termine della colorazione i preparati vengono lavati tre volte, immergendoli ogni volta per 10 minuti in un recipiente con PBS. risciacquare con acqua distillata e asciugare all'aria per 20-30 minuti.

Alla terza preparazione si applica la diluizione di lavoro di Ang. posto in un termostato ad una temperatura di (37 ± 1) * C e incubato per 30 minuti. Successivamente il preparato viene lavato tre volte, immergendo ogni volta per 10 minuti in un recipiente con PBS. risciacquati con acqua distillata, asciugati all'aria per 20 - 30 minuti e colorati con la diluizione di lavoro di FAG. come descritto sopra.

7.4 Gestione dei risultati

Nelle preparazioni colorate, il tessuto cerebrale non colpito dal virus della rabbia si illumina debolmente. giallo grigiastro.

L'antigene del virus della rabbia viene rilevato nei neuroni e nelle cellule esterne sotto forma di granuli verde brillante di varie forme e dimensioni, da appena percettibili a con un diametro di 15-20 micron. A volte c'è un gran numero di piccole particelle verde brillante (fino a 1 micron di dimensione) di forma rotonda e ovale.

La diagnosi di rabbia è considerata stabilita se nel preparato studiato si trovano tipici granuli verde-giallastri in diversi campi visivi del microscopio. Allo stesso tempo, nei preparati di controllo (in strisci o impronte del cervello di topi bianchi sani senza rabbia, colorati con FAG), così come nei preparati studiati, colorati con CFG e pretrattati con AnG e colorati con FAG. tali formazioni non dovrebbero esistere.

I risultati dello studio vengono comunicati alle autorità competenti secondo la procedura vigente nel territorio dello Stato che ha adottato lo standard.

8 casi di risultato negativo, gli studi vengono effettuati su 8 o 9.

8 Metodo per l'isolamento del virus della rabbia in colture cellulari di neuroblastoma murino CCL-131

8.1 Essenza del metodo

L'essenza del metodo risiede nell'isolamento del virus della rabbia nella coltura cellulare del topo.

neuroblastoma CCL-131 o NGUK-1 con successiva identificazione mediante il metodo degli anticorpi fluorescenti.

Il metodo è un'alternativa al test biologico sui topi bianchi secondo 9.

8.2 Preparazione allo studio

8.2.1 Preparazione del campione

Parti uguali di tessuto prelevate sterilmente da ciascuna parte del cervello di un piccolo animale (corna di Ammon, cervelletto, corteccia cerebrale, midollo allungato), o pezzi di tessuto da ciascuna parte del cervello di un grande animale, prelevati secondo 6.5. pestate con le forbici e macinate in un mortaio o in un omogeneizzatore, aggiungendo gradualmente una soluzione sterile isotonica di cloruro di sodio allo 0,9% fino ad ottenere una sospensione al 10%. La penicillina e la streptomicina vengono aggiunte alla sospensione cerebrale rispettivamente in unità US/cm 3 e 1 mg/cm 3.

La sospensione risultante viene accuratamente miscelata e centrifugata per 5-10 minuti ad una velocità di 2000 giri al minuto. Il suddetto liquido sedimentario viene trasferito in una provetta sterile e conservato a una temperatura non superiore a 4 °C fino al momento dell'uso.

8.2.2 Preparazione dei vetrini colturali

Una coltura giornaliera di cellule di neuroblastoma murino CCL-131 (o NGUK-1) viene rimossa dal matraccio di coltura utilizzando una soluzione di trypsin allo 0,25% e diluita con terreno DMEM con siero bovino fetale al 10% e glutammina al 3% fino a raggiungere una concentrazione di cellule di 2 * 10 s. /cm3. 0,1 cm 3 della sospensione cellulare risultante vengono aggiunti ai pozzetti in vetro di coltura, coperti con un coperchio e posti in un incubatore g a CO umido con un contenuto di CO del 5% ad una temperatura di (37 ± 1) ° C per 18- 20 ore

8.3 Conduzione dello studio

0,05 cm 3 di sospensione da ciascuna parte del cervello vengono aggiunti a due pozzetti di vetro di coltura secondo 8.2.2. Su ciascun vetrino vengono lasciati due pozzetti per un controllo positivo e uno negativo. Come controllo positivo viene utilizzata una sospensione del cervello di un topo infetto dal virus della rabbia - ceppo CVS. Come controllo negativo viene introdotta una sospensione del cervello di un topo clinicamente sano. La provetta di coltura viene posta in un incubatore a CO2 umido con un contenuto di CO2 del 5% a una temperatura di (37 ± 1) *C per 42–48 ore.

Al termine dell'incubazione, il terreno viene rimosso dai pozzetti della vetro di coltura utilizzando una pipetta automatica, le cellule vengono lavate una volta con PBS (utilizzando una pipetta automatica, si aggiungono 0,2 cm 3 di soluzione in ciascun pozzetto) ed essiccate in un flusso d'aria laminare per 20 - 30 minuti. Quindi, a ciascun pozzetto vengono aggiunti 0,1 cm 3 di acetone raffreddato a una temperatura di meno 20 * C e lasciati a temperatura ambiente per 30 minuti.

Dopo la fissazione delle cellule, il vetro di coltura viene capovolto e agitato per rimuovere l'acetone, quindi essiccato in un flusso d'aria laminare per 20–30 minuti. Utilizzando un bisturi e una pinzetta, rimuovere l'ugello di plastica e asciugare il vetro per altri 5-10 minuti. A ciascun pozzetto vengono aggiunti 0,05 - 0,10 cm 3 di FAG in una diluizione di lavoro (selezionata empiricamente) preparata nell'FBI. posti in una capsula Petri bagnata e incubati a (37 ± 1) C per 30 minuti.

Al termine della colorazione, i vetrini vengono lavati tre volte, immergendoli ogni volta per 10 minuti in un recipiente con PBS. Quindi i preparati vengono risciacquati con acqua distillata ed essiccati all'aria per 20-30 minuti.

L'olio da immersione non fluorescente viene applicato alle preparazioni colorate e osservato al microscopio a fluorescenza.

8.4 Gestione dei risultati

Nelle preparazioni colorate, una coltura cellulare non infettata dal virus della rabbia si illumina debolmente. colore giallo-grigiastro (controllo negativo). L'antigene del virus della rabbia viene rilevato nel citoplasma della coltura cellulare sotto forma di granuli verde brillante di varie forme e dimensioni con bordi chiari e definiti (controllo positivo).

La diagnosi di rabbia è considerata stabilita se nella preparazione del test si trovano tipici granuli giallo-verdi in diversi campi visivi del microscopio.

Se il virus della rabbia non viene rilevato nella coltura cellulare, viene fatta una diagnosi negativa.

I risultati dell'isolamento del virus della rabbia nella coltura cellulare sono definitivi, non vengono condotti ulteriori studi.

9 Bistlerob su topi bianchi

9.1 Essenza del metodo

L'essenza del metodo risiede nell'isolamento del virus della rabbia mediante iniezione intracerebrale di materiale patologico in topi bianchi, seguito dall'identificazione del virus con il metodo degli anticorpi fluorescenti secondo 7.

9.2 Preparazione dei campioni per l'esame - secondo 6.2.1.

9.3 Conduzione dello studio

Cinque-sei topi bianchi vengono infettati con una sospensione im-tracerebrale di materiale patologico al 10% in un volume di 0,02 - 0,03 cm 3 . I topi infetti vengono posti in una gabbia separata, sulla quale è attaccata un'etichetta indicante la data dell'infezione, il numero dei topi, il metodo di infezione e il numero dell'esame del materiale patologico. Gli animali vengono osservati per almeno 30 giorni. Nel diario viene registrato il numero di topi sani, malati e morti.

9.4 Gestione dei risultati

Nella valutazione dei risultati si tiene conto della presenza di segni clinici nei topi infetti (pelo arruffato, assunzione di cibo, compromissione della coordinazione dei movimenti, paralisi, tremore, prostrazione). La morte dei topi nei primi due giorni dopo l'infezione non viene presa in considerazione. I campioni di cervello di animali malati e morti, a partire dal terzo giorno, vengono esaminati dal MAE entro il 7.

Un test biologico è considerato positivo se, a partire dal terzo giorno dopo l'infezione, almeno un topo si è ammalato ed è morto e sono state rilevate inclusioni specifiche del virus della rabbia nel campione di cervello utilizzando l'MFA.

Una diagnosi negativa può essere data solo dopo 30 giorni di osservazione, a condizione che tutti gli animali infetti rimangano vivi e sani.

I risultati del test biologico sono considerati definitivi, non vengono effettuate ulteriori ricerche.

10 Metodo di dosaggio immunoenzimatico (ELISA)

10.1 Essenza del metodo

8 L'ELISA si basa sull'interazione specifica dell'antigene del virus della rabbia con l'antielio. immobilizzato su un supporto solido. L'antigene legato viene rilevato utilizzando un secondo anticorpo antirabbico marcato con perossidasi. il cui prodotto di reazione viene colorato dopo l'aggiunta di un cromogeno. L'intensità della colorazione del prodotto di reazione è direttamente proporzionale alla quantità di antigene.

10.2 Preparazione all'esame

10.2.1 Come materiale di prova (antigene) vengono utilizzati campioni di tessuto cerebrale di animali morti, uccisi forzatamente, sospettati di rabbia o infettati sperimentalmente dal virus della rabbia.

10.2.2 Preparazione dell'antigene del test

I campioni di tessuto cerebrale ottenuti secondo 6.5 vengono frantumati, macinati in un mortaio e vengono preparate sospensioni al 10% * in soluzione isotonica di cloruro di sodio C.9%, riscaldate a bagnomaria a una temperatura di 60 * C per 15 minuti e centrifugate per 5-10 minuti a 2000 giri/min. Il surnatante viene utilizzato come antigene del test.

10.2.3 Preparazione dei reagenti

tutte le soluzioni e i reagenti prima di impostare la reazione devono essere mantenuti per almeno 30 minuti ad una temperatura di (22 ± 1)*C.

La preparazione dei componenti del kit viene effettuata secondo le istruzioni per l'uso.

10.3 Conduzione dello studio

10.3.1 L'ELISA viene effettuato in versione sandwich utilizzando i componenti inclusi nel kit per la rilevazione dell'antigene patogeno della rabbia nel materiale patologico.

Per l'ELISA vengono utilizzate piastre per reazioni immunologiche con fondo piatto.

Il volume degli ingredienti introdotti gradualmente nei pozzetti della compressa è uguale tra loro ed è

10.3.2 Sensibilizzazione della piastra

6 pozzetti di una piastra di polistirene vengono caricati con ANG alla diluizione di lavoro indicata sull'etichetta. La piastra con ANG viene coperta con un coperchio e incubata in un termostato a una temperatura di (37 ± 0,5) *C per 3 ore o a una temperatura di 4 *C per 18 ore. Dopo l'incubazione, i pozzetti della piastra vengono lavati tre volte con soluzione tampone di lavaggio. Agitare il contenuto dei pozzetti ad ogni lavaggio. e la soluzione rimanente viene rimossa picchiettando sulla carta da filtro.

10.3.3 Applicazione degli antigeni

8 file di piastre A. 8 e C aggiungono tampone di lavaggio. Gli antigeni di controllo positivi (pozzetto A1) e negativi (pozzetto A2) contenuti nel kit, nonché i campioni da testare (pozzetti AZ. A4, ecc.) vengono introdotti nei pozzetti della compressa e titolati verticalmente, ottenendo diluizioni da 1 : 2 a 1: 8. Con un numero elevato di campioni, riempire altre righe della compressa. La piastra viene coperta con un coperchio e incubata per 1 ora in un termostato ad una temperatura di (37 ± 0,5) *C.Al termine dell'incubazione, i pozzetti della piastra vengono lavati tre volte dagli antigeni non legati all'immunoglobulina, come descritto in 10.3.2.

10.3.4 Applicazione del coniugato della lerossidasi della rabbia

La diluizione di lavoro del coniugato con perossidasi antirabbica viene introdotta nei pozzetti della piastra, quindi coperta con un coperchio e incubata in un termostato a una temperatura di (37 ± 0,5) C per 1 ora. lavato tre volte come descritto al punto 10.3.2.

10.3.5 Stesura della miscela di substrato

Per la manifestazione della reazione, la miscela di substrato preparata viene aggiunta ai pozzetti della compressa. La reazione viene mostrata per 15 - 30 minuti ad una temperatura di (22 ± 0,5) *C al buio. La reazione viene bloccata aggiungendo una soluzione di acido solforico con concentrazione molare di 2 mol/DM 3 .

10.4 Gestione dei risultati

La contabilità della reazione viene effettuata visivamente o su uno spettrofotometro a scansione secondo le istruzioni per l'uso del kit.

Se OFD viene utilizzato come cromogeno nella miscela di substrato. quindi si effettua la misura della densità ottica a 490 nm. se si utilizza TMB. poi a 450 km.

Una reazione viene conteggiata solo se non è presente alcuna colorazione specifica nei pozzetti con antigene di controllo negativo mentre è presente una colorazione intensa nei pozzetti con antigene di controllo positivo. Durante il conteggio visivo, il campione è considerato positivo se almeno una (prima) diluizione mostra una colorazione specifica.

Quando si tiene conto spettrofotometricamente del risultato dell'ELISA, viene effettuato il calcolo del coefficiente di specificità K sp. che è uguale al rapporto tra la densità ottica (OD) del prodotto di reazione nei pozzetti con l'antigene di controllo positivo o il materiale di prova (OD) e la densità ottica della miscela di substrato nei pozzetti con l'antigene di controllo negativo (OD) . La reazione è considerata positiva. se il coefficiente di specificità è superiore a 2,1 e negativo se inferiore a 2,1.

OP1 * 0,641, OPg a 0,120, Ksp \u003d 5,34 - la reazione è positiva o OP1 \u003d 0,180, OPg a 0,120 K con „ * 1,5 - la reazione è negativa.

In caso di reazione positiva la diagnosi è considerata consolidata. Un risultato negativo deve essere confermato con altri metodi secondo 7 - 9.

11 Reazione di precipitazione diffusiva (RDP)

11.1 Essenza del metodo

L'essenza del metodo RDP risiede nella capacità degli anticorpi e dell'antigene virale di diffondersi in un gel di agar e, in seguito a un'interazione specifica, formare un complesso antigene-anticorpo, visibile ad occhio nudo sotto forma di una linea di precipitazione.

11.2 Preparazione all'esame

11.2.1 Preparazione del campione

Preparazione dei campioni per la ricerca - secondo 8.2.1.

Sono ammessi per la ricerca campioni di cervello animale stantio contaminati da microflora batterica.

11.2.2 Preparazione dell'agar

Per preparare l'agar, mescolare 1,5 g di agar Difko. 1 cm 3 soluzione all'1% di metilarancio in etanolo al 50%. 0,01 g di mertiolato. 100 cm 3 di soluzione isotonica di cloruro di sodio. La miscela risultante viene fatta bollire fino a completo scioglimento dell'agar, versata in provette, autoclavata ad una pressione di 0,5 atm per 30 minuti e conservata in frigorifero alla temperatura di 4°C.

11.2.3 Preparazione dei vetrini (piastre Petri)

La reazione viene posta su vetrini o su piastre Petri. Una goccia di agar fuso viene applicata su un vetro sgrassato, viene distribuita uniformemente sul vetro e lasciata a temperatura ambiente per 20-30 minuti per solidificare l'agar. Quindi sul vetro vengono applicati 2,5 cm 3 di agar fuso, formando uno strato di circa 2 mm di spessore. e lasciare agire per 20-30 minuti. I fori vengono praticati in uno strato congelato di agar utilizzando un timbro speciale o un tubo metallico a pareti sottili con un diametro di 4-5 mm. Le colonne di agar vengono rimosse con attenzione, senza danneggiare o consentire che un sottile strato di gel di agar si stacchi dal vetro, utilizzando una pinzetta per occhi o altro strumento.

Le piastre Petri vengono preparate in modo simile, aggiungendovi 10 - 15 cm 3 di agar fuso per ottenere uno strato di 2-3 mm di spessore.

11.3 Conduzione dello studio

Immediatamente prima di impostare la reazione si preparano delle diluizioni di siero antirabbico (immunoglobuline) alle quali si aggiungono in quattro provette 1,0 cm 3 di soluzione isotonica di cloruro di sodio. Aggiungere nella prima provetta 1,0 cm 3 di siero antirabbico, ottenendo una diluizione 1:2.

mescolare e trasferire 1,0 cm 3 della miscela in una seconda provetta, ecc. Si ottengono così quattro provette con diluizioni 1: 2,1: 4,1: 8 e 1:16.

8 pozzetti preparati contribuiscono con 0,05 - 0,07 cm 3 di un campione di cervello (ciascun campione in un pozzetto separato), ottenuto secondo 8.2.1. e diluizioni di siero o immunoglobulina antirabbica (1:2; 1:4; 1:8:1:16) secondo la Figura 1.

Figura 1 – Schema di applicazione del materiale

Ar - corno di Emmon; Pm - midollo allungato; A+ - antigene di controllo positivo; M - cervelletto; K - corteccia cerebrale; A- - antigene di controllo negativo.

è possibile utilizzare altri schemi per l'introduzione del materiale, ma l'uso di antigeni positivi e negativi è obbligatorio.

I vetrini con il materiale da testare vengono posti in piastre Petri con fondo inumidito o un essiccatore bagnato, quindi in un termostato a una temperatura di (37 ± 1) * C per 48 ore (le piastre Petri vengono coperte con un coperchio e poste in un termostato).

La reazione viene presa in considerazione dopo 6,24 e 48 ore.

11.4 Gestione dei risultati

La reazione è considerata positiva quando appare anche una sola linea di precipitazione di qualsiasi intensità tra i pozzetti contenenti il ​​materiale in esame e il siero antirabbico (immunoglobulina).

In questo caso si deve osservare una linea di precipitazione evidente tra l'antigene positivo e il siero antirabbico (immunoglobulina) e non deve esserci alcuna linea di precipitazione tra l'antigene negativo e il siero antirabbico (immunoglobulina).

In 8 casi di reazione positiva, la diagnosi è considerata stabilita. Un risultato negativo deve essere confermato con altri metodi secondo 7-10.

bibliografia

Guida UE alle buone pratiche di fabbricazione dei medicinali per uso umano e veterinario

UDC 619:616.98:579.852.1:615371 MKS 11.220

Parole chiave: rabbia, diagnostica, metodo con anticorpi fluorescenti, test immunoenzimatico, test biologico, reazione di precipitazione per diffusione

Firmato per la pubblicazione il 04/01/2014. Formato 60x84V

Uel. PVC. l. 1,40. Circolazione 31 eq. Zach. 1363.

Preparato sulla base della versione elettronica fornita dallo sviluppatore dello standard

FSUE "STANDARTINFORM"

123995 Mosca. Corsia del Granato, 4.

Nedosekov V.V., Vishnyakov I.O., Gruzdev K.N. VNIIVViM, VGNKI

Una delle malattie infettive più antiche e pericolose dell'umanità è la rabbia. Il pericolo rappresentato dalla rabbia per la vita di persone e animali, purtroppo, non tende a diminuire.

Il significato pratico di questa malattia è determinato dalla sua ampia distribuzione in molte specie animali, dall'elevata mortalità dei pazienti affetti da rabbia e dalla mancanza di trattamenti efficaci.

Nonostante il fatto che le epizoozie della rabbia siano attualmente sostenute principalmente da animali selvatici, gli esseri umani sono principalmente minacciati da cani e gatti. Pertanto, viene prestata particolare attenzione ai problemi relativi alla diagnosi di una malattia nei cani.

La diagnostica di laboratorio moderna e accurata della rabbia, in particolare la diagnostica rapida, rimane rilevante per la medicina veterinaria pratica.

La rabbia del cane viene diagnosticata sia post mortem che in vivo.

Diagnosi post mortem.

UN) rilevamento dell'antigene

Un metodo rapido e sensibile per diagnosticare la rabbia nei cani è il metodo degli anticorpi fluorescenti (MFA), basato sull'esame microscopico ai raggi ultravioletti di impronte, strisci e sezioni di tessuto crioconservate trattate con globulina antirabbica coniugata con isotiocianato di fluoresceina. In alternativa all'MFA, è possibile utilizzare sul campo una variante istochimica del test immunoassorbente enzimatico, che consente di identificare un antigene specifico sia nel materiale decomposto che in quello conservato; inoltre, per registrare i risultati del test è sufficiente un microscopio ottico .

Molto diffuso per la diagnosi della rabbia ricevuto "Sandwich" - una variante del test immunoassorbente enzimatico, il metodo si basa sull'assorbimento dell'antigene in diverse diluizioni su globuline specifiche immobilizzate, seguito dal rilevamento dell'antigene mediante globuline coniugate con perossidasi di rafano . Inoltre, nella reazione vengono utilizzati sia anticorpi policlonali che monoclonali, questi ultimi, ovviamente, sono più preferiti a causa della loro specificità, avidità, stabilità e assenza di reazioni non specifiche.

Uno dei test più accurati per la rilevazione dell'antigene della rabbia è la reazione a catena della polimerasi. Questo metodo consente di diagnosticare la rabbia anche in presenza di almeno un virione nel materiale. Il test si basa sul completamento complementare dello stampo di RNA, effettuato in vitro utilizzando l'enzima RNA polimerasi. Tuttavia, la reazione a catena della polimerasi non è ancora sufficientemente sviluppata per la diagnosi di routine della rabbia e non ha ancora trovato applicazione nei laboratori.

B) isolamento del virus in vitro

L'isolamento del virus può essere necessario per confermare i risultati dei test antigenici e per caratterizzare ulteriormente gli isolati. A questo scopo è ampiamente utilizzata una coltura cellulare di neuroblastoma murino (Na C1300). L’isolamento del virus nella coltura del neuroblastoma è almeno altrettanto efficace nel rilevare piccole quantità di virus della rabbia quanto nei topi infettanti. Inoltre, quando si utilizza questa coltura, il tempo richiesto per la diagnosi viene ridotto da 10-15 a 2 giorni, viene eliminata la necessità di animali da esperimento e il costo della ricerca viene significativamente ridotto. Tuttavia, nonostante ciò, l’infezione intracerebrale dei topi rimane un metodo importante per la diagnosi di laboratorio della rabbia canina.

Diagnosi in vivo.

Un aspetto importante della diagnosi di una malattia è la diagnostica per tutta la vita; fare una diagnosi il più precocemente possibile è di grande importanza per prendere una decisione sull’uso dell’immunoprofilassi. L'antigene virale può essere rilevato mediante MFA nelle impronte corneali o nelle biopsie cutanee di animali affetti da rabbia. Inoltre, il virus può essere isolato da alcuni tessuti e fluidi corporei, in particolare dalla saliva e dal liquido cerebrospinale. Tuttavia, se un risultato positivo del test indica la rabbia, un risultato negativo non esclude la possibilità di infezione.

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Causato dal virus della rabbia. Inoltre, non solo per l'animale stesso, ma anche per il suo ambiente (il proprietario e gli altri membri della famiglia). Il virus provoca infiammazione del cervello negli esseri umani e negli animali. Particolarmente sensibili alla malattia sono volpi, lupi, gatti, bovini grandi e piccoli, cani, pecore, capre, cavalli, ecc.. Gli animali domestici e gli esseri umani si infettano quando mordono. animale con la rabbia o dalla saliva che entra in contatto con la pelle rotta, le mucose o gli occhi. La saliva può diventare contagiosa fino a 10 giorni prima che compaiano i segni della rabbia.
Attualmente esistono descrizioni di altre vie di trasmissione: il metodo aereo (alimentare - attraverso cibo e acqua) e il metodo transplacentare (attraverso la placenta durante la gravidanza).
Il virus, diffondendosi lungo le vie nervose, raggiunge le ghiandole salivari e le cellule nervose della corteccia cerebrale e, colpendole, provoca gravi danni irreversibili.

malattia della rabbia animale registrati in tutto il mondo (le uniche eccezioni sono Giappone, Australia e Regno Unito).

Sfortunatamente, la Russia non è inclusa nell’elenco delle eccezioni. Mosca e la regione di Mosca sono anche un ambiente favorevole per la comparsa della rabbia negli animali domestici e selvatici.
Il virus è instabile nell'ambiente esterno: muore se riscaldato a 56 gradi in 15 minuti e quando bollito in 2 minuti. Il virus della rabbia è anche sensibile ai raggi ultravioletti e alla luce solare diretta. Tuttavia, il virus della rabbia è resistente alle basse temperature e agli antibiotici.

Il periodo di incubazione durante l'infezione da rabbia può durare da diversi giorni a diversi mesi (in media 3-6 settimane). La rabbia negli esseri umani può durare fino a un anno. La manifestazione del quadro clinico è preceduta da un periodo di latenza (incubazione). Anche l'animale è pericoloso in questo momento.

Sintomi e segni della rabbia negli animali

Segni di rabbia può comparire in un animale un paio di settimane dopo il morso di un animale rabbioso o il contatto con il virus. Presta attenzione al comportamento del tuo animale domestico. Qualsiasi comportamento inadeguato e innaturale dell'animale dovrebbe avvisarti ed essere più attento. In alcuni casi, la temperatura potrebbe aumentare.
Come sai, gli animali selvatici hanno paura degli umani. In caso di malattia gli animali selvatici possono avvicinarsi alla casa e attaccare anche il bestiame e le persone. Pertanto, se il tuo animale domestico inizia a comportarsi in modo aggressivo o eccessivamente affettuoso, allora questo è un serio campanello d'allarme per non correre rischi e chiamare un veterinario per un esame e una diagnosi della probabilità di rabbia.

Spesso sintomi aspecifici e diagnosi intravitali inaffidabili dovrebbero escludere opzioni "a caso", perché si tratta di conseguenze fatali non solo per l'animale, ma con un'alta probabilità anche per il proprietario.

Diagnosi della rabbia negli animali

La diagnosi viene effettuata sulla base di dati complessi e test di laboratorio. Oggi non esiste un metodo affidabile al 100% per la diagnosi a vita della rabbia negli animali utilizzati nella pratica veterinaria.
L'antigene virale vitale può essere rilevato utilizzando l'MFA nelle impronte della cornea degli animali affetti da rabbia. Inoltre, il virus può essere isolato da alcuni tessuti e fluidi corporei. Tuttavia, un risultato negativo di questo metodo non esclude la possibilità di infezione da rabbia.
Nella diagnosi post mortem della rabbia negli animali, i risultati sono più accurati, perché. vengono applicati altri metodi. Ad esempio, una delle diagnosi patoanatomiche esatte nello studio del cervello è il rilevamento di inclusioni specifiche (corpi di Babes-Negri). Inoltre, il metodo più importante rimane il test biologico: l'infezione intracerebrale.
Un ostacolo alla diagnosi della rabbia negli animali è anche la presenza di varie forme della malattia. I veterinari dividono convenzionalmente la manifestazione della rabbia in tre forme (alcune forme hanno stadi diversi).

Forme di sviluppo e decorso della rabbia negli animali (quadro clinico):

Forma violenta di rabbia:
1 fase. L'animale evita le persone, si nasconde in un luogo buio e appartato. Può apparire un comportamento atipico: aumento dell'affetto o aggressività passiva. In questo caso, può comparire prurito nel sito del morso. L'animale può leccare o mordere il punto di ingresso del virus (lesione). L'appetito diminuisce. Compaiono vomito, salivazione e allucinazioni. L'atto della deglutizione è difficile.
Fase 2. C'è un'aggressività pronunciata. L'ansia cresce, c'è la tendenza a mangiare oggetti non commestibili. Desiderio inconscio di muoversi. L'animale può mordere il proprio corpo (autolesionismo), rosicchiare oggetti circostanti, munizioni, terra. Attacco ad altri animali e persino al proprietario. L'animale non può ingoiare l'acqua. Per questo motivo, salivazione abbondante e incontrollata. Non è possibile mangiare. Manifestazione di convulsioni. Si verifica una paralisi parziale dei muscoli del viso e dei gruppi degli arti. Di conseguenza, si sviluppa lo strabismo, la mascella inferiore si abbassa, la lingua cade fuori dalla bocca.
3 fase (terminale - paralitico). Stato depressivo. Grave esaurimento del corpo, sviluppo della paralisi. L'animale mente quasi costantemente e cade in coma e coma. La morte avviene a seguito di arresto respiratorio dovuto alla paralisi dei muscoli respiratori.

Forma silenziosa di rabbia:
La forma silenziosa è caratterizzata dallo sviluppo di paralisi, salivazione, incapacità di mangiare. Dopo 2-4 giorni l'animale muore. La fase di eccitazione (furia) è di breve durata o assente.

Forma atipica di rabbia:
Forma atipica (viene diagnosticato il complesso). Possono verificarsi diarrea o atonia intestinale. Potrebbe esserci un miglioramento a breve termine della condizione, seguito da sintomi neurologici progressivi. Di conseguenza, l'animale muore. Questa fase del decorso della rabbia può durare fino a 3 mesi o più.

Nel bestiame prevale la forma silenziosa. L'eccitazione in questo caso è debolmente espressa, si notano muggiti rauchi, salivazione, andatura instabile, si sviluppa rapidamente la paralisi degli arti. Spesso un decorso atipico: rifiuto di nutrirsi, atonia del proventricolo, frequente bisogno di defecare, convulsioni, quindi si sviluppa paralisi. In forma violenta, al momento di una crisi, gli animali si liberano dal guinzaglio, ruggiscono, scavano il terreno, si gettano sui muri, attaccano altri animali della loro specie e sono particolarmente aggressivi nei confronti dei cani.
Nelle pecore e nelle capre la malattia procede quasi come nei bovini, ma la paralisi si sviluppa più velocemente (il secondo giorno).
Nei cavalli e nei maiali prevale la forma violenta.

Prevenzione della rabbia negli animali

Il più efficiente ed efficace metodo di prevenzione della rabbia animaleè la vaccinazione. Secondo la legge della Federazione Russa, la vaccinazione annuale è obbligatoria per tutti gli animali domestici e da allevamento. Oggi esiste un'ampia selezione di vaccini contro la rabbia negli animali, sia importati che nazionali. I vaccini moderni forniscono la formazione dell’immunità entro tre anni. La vaccinazione annuale contro la rabbia animale non rappresenta un pericolo per un animale domestico sano.

La rabbia (R) è una malattia acuta degli animali a sangue caldo caratterizzata da danni al sistema nervoso centrale. Gli animali domestici e selvatici di tutti i tipi, così come gli esseri umani, sono sensibili.

La malattia è registrata in varie regioni del globo. Non ci sono stati casi di diffusione della malattia in Australia, Gran Bretagna, Giappone. La malattia termina quasi sempre con la morte. Esistono infatti casi documentati di guarigione dalla rabbia nell'uomo e nel cane dopo un'infezione sperimentale.

Il virus della rabbia (virus della rabbia) appartiene alla famiglia Rhabdoviridae, genere Lyssavirus. È ormai accertato che la VB possiede 4 sierotipi, il che sembra dovuto alla differenza nella composizione delle proteine ​​di membrana. Tutte le varianti di VB sono immunobiologicamente correlate, ma differiscono nella virulenza. WB ha proprietà GA e GAD. Esiste una relazione lineare tra l’attività infettiva e quella GA. Gli animali immunizzati contro la rabbia producono anticorpi VNA, KSA, antiHA e litici (che distruggono le cellule infettate dal virus in presenza del complemento).

La diagnosi viene effettuata sulla base dei dati epidemiologici, dei sintomi della malattia, dei cambiamenti patologici (sono di minore importanza) e, principalmente, dei risultati degli esami di laboratorio.

Diagnostica di laboratorio consiste nello studio del cervello di animali per la rilevazione dell'AG virale in IF, RDP, nella rilevazione dei corpi di Babes-Negri e in un saggio biologico su topi bianchi.

Nella Federazione Russa, la produzione di kit per la diagnosi di B in IF e RDP è attualmente organizzata presso VNITIBP e KazNIVI.

Isolamento del virus. Cadaveri freschi di piccoli animali vengono inviati al laboratorio per la ricerca, da animali di grandi dimensioni: la testa o il cervello. In alcuni casi è consentito l'inscatolamento del cervello in glicerina al 50%. Il cadavere o la testa devono essere accuratamente imballati in un sacchetto di plastica, il cervello in un barattolo con un tappo di vetro o gomma smerigliato, pieno di paraffina. Il materiale è imballato in un contenitore a prova di umidità. Solo i cervelli non conservati sono adatti per studi virologici. Va ricordato che l'autopsia, l'estrazione del cervello e altre operazioni con materiale patologico devono essere eseguite in condizioni di sterilità e rigorosa osservanza delle misure di prevenzione personale: fissare saldamente la testa dell'animale, proteggere le mani con 2 paia di guanti ( chirurgico e anatomico), indossare occhiali per proteggere gli occhi e una benda di garza a 6 strati sul naso e sulla bocca.

Ricerca di laboratorio sui materiali la rabbia viene eseguita fuori turno; i risultati vengono immediatamente comunicati al medico aziendale e al primario del distretto (città).

Indicazione e identificazione del virus. L'ordine della ricerca: da ciascuna parte del cervello dei lati sinistro e destro (corno di Ammon, cervelletto, corteccia cerebrale e oblongata), vengono preparate 4 impronte per l'IF e il rilevamento dei corpi di Babesh-Negri; con il tessuto cerebrale mettere RDP; con risultati negativi, viene effettuato un test biologico.

Rilevazione di corpi inclusi specifici. Le macchie di impronte sono colorate secondo Sellers, Muromtsev o altri metodi. Dopo la colorazione i preparati vengono osservati al microscopio ottico con sistema ad immersione. La presenza di specifici corpi Babesh-Negri è considerata un risultato positivo (se colorato secondo Sellers - formazioni granulari ovali o oblunghe chiaramente definite di colore rosa-rosso nel protoplasma, quando colorato secondo Muromtsev - viola chiaro con inclusioni blu scuro di Babesh -Corpi Negri, più spesso si trovano all'esterno delle cellule nervose.

La caratteristica più caratteristica dei corpi di Babesh - Negri è la loro struttura interna, che permette loro di essere differenziati con assoluta precisione. All'interno sono visibili piccoli grani: grani basofili di colore blu scuro, anche nero, di dimensioni 0,2-0,5 micron.

Il valore diagnostico dell'individuazione dei corpi inclusi come prova dell'infezione da WB è generalmente riconosciuto. Tuttavia, negli animali sani, soprattutto nei gatti e nei topi bianchi, sono presenti formazioni la cui presenza può causare difficoltà diagnostiche. In alcuni casi, nel cervello del gatto, è possibile differenziare con sicurezza tali inclusioni dai corpi di Babes-Negri, e qui si consiglia di utilizzare metodi di identificazione, in particolare IF. Allo stesso modo, nei cani morti a causa di avvelenamento da veleno di serpente o scossa elettrica, si possono trovare corpi inclusi che ricordano i corpi di Babes-Negri. I corpi di Babesh-Negri vengono rilevati solo nel 65-85% dei casi di rabbia, quindi la loro assenza non è una risposta negativa e il materiale viene esaminato in altri test (IF, RDP, test biologico).

SE. Uno dei test principali nella diagnosi di B. Con prestazioni altamente qualificate, si ottiene una coincidenza del 99-100% con il metodo di dosaggio biologico. Di solito nella pratica diagnostica viene utilizzato il metodo diretto dell'IF, che viene effettuato utilizzando Ig fluorescenti antirabbica. La fissazione dei preparati in acetone refrigerato (8-10°C) viene effettuata per almeno 4 ore. Come controllo negativo vengono utilizzate strisci-impronte del cervello di topi bianchi sani. I risultati vengono presi in considerazione visivamente in un microscopio a fluorescenza sulla base della valutazione dell'intensità del bagliore del complesso AG-AT. AH VB viene rilevato come granuli giallo-verdi o verdi brillanti di varie forme e dimensioni nelle cellule (più spesso all'esterno delle cellule). La diagnosi è considerata confermata se in diversi campi visivi si trova un numero sufficiente (almeno 10) di granuli tipici con una luce verde brillante o molti piccoli punti, mentre nel controllo non dovrebbe esserci tale luce.

Per dimostrare la specificità della fluorescenza del complesso AG-AT viene utilizzato il metodo di soppressione IF, che consiste nella capacità degli AG della rabbia associati ad AT non fluorescenti di non ricombinarsi con AT specifici fluorescenti. Per fare ciò, preparazioni fisse preparate dal cervello in studio vengono rivestite con Ig antirabbica non fluorescente al 5%, incubate per 30 minuti a 37°C in una camera umida, lavate con soluzione salina e quindi colorate con antirabbico fluorescente Ig con il metodo diretto convenzionale. Non dovrebbe esserci fluorescenza nei preparati trattati in questo modo.

Il metodo IF consente di rilevare il WB nelle cellule della cornea degli occhi e di effettuare una diagnosi preliminare in vivo: durante la malattia degli animali, nonché 1-2 giorni o più prima della sua manifestazione clinica. Il metodo può essere utilizzato per studiare animali sospettati di malattia B, nonché cani e gatti clinicamente sani che hanno morso persone e animali. Per fare questo, vengono preparate le impronte della cornea, osservando tutte le regole di sicurezza personale, si apre la fessura palpebrale dell'animale con il pollice e l'indice e si preme la superficie del vetrino sul bulbo oculare leggermente sporgente, ritirandosi di 0,5 cm da fine. È necessario assicurarsi che l'animale non sbatta le palpebre con la terza palpebra, poiché le cellule epiteliali vengono rimosse dal vetro e si ottiene uno striscio di scarsa qualità. Da ciascun occhio vengono effettuate almeno 2 preparazioni contenenti 2 impronte. Per il controllo, le impronte corneali di animali sani vengono preparate in modo simile. Possono essere cucinati in fattoria. Le stampe vengono asciugate all'aria, fissate in acetone per 4 ore a 4°C, confezionate e inviate al laboratorio. Preparazioni di colorazione, come in IF, secondo il metodo generalmente accettato.

Nei preparati ottenuti da animali malati o alla fine del periodo di incubazione della malattia, nel citoplasma di molte cellule epiteliali si osservano granuli luminosi di varie dimensioni e forme diverse, da punti simili a polvere a 2 micron o più. Per ottenere risultati affidabili, in ciascuna preparazione vengono esaminate 50-100 cellule e in totale almeno 200-400 cellule dell'animale. I risultati della microscopia sono considerati positivi se nelle impronte della cornea dell'animale si trovano l'11% o più di cellule con caratteristici focolai di luminescenza. Va tenuto presente che nei preparati provenienti da animali sani (controllo), a causa dell'autofluorescenza, possono essere presenti singole cellule con focolai simili per forma e luminescenza.

È importante notare che l'IF consente di accelerare la risposta alla diagnosi finale mediante saggio biologico, poiché la diagnosi di B può essere stabilita solo dal 4° all'8° giorno dopo l'infezione dei topi con il materiale del test e il periodo di incubazione del la malattia nei topi può raggiungere i 20 giorni. L'IF può rilevare il WB nei tessuti della ghiandola salivare sottomandibolare. Gli strisci vengono preparati dalle ghiandole salivari sottomandibolari, prelevando materiale da almeno 6 diverse parti della ghiandola, poiché la distribuzione del virus al suo interno non è uniforme. Spesso, per ottenere un'impronta, è necessario esercitare una forte pressione, perché a causa dell'abbondanza di mucina, sul vetro rimane poco materiale.

È stata dimostrata la possibilità di identificare il VB nella pelle con il metodo IF: a questo scopo vengono prelevati campioni del cuoio capelluto, nonché follicoli piliferi sensoriali e tattili del muso o papille sensoriali laterali (sulla guancia del cane). I campioni vengono conservati a -20 o -70°C. Da essi vengono effettuate criosezioni, che vengono trattate con globulina fluorescente. I risultati dell'analisi IF ottenuti dall'identificazione del VB nella pelle sono in elevata correlazione con i dati ottenuti dallo studio del cervello dello stesso animale. È stata dimostrata una stretta correlazione tra il rilevamento del virus AH nei campioni cerebrali e nei tessuti delle labbra mediante il metodo IF.

PSR. Viene utilizzato per rilevare AH VB nel cervello non conservato di animali morti di rabbia stradale o di topi utilizzati in un test biologico. L'RDP viene posizionato mediante micrometodo su vetrini utilizzando un gel di agar all'1-1,5% secondo il metodo generalmente accettato. La percentuale più alta di risultati positivi si rileva utilizzando il seguente stencil: A - corno di ammonio (lato destro); B - corteccia cerebrale (lato destro); C - cervelletto (lato destro);
D - midollo allungato (lato destro); + (più) - controllo positivo; - (meno) - controllo negativo; 1, 2, 3, 4 - pozzetti con diluizione dell'immunoglobulina specifica 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, rispettivamente

Utilizzando una pinzetta, da ciascuna parte del cervello viene preparata una massa pastosa omogenea, che viene posizionata nei pozzetti corrispondenti. Dai topi, viene esaminato l'intero cervello. Dalle regioni cerebrali del lato sinistro, l'AG viene preparato in modo simile (per ogni esame sono necessari un totale di 4 vetrini con gel di agar). La reazione viene presa in considerazione dopo 6, 24, 48 ore.Se tra i pozzetti contenenti AG e immunoglobulina sono presenti 1 o 2-3 linee di precipitazione, la reazione è considerata positiva.

L'RDP è semplice da eseguire e specifico, ma la percentuale di rilevamento dell'AG virale nel materiale del test è 45-70. Nello studio del cervello dei topi ottenuto con un test biologico positivo, l'RDP rivela fino al 100% dei casi. L'assenza di corpi di Babesh-Negri, fluorescenza specifica e RDP negativo nel materiale in esame non danno motivo di escludere la presenza del virus. In questo caso, la diagnosi finale si basa sui risultati di un test biologico su topi bianchi, seguito dall’identificazione del virus.

Saggio biologico.È generalmente accettato che il test biologico sia un metodo più efficace rispetto alla rilevazione dei corpi di Babesh - Negri, IF, ecc. Tuttavia, in alcuni casi si è rivelato negativo, nonostante la conferma della diagnosi di B mediante la rilevazione di corpi inclusi e SE. La percentuale di risultati negativi del test biologico variava da 1,3 a 12.

Le informazioni sulla diversa efficienza di un test biologico possono essere spiegate da una serie di fattori: la scelta degli animali da esperimento, il loro numero nell'esperimento, il metodo di infezione, il metodo e il periodo di conservazione del materiale prima di entrare in laboratorio. Anche il fenomeno dell'interferenza delle particelle infettive con particelle inattive può svolgere un ruolo se per l'inoculazione viene utilizzato materiale non sufficientemente diluito.

Nel cervello e nelle ghiandole salivari delle volpi e delle puzzole morte di rabbia, è stata trovata una sostanza che inibisce l'infettività del virus, il che rende impossibile diagnosticare la malattia in questi animali mediante infezione intracerebrale dei topi. La presenza di una sostanza inibitrice nel materiale in esame non impedisce il rilevamento dell'AG virale da parte dell'IF; per le puzzole e le volpi, questo è il metodo diagnostico più sensibile.

Tra gli animali di tutte le specie (conigli, porcellini d'India, topi bianchi adulti e criceti) utilizzati per il test biologico, molti preferiscono i topi allattati perché sono più sensibili ai diversi ceppi di VB e meno pericolosi con cui lavorare. I criceti siriani non sono inferiori ai topi in termini di sensibilità, ma sono meno accessibili.

RSK. Il rilevamento dell'AH specifico nell'RSK nella diagnosi della rabbia viene utilizzato meno frequentemente rispetto ad altri metodi. L'AG viene preparato dal cervello inviato per la ricerca. A tale scopo, il tessuto cerebrale (particolarmente ricco di AG, leganti del complemento, pezzi del talamo e del tronco encefalico) viene triturato in tampone veronal in un rapporto di 1:10 e lasciato a temperatura ambiente per 1 ora, dopodiché la sospensione viene inattivato a 56°C per 5 ore.Tale trattamento uccide il virus e rimuove gli anticomplementari del tessuto cerebrale senza danneggiare l'antigene specifico. La sospensione viene centrifugata per 15 minuti a 3500 min-1 dal surnatante, che è un materiale per testare la presenza di AG, vengono preparate diluizioni crescenti di 2 volte da 1:2 a 1:64 e utilizzate per la ricerca nel CSC .

ELISA. Nell'ELISA, la colorazione specifica di AG nelle cellule cerebrali di animali morti di rabbia viene rilevata sia in campioni appena prelevati, conservati in glicerolo, sia in campioni conservati senza glicerolo a 20 ° C per 8-18 ore.Questo test è adatto per la diagnosi di routine della rabbia negli animali, per rilevare l'AG WB nelle sezioni di paraffina dei tessuti durante la fissazione dei preparati con una soluzione di formalina al 10% con pH 5,3 e il successivo trattamento dei preparati inclusi in paraffina con pepsina.

A differenza del ROP nei topi e nelle colture cellulari, l'ELISA può rilevare l'AT negli animali entro poche ore, l'ELISA è il metodo di laboratorio più promettente per rilevare l'AT e indicare il virus stesso. Un metodo rapido per diagnosticare la rabbia è la tecnica di cattura e il metodo IF per rilevare AH BB. È stato dimostrato che il metodo per rilevare AH VB in sezioni paraffinate mediante il metodo perossidasi-antiperossidasi è significativamente superiore al metodo ELISA. Nel 1987 è stato creato un kit per l'immunodiagnosi rapida enzimatica della rabbia (RREID), adatto per studi epidemiologici e di laboratorio.

Identificazione delle varianti tramite mAT. Con l'aiuto dei mAb contro le glicoproteine ​​WB, sono state selezionate le varianti AG, tra le quali sono state identificate varianti fenotipicamente termolabili (avirulente). Utilizzando 2 gruppi di mAb, è stato dimostrato che i ceppi di diluizione differiscono dai pz. Ceppi Fixe (Pasteur), CVS, Flury HEP, ERA e "duck" per i determinanti AH. Lo studio di 7 ceppi isolati da pazienti con persone B che utilizzavano mAb ha permesso di identificare alcune differenze tra questi e il ceppo vaccinale in relazione ai determinanti AH.

È generalmente accettato che le differenze AT tra ceppi wild-type possano essere rilevate utilizzando mAb contro il nucleocapside AT N, che reagisce con inclusioni citoplasmatiche di cellule infettate dal virus; anti-glicoproteine ​​(G AG), che reagiscono con le membrane delle cellule infette, lisano queste cellule in presenza di complemento e neutralizzano il virus. In relazione alla possibile variabilità dell'AH della glicoproteina di superficie WB proveniente da diverse aree geografiche, come AG protettivo è stata utilizzata una ribonucleoproteina caratterizzata dal conservatorismo della struttura AG. Pertanto, non solo la proteina G, ma anche l'RNP VB hanno attività protettiva.

Sierodiagnosi e diagnosi retrospettiva. Questi metodi non sono tipici della rabbia, poiché vengono utilizzati solo allo scopo di testare l'immunità post-vaccinazione. Per la rilevazione e la titolazione degli anticorpi post-vaccinazione viene utilizzato il pH, che viene impostato mediante il metodo generalmente accettato. Un WB fisso viene utilizzato come AG. L'RN sulle cellule BHK-21 era più sensibile dell'IF indiretto nel rilevare l'AT nei sieri delle volpi vaccinate. Inoltre, sono stati proposti RTGA ed ELISA.

RTGA. Non ha ancora trovato ampia applicazione nella pratica diagnostica a causa della presenza di inibitori non specifici nei sieri del sangue, ai quali WB è altamente sensibile e, soprattutto, GA AG, che non è stato sottoposto a sufficiente purificazione, aveva una bassa sensibilità. Per la preparazione di HA AG WB si propone di utilizzare pz. Mosca coltivata in coltura cellulare VNK-21 dopo il trattamento con saponina seguito da purificazione e concentrazione. L'HA viene separato dagli altri componenti del virione mediante ultracentrifugazione. La preparazione risultante aveva un grado di purificazione del 99,92%, aveva un'elevata attività GA (1:128), ben conservata per 1 mese a pH 5-9.

Prima di allestire RTGA, dovrebbe essere effettuata una moderata tripsinizzazione di 2 volte degli eritrociti d'oca per la loro sensibilizzazione. Quando si utilizza una sospensione allo 0,25% di eritrociti trypsinizzati (preferibilmente 10 7 cellule per 1 ml), la sensibilità dell'RTGA aumenta di 4 volte. Per diluire AG e sieri si utilizza una soluzione di sale borato (pH 9) con l'aggiunta dello 0,4% di albumina sierica bovina. Una sospensione di eritrociti viene preparata in una soluzione salina a pH acido, in modo che dopo la combinazione con una miscela di virus e siero, il cui pH è 9, il pH finale sia fissato entro 6,2. Dopo aver aggiunto la sospensione eritrocitaria nei pozzetti, il pannello viene agitato, sigillato con una pellicola trasparente e posto in ghiaccio. I risultati di RTGA vengono presi in considerazione dopo 40-50 minuti e con eritrociti di polli di 2 giorni o scimmie rhesus - dopo 1-1,5 ore.

È stato sviluppato un test radioimmunologico basato sulla capacità dell'AT di legarsi al 125 1-AG WB marcato. Le IgG marcate isolate dal siero iperimmune antirabbico possono essere utilizzate per rilevare l'AG WB con RIA in fase solida. I migliori risultati sono stati ottenuti utilizzando una soluzione di sale fosfato (pH 6,0) con forza ionica di 0,01 M e marcata IgG con un'attività di 200-250 mila impulsi / min.

La RIA competitiva in fase solida è applicabile per la rilevazione di anticorpi antirabbica nei surnatanti di siero e ibridomi.

Diagnosi differenziale. È necessario escludere la malattia di Aujeszky, in cui gli animali malati non sono aggressivi, non c'è perversione dell'appetito. Nei cani è esclusa la forma nervosa della peste. La rabbia è sospettata nell'encefalomielite infettiva equina. Un complesso di test di laboratorio consente di effettuare una diagnosi accurata della rabbia. È stato proposto un nuovo metodo per differenziare diversi ceppi di VB basato sulla scissione della restrittasi dei prodotti di amplificazione nella PCR del segmento del gene N.