2 tipi di definizione della tipizzazione del DNA. Tipizzazione genetica del tumore

Molto spesso vengono attualmente utilizzati due metodi di tipizzazione del DNA di microrganismi patogeni, basati sul metodo PCR. Nel primo caso vengono utilizzati uno o più primer corti di una struttura primaria arbitraria, lunga 6-15 nucleotidi, che, a causa delle loro piccole dimensioni, hanno una bassa specificità per specifici loci genetici e sono in grado di ibridarsi con molti siti di genomica DNA. Nel secondo caso vengono utilizzati specifici primer oligonucleotidici lunghi 20-27 nucleotidi, le cui sequenze fiancheggiano la sequenza nucleotidica studiata nel genoma batterico.

Riso. II.35. Schema di tipizzazione del DNA di microrganismi mediante PCR e primer di struttura arbitraria

UN– differenze ceppo-specifiche dovute alla diversa localizzazione delle regioni del DNA che interagiscono con i primer. Nel DNA dei ceppi 2 e 3 non esiste alcun sito presente nel DNA del ceppo 1, il che porta alla scomparsa della banda corrispondente del prodotto PCR sull'elettroferogramma; B– risultati dell'amplificazione del DNA contenente siti di legame per primer di localizzazione costante. Il DNA dei ceppi 2 e 3 contiene delezioni di diversa lunghezza tra i siti di legame dei primer. In alternativa, il DNA dei ceppi 1 e 2 può contenere inserti che non sono presenti nel DNA del ceppo 3. Ciò si riflette nelle lunghezze dei prodotti della PCR separati mediante elettroforesi. A, B - siti di legame dei primer sul DNA

Tipizzazione genetica di microrganismi utilizzando primer di struttura primaria arbitraria. L'uso di primer oligonucleotidici corti di struttura arbitraria si basa sul fatto che nei genomi di grandi dimensioni hanno più siti di atterraggio e, di conseguenza, siti di inizio PCR. Più corti sono questi primer, maggiore deve essere il numero di siti di atterraggio per essi. Uno dei limiti dell'ulteriore partecipazione di tali primer alla PCR sarà la distanza tra i due siti di atterraggio per primer diretti in modo opposto. Quanto più lungo è il prodotto di PCR che dovrebbe formarsi a seguito del funzionamento di tali primer, tanto meno affidabile funziona l'intero sistema di tipizzazione. In pratica, la lunghezza dei prodotti PCR formati con primer arbitrari è compresa tra 0,2 e 2,0 kb.

A seconda della localizzazione nel DNA dei siti di atterraggio per una coppia di primer corti, si possono formare due tipi di prodotti della PCR. Nel primo caso, le differenze nelle lunghezze dei prodotti di PCR sono dovute alla presenza sul DNA dei microrganismi tipizzati di un diverso numero di siti di legame per uno o entrambi i primer (Fig. II.35, UN). Nel secondo caso, tali differenze sono determinate dalla lunghezza dei segmenti di DNA ( ampliconi) racchiusi tra coppie di siti primer con il loro numero invariato in specifici loci genetici (vedi Fig. II.35, B). In pratica, entrambe queste possibilità possono essere realizzate contemporaneamente. Durante la tipizzazione genetica degli eucarioti con questi metodi, a volte funzionano fino a 100 ampliconi contemporaneamente, mentre nei batteri questo numero raggiunge solo 20.

Nonostante il fatto che le sequenze di primer siano scelte arbitrariamente nell'approccio discusso, il modello di amplificazione risultante è, di regola, specie e ceppo-specifico. In questo caso, il numero di siti di legame sullo stesso DNA per primer della stessa lunghezza ma con strutture primarie diverse può variare in modo significativo. Nella fig. II.35 mostra tali proprietà di venti primer a 10 nucleotidi testati su DNA umano, di fagioli e di S. aureus. Si può notare che l'utilizzo del primer AGGGGTCTTG, ad esempio, porta all'amplificazione di 8 ampliconi nel DNA umano, 3 ampliconi nel DNA di soia e non rileva un singolo amplicone nel DNA di S. aureus, mentre utilizzando il primer AATCGGGCTG primer, è possibile rilevare fino a 40 ampliconi nel DNA umano e nella soia e fino a 20 ampliconi nel DNA batterico. Pertanto, quando si utilizza il metodo discusso nella tipizzazione del DNA, il passo più importante è la selezione dei primer o delle loro combinazioni per la determinazione più efficace dell'appartenenza di un organismo a una particolare specie, ceppo o linea genetica.

Tipizzazione genetica di microrganismi mediante impronte genomiche. Un altro approccio alla tipizzazione genetica mediante PCR esamina il polimorfismo di loci specifici di cui è almeno parzialmente nota la struttura primaria. Sintetizzare primer oligonucleotidici specifici, i cui siti di legame fiancheggiano la sequenza di DNA studiata con una lunghezza di 1,5–2,5 kb. Dopo la PCR, le caratteristiche della struttura primaria dei prodotti della PCR vengono determinate mediante l'analisi di restrizione. La posizione dei siti di restrizione nella sequenza nucleotidica analizzata può essere specie-specifica o ceppo e fungere da marcatore genetico accurato di un particolare microrganismo.

Utilizzando questo metodo, che è essenzialmente una variazione del metodo di determinazione RFLP discusso sopra, vengono identificati ceppi di agenti patogeni strettamente correlati e simili nel fenotipo, vengono studiati la struttura genetica delle popolazioni di microrganismi e i meccanismi della loro variabilità adattativa.

11.2.2. Identificazione personale del DNA minisatellite: determinazione della paternità

L’accertamento della paternità è un grave problema sociale, giuridico e medico. La soluzione a questo problema è spesso richiesta in tribunale, nella risoluzione di controversie private, per la diagnostica prenatale (intrauterina), la consulenza genetica e i trapianti di organi. Ad esempio, solo negli Stati Uniti, nel 1990 sono stati eseguiti più di 120.000 test di paternità, e questo numero è in rapida crescita. Il mercato mondiale per tali sistemi di test diagnostici è stato stimato nel 1994 a più di 1 miliardo di dollari ed è oggi il mercato più grande nel campo della diagnostica genetica molecolare.

Con l'utilizzo di sistemi di test diagnostici basati sul DNA minisatellite, la determinazione della paternità ha ricevuto una solida base scientifica. A tal fine vengono attualmente utilizzati due approcci. Uno di essi utilizza sonde oligonucleotidiche specifiche per molti loci minisatelliti, mentre l'altro utilizza set di sonde (o primer) specifiche per singoli loci VNTR polimorfici (per ulteriori informazioni su VNTR, vedere la Sezione 1.3.1).

Aspetti teorici della possibilità di accertamento della paternità. La possibilità di determinare la paternità, così come di assegnare campioni biologici contenenti DNA a una o un'altra persona, si basa sulla presenza nel genoma umano di chiari marcatori genetici sotto forma di determinate sequenze di DNA, il cui insieme è unico per un particolare individuale. Teoricamente, tali marcatori potrebbero essere qualsiasi sequenza nucleotidica del DNA caratterizzata da un'elevata variabilità nelle popolazioni umane. Come notato sopra, le sequenze minisatelliti ripetute in tandem (VNTR) sono tra le sequenze nucleotidiche più polimorfiche nel genoma umano. Pertanto, non sorprende che venissero utilizzati per l'identificazione personale. La presenza di una combinazione di marcatori genetici tra VNTR comuni a un uomo, una donna e un bambino conteso può, in alcuni casi, indicare inequivocabilmente legami familiari tra di loro.

L'assenza di marcatori genetici comuni nel bambino esaminato e nell'uomo esclude chiaramente quest'ultimo come padre del bambino. Tuttavia, la scoperta di segni comuni in essi non può ancora essere la prova che l'uomo sospettato sia il padre. La prova della paternità si basa su semplici calcoli statistici che tengono conto delle frequenze di occorrenza nella popolazione degli alleli comuni dei loci VNTR studiati. Viene calcolato il rapporto (X/Y) tra la probabilità (X) di ottenere un insieme osservato di marcatori di un possibile padre reale e la probabilità (Y) di trovare questo insieme di marcatori in qualsiasi persona selezionata casualmente appartenente a questa popolazione. Questo rapporto di probabilità è chiamato indice di paternità(indice di paternità - PI).

Nel calcolare l'IP si pone un altro problema legato alla determinazione della probabilità (X) che il maschio esaminato sia il padre. Il valore di questa probabilità deve essere noto prima di eseguire qualsiasi test diagnostico. Il valore comunemente utilizzato di 0,5 non può essere considerato sufficientemente ragionevole in tutti i casi specifici. Fortunatamente, a valori PI molto elevati (>10 4 ) che di solito si ottengono in tali studi sul DNA, la scelta di questa probabilità iniziale risulta essere praticamente insignificante. Di norma, ciò è dovuto a valori bassi della probabilità Y.

Determinazione della paternità utilizzando sonde oligonucleotidiche specifiche per più loci VNTR. Nel 1985 l'I.O. Jeffries e colleghi hanno dimostrato per la prima volta che sonde oligonucleotidiche complementari a sequenze del gene della mioglobina umana hanno simultaneamente la capacità di ibridarsi secondo Southern con più loci di DNA minisatellite. Si è scoperto che i profili di ibridazione erano specifici per i singoli individui. L'insieme dei frammenti di restrizione separati elettroforeticamente del DNA analizzato, rilevati dopo ibridazione con sonde marcate specifiche per loci minisatelliti polimorfici, è chiamato Impronte digitali del DNA o impronte genetiche. Utilizzando queste e altre sonde oligonucleotidiche simili, è possibile rilevare fino a 15-20 diversi frammenti di DNA di un individuo, il cui peso molecolare supera i 3,5 kb, nonché molti frammenti più piccoli che non vengono presi in considerazione nel determinare la paternità, su un elettroforegramma con questo metodo.

Riso. II.36. Esempi di esclusione e prova di paternità mediante tipizzazione del DNA

I risultati dell'ibridazione Southern con la sonda F10 mostrano la completa identità dei frammenti di DNA nel bambino e nel padre (corsie 2 e 3), che è considerata prova di paternità, o rivelano almeno 6 frammenti di DNA aggiuntivi nel bambino, indicati dalle frecce, che sono assenti dal padre (tracce 5 e 6 esclusione paternità)

Nella fig. II.36 mostra i risultati di uno di questi esperimenti. L'interpretazione delle impronte digitali del DNA ottenute dall'analisi di loci multipli si basa su tre postulati. Innanzitutto si presuppone che i frammenti di DNA visibili sulle impronte digitali siano prodotti allelici di singoli loci genetici umani e vengano trasmessi alla prole indipendentemente l'uno dall'altro. In secondo luogo, per ciascun locus genetico, si ritiene che le frequenze di occorrenza nella popolazione dei singoli alleli seguano una normale distribuzione di Poisson. E, infine, è accettato che i frammenti di DNA, la cui mobilità elettroforetica corrisponde, rappresentino lo stesso allele di un particolare locus. L’esperienza accumulata lavorando con le impronte digitali del DNA mostra che la prima ipotesi è rispettata abbastanza bene: allelismo(accoppiamento di geni omologhi che determinano diversi tratti fenotipici negli organismi diploidi) e il collegamento genetico tra i loci studiati sono raramente osservati. Il mancato rispetto della seconda ipotesi non influisce seriamente sui risultati del test, poiché le conclusioni vengono tratte senza tenere conto della frequenza di comparsa di un singolo allele in base alla coincidenza della struttura (frammenti di DNA) di molti loci. Il terzo postulato è più controverso, ma la sua applicazione conferisce stabilità ai valori dell’indice di paternità.

Con queste condizioni iniziali, la valutazione statistica delle impronte digitali del DNA di più loci si basa su un solo parametro: la proporzione media di frammenti di DNA ( X), che coincidono nelle persone senza legami familiari. Questo parametro dipende più dalla tecnica della ricerca di laboratorio che dalle proprietà della popolazione studiata. Innanzitutto si tratta della capacità del sistema utilizzato per la separazione elettroforetica dei singoli frammenti di DNA (cioè la risoluzione del metodo utilizzato), dei principi per selezionare specifici frammenti di DNA per l'analisi e dei criteri per decidere sull'identità dei i frammenti di DNA confrontati. Pertanto, il parametro x può variare confrontando i risultati ottenuti in diversi laboratori, ma queste differenze persisteranno sempre per popolazioni e sottopopolazioni diverse. In effetti, utilizzando, ad esempio, le sonde 33.6 e 33.15, si è scoperto che X lo stesso negli individui non imparentati, nelle coppie marito-moglie e nei diversi gruppi etnici.

Riso. II.37. Confronto del contenuto informativo di due sonde minisatellitari per l'identificazione personale

Le frequenze di occorrenza dei loci minisatelliti D1S7 ( UN) e D1S80 ( B) di una certa dimensione nella popolazione è stata valutata mediante ibridazione Southern dopo digestione del DNA con un enzima di restrizione Ehi III ( UN) o PCR ( B). Il locus D1S7 è caratterizzato da una distribuzione unimodale quasi continua, mentre il locus D1S80 è caratterizzato da una minore eterozigosità (84%) con un piccolo numero di alleli discreti, caratterizzati da una distribuzione multimodale.

Determinazione della paternità utilizzando sonde di DNA specifiche per un solo locus. Le impronte digitali del DNA ottenute dallo studio simultaneo di molti loci riflettono il fenotipo dell'individuo piuttosto che il suo genotipo. In effetti, l'immagine risultante contiene molte bande di DNA, comprese le frazioni non separate e quelle debolmente separate. Un tale elettroferogramma ricorda un tratto fenotipico complesso, come la forma del viso di una persona, che è il risultato dell'espressione di un numero enorme di geni. Al contrario, utilizzando sonde di DNA, che sono sequenze clonate di minisatelliti e interagiscono con un solo locus, si possono ottenere informazioni vere sul genotipo dell'organismo in studio. Pertanto, quando si tratta di singoli loci umani polimorfici, i ricercatori mettono le mani su un sistema alleli codominanti(cioè alleli, congiuntamente coinvolti nella formazione dei tratti fenotipici), ereditati secondo le leggi di Mendel. È stata la comprensione dell'ereditarietà di tali loci minisatelliti che ha portato all'uso diffuso del metodo del locus singolo per determinare la paternità.

Ad oggi sono stati ottenuti centinaia di cloni di DNA minisatellite e sulla base di essi sono state sviluppate combinazioni di sonde adatte a determinare la paternità. La selezione delle sonde per tali loci minisatelliti è solitamente guidata dai seguenti criteri: le sonde devono avere una rigorosa specificità del locus e i loci testati devono essere non collegati (trasmessi alla prole in modo indipendente) e avere stabilità genetica sufficiente, ma non eccessiva. In particolare, tra le sonde più utilizzate, MS1 (D1S7) corrisponde ad un locus genetico che è eterozigote nel 99% dei casi, ma muta con una frequenza molto elevata (0,05 per gamete) e quindi, nonostante l'elevato contenuto informativo , non viene utilizzato per determinare la paternità ( Fig. II.37, UN). Allo stesso tempo, il locus D1S80 con variabilità significativamente inferiore (84% degli eterozigoti) è caratterizzato dalla formazione di cluster nelle frequenze della distribuzione di un frammento di DNA lungo la lunghezza (vedi Fig. II.37, B). Pertanto, piccoli errori nel determinare la lunghezza degli alleli possono portare a errori significativi nella stima della frequenza della loro occorrenza. Tali loci cambiano piuttosto facilmente a causa della deriva genetica e della consanguineità.

Attualmente è stata sviluppata una teoria che indica quanti loci dovrebbero essere tipizzati per ottenere la risposta corretta sulla paternità dati i valori noti di eterozigosi di questi loci nella popolazione. Ad esempio, se si utilizzano loci con il 90% di eterozigosi, è necessario analizzare sei di questi loci per stabilire la paternità. Negli Stati Uniti, per questi scopi viene attualmente comunemente utilizzata una serie da tre a cinque sonde a locus singolo. Le sonde a locus singolo hanno una bassa risoluzione rispetto ai fratelli ( fratelli). In particolare, una di queste sonde può rilevare differenze genetiche tra fratelli solo con una probabilità del 75%, e questa probabilità aumenta al 99,6% quando vengono utilizzate quattro sonde. Questo fatto assume particolare importanza quando, per determinare la paternità, è necessario fare una scelta tra fratelli.

Peculiarità della determinazione della paternità mediante loci individuali mediante PCR. In alternativa alle sonde a locus singolo, la PCR viene spesso utilizzata per determinare la paternità. I singoli loci mini e microsatelliti possono essere amplificati con primer complementari alle sequenze uniche di DNA che fiancheggiano queste sequenze ripetitive. Quando si identifica una persona, il metodo PCR, che nella sua essenza è una delle varietà della tecnica a locus singolo, poiché si occupa di loci individuali, presenta almeno due vantaggi rispetto alle sonde a locus singolo. Innanzitutto, il polimorfismo di popolazione delle lunghezze del DNA degli alleli studiati utilizzando questo metodo è più discreto di quello degli alleli studiati utilizzando sonde a locus singolo (vedere Fig. II.37, UN,B). Questa circostanza facilita il successivo calcolo dell'indice di paternità. In secondo luogo, il metodo PCR è molto più sensibile e può essere utilizzato nell'analisi di campioni contenenti<1 нг геномной ДНК и полученных из разных источников (см. раздел 11.1.1).

Gli svantaggi della PCR quando applicata alla determinazione della paternità includono il basso contenuto di informazioni dei microsatelliti polimorfici e dei minisatelliti corti. Ciò è dovuto al fatto che lo hanno fatto<90% гетерозиготности, небольшим числом аллелей и имеют тенденцию к образованию кластеров по размерам (см. рис. II.37,B). Inoltre, la distribuzione di tali sequenze nel genoma è influenzata dalla consanguineità e dall'appartenenza degli individui a determinati gruppi etnici. Il numero di loci minisatelliti che devono essere esaminati mediante PCR per determinare la paternità si avvicina 11 e loci microsatelliti - 18.

Tre loci minisatelliti umani sono più comunemente utilizzati per la tipizzazione PCR: nel gene dell'apolipoproteina B (APOB), D17S5 (noto anche come locus D17S30) e D1S80. Tutti e tre i loci vengono facilmente amplificati (la dimensione massima delle loro varianti alleliche non supera 1 kb) e vengono facilmente rilevati mediante elettroforesi. Tuttavia, sono caratterizzati da un basso livello di eterozigosi e da una bassa variabilità (che si esprime in un piccolo numero di alleli conosciuti). Le mutazioni in questi microsatelliti sono molto rare.

Uno dei modi per aumentare il contenuto informativo dei polimorfismi dei microsatelliti durante la tipizzazione del DNA è l'amplificazione simultanea di due loci microsatelliti strettamente collegati, le cui combinazioni formano un insieme aplotipi. Ad esempio, l'amplificazione simultanea di due ripetizioni GATA situate nell'introne 40 del gene del fattore von Willebrand, separate da una sequenza di 212 bp, ha rivelato un livello di eterozigosità totale del locus combinato di circa il 93%. Allo stesso tempo, i livelli di eterozigosi dei singoli loci erano rispettivamente solo del 72 e del 78%.

In conclusione, va notato ancora una volta che, logicamente, i metodi moderni per determinare la paternità basati sulla tipizzazione del DNA sono alquanto contraddittori. Se una conclusione negativa sulla paternità, basata sulla mancata corrispondenza degli alleli dei loci mini o microsatelliti analizzati, è assoluta e al di là di ogni dubbio, allora una conclusione positiva può essere raggiunta solo con un certo grado di probabilità, che si basa sulla frequenza di presenza di alleli specifici dei loci analizzati nella popolazione. D'altro canto, a causa di errori metodologici si possono facilmente trarre conclusioni false negative, ma una conclusione positiva sulla paternità a seguito di un errore metodologico di laboratorio è praticamente esclusa.

L'elevato contenuto di informazioni delle impronte digitali del DNA multilocus è stato confermato da un gran numero di studi genetici e di popolazione. L’evidenza empirica di migliaia di famiglie ha dimostrato che le indagini multilocus possono risolvere tutti i casi di paternità controversi. L'uso di sonde a locus singolo è ostacolato dall'impossibilità di creare una classificazione completa degli alleli corrispondenti nella popolazione a causa della loro distribuzione dimensionale apparentemente continua. Tuttavia, in questo caso, in pratica, il problema è completamente risolto utilizzando un set da cinque a sei sonde a locus singolo. L'uso della PCR è limitato dal grande conservatorismo evolutivo dei loci mini e microsatelliti amplificati e, di conseguenza, dal basso numero totale di alleli. Tuttavia, la PCR può essere molto utile nelle prime fasi dello studio per la semplicità metodologica dell'impostazione degli esperimenti, soprattutto in condizioni di scarsa disponibilità del materiale biologico iniziale. Tutti e tre i gruppi di metodi si completano bene a vicenda e, in varie combinazioni, in casi controversi, consentono di identificare in modo univoco la personalità di una persona.

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Nomenclatura

Papillomavirus umano, HPV, papillomavirus umano, HPV

Descrizione

L’HPV è l’infezione a trasmissione sessuale più comune. Colpisce principalmente l'epitelio, ne stimola la crescita e porta alla formazione di verruche genitali, verruche, erosioni. Si conoscono più di 100 tipi di papillomavirus. È possibile che una persona sia portatrice di più tipi di virus contemporaneamente.

Alcuni tipi di virus (oncogenici), se integrati nel genoma delle cellule epiteliali (integrazione), possono provocarne la trasformazione maligna, portando al cancro. Il trasporto dei tipi HPV 16 e 18 è considerato il più pericoloso, poiché è molto probabile che porti allo sviluppo del cancro cervicale nelle donne.

Metodo di trasmissione

Contatto (con contatti genitale-genitale, genitale-orale, genitale-anale), verticale (da madre a figlio), domestico.

Periodo di incubazione

Si va da diverse settimane a diversi anni.

Funzionalità di prova

L'analisi dell'infezione utilizzando il metodo della reazione a catena della polimerasi (PCR) consente una determinazione sensibile e specifica della presenza dell'agente patogeno e ne determina anche la tipologia.

Oppure la tipizzazione del DNA è un sistema di identificazione basato sull'identificazione delle differenze genetiche tra individui o organismi. Ogni essere vivente (ad eccezione dei gemelli identici) è geneticamente unico. Le tecniche di tipizzazione del DNA sono progettate per rilevare le più piccole differenze genetiche nella sequenza di alternanza degli elementi costitutivi che compongono il DNA. Questi blocchi, i nucleotidi adenina, timina, citosina e guanina, sono comunemente indicati come A, T, C e G.

A volte la tipizzazione del DNA viene utilizzata per confrontare le sequenze nucleotidiche del DNA di due individui al fine di determinare la loro somiglianza. In altri casi, gli scienziati sono interessati a identificare la somiglianza di un campione di DNA con una sequenza nota di un campione di controllo. Attualmente, la tipizzazione del DNA è una delle tecniche biotecnologiche più potenti e ampiamente utilizzate. Viene utilizzato per rilevare le più piccole differenze nella composizione dei campioni di DNA, anche per determinare la compatibilità di un donatore e un ricevente durante il trapianto di organi e tessuti, per identificare microrganismi specifici, per tracciare i geni necessari nel processo di selezione delle piante, per stabilire paternità, identificare i resti, regolare la riproduzione degli animali in condizioni zoo.

Metodi di tipizzazione del DNA

Gli scienziati hanno sviluppato due approcci per rilevare le più piccole differenze nei geni. Ciascun metodo presenta vantaggi e svantaggi ed entrambi vengono utilizzati nella ricerca di base e applicata, nei centri clinici, nella medicina legale e nei laboratori commerciali. La scelta del metodo dipende dal problema in questione, dalla quantità di DNA disponibile, dalla capacità di purificare il campione, dal costo accettabile e dall'urgenza. A volte gli approcci sono combinati.

Una tecnica, chiamata analisi di restrizione, utilizza enzimi naturali per tagliare il DNA in aree strettamente fisse. A causa delle differenze nelle sequenze nucleotidiche, gli enzimi tagliano il DNA di individui diversi in punti diversi. I segmenti di DNA risultanti hanno dimensioni diverse e compongono un ritratto o impronta del DNA, unico per ogni individuo. Il confronto di serie di frammenti di DNA fornisce la prova indiscutibile della coincidenza o meno dei campioni studiati.

Un altro metodo di tipizzazione del DNA, la reazione a catena della polimerasi (PCR), si basa sul meccanismo mediante il quale le cellule effettuano la duplicazione del DNA prima di dividersi in due. La PCR fornisce migliaia di copie di specifici frammenti di DNA in poche ore. Come l'analisi di restrizione, la PCR consente di confrontare campioni di DNA per determinarne l'origine. Inoltre, può essere utilizzato per rilevare la presenza o l'assenza di frammenti di DNA specifici nel campione. Pertanto, la PCR consente di diagnosticare rapidamente e con un alto grado di precisione malattie come e, identificare i geni che determinano la predisposizione dell'individuo a varie forme di cancro e altre malattie, oltre a fornire una migliore protezione dell'individuo dall'HIV / AIDS.

Per rilevare con successo differenze minime nella struttura delle molecole di DNA, gli scienziati devono prestare attenzione alle regioni del DNA che presentano un elevato grado di variabilità. Questo è uno dei motivi per cui spesso viene data la preferenza piuttosto che no. non solo ha un grado maggiore di polimorfismo rispetto a quello nucleare, ma è anche caratterizzato da un metodo di ereditarietà unico: quasi tutto va al corpo dalla madre.

La tipizzazione del DNA in medicina legale

In molti Stati, l'introduzione della tipizzazione del DNA nella pratica della medicina legale ha ricevuto riscontri positivi, poiché è stata utilizzata per dimostrare il coinvolgimento di un gran numero di detenuti nei crimini di cui erano accusati. Ha inoltre garantito la riabilitazione di numerosi cittadini accusati ingiustamente.

La diffusa introduzione della tipizzazione del DNA nella magistratura ha portato alcuni stati ad approvare leggi che richiedono la tipizzazione obbligatoria del DNA dei delinquenti accusati di reati sessuali e di altro tipo per il successivo inserimento nei database statali. Le principali forze dell'ordine sperano di unire alla fine i database dell'FBI e dei singoli stati per creare un unico database nazionale che consentirebbe di confrontare il materiale genetico di una scena del crimine con i dati sugli autori noti nel più breve tempo possibile.

La tipizzazione del DNA viene utilizzata anche per identificare resti umani, ad esempio per identificare soldati sconosciuti o vittime di disastri. Ora tutto il personale militare americano inserisce campioni di DNA nel database, il che garantisce un'identificazione affidabile anche in caso di smarrimento del distintivo di metallo del soldato con il numero di registrazione.

Stabilire la paternità

È possibile stabilire la paternità mediante la tipizzazione del DNA perché il bambino riceve metà del materiale genetico dal padre biologico. Se necessario, mediante l'analisi di restrizione, viene effettuato un confronto delle impronte digitali del DNA della madre, del bambino e del presunto padre. Innanzitutto, dal test vengono rimossi frammenti del DNA del bambino, simili a quelli della madre. Successivamente i restanti frammenti ereditati dal padre biologico vengono confrontati con i frammenti di DNA del presunto padre.

Antropologia

Con l'aiuto della tipizzazione del DNA, gli scienziati stanno cercando di comporre interi documenti da migliaia di frammenti dei Rotoli del Mar Morto. Per fare ciò, utilizzando la tipizzazione del DNA, i frammenti scritti su pelle di pecora vengono separati da frammenti scritti su pelle di capra, il che facilita notevolmente la successiva ricostruzione di interi rotoli.

La tipizzazione del DNA permette di stabilire il grado di parentela tra ossa umane fossili rinvenute in diverse regioni geografiche e appartenenti a diverse ere geologiche. I risultati così ottenuti fanno luce sulla storia dell’evoluzione umana.

Utilizzando la tipizzazione del DNA, gli scienziati hanno identificato i resti dello zar Nicola Romanov II e della sua famiglia, che furono uccisi dai bolscevichi nel 1918. Per fare ciò, i campioni di DNA isolati dalle ossa trovate nel luogo di sepoltura sono stati confrontati con campioni di DNA di discendenti viventi di Nicola II, incluso il principe Filippo di Gran Bretagna. I risultati ottenuti allo stesso tempo confutarono l'affermazione di una donna impostora, che rivendicava il nome della granduchessa Anastasia Romanova, che presumibilmente sfuggì miracolosamente alla distruzione.

Risorse della fauna selvatica

Quanto più comprendiamo il sistema di organizzazione del materiale genetico nelle popolazioni naturali, tanto più alto diventa il livello dei progetti che realizziamo, mirati alla conservazione e alla regolazione della diversità naturale. La tipizzazione del DNA viene utilizzata dagli scienziati per determinare la quantità di differenze genetiche tra popolazioni della stessa specie, studiare la distribuzione geografica delle specie, conservare le specie in pericolo e in via di estinzione e determinare il grado di resilienza genetica delle popolazioni selvatiche di specie in via di estinzione. Ad esempio, ora sappiamo che i ghepardi sono sull’orlo dell’estinzione, in gran parte a causa del grave depauperamento della diversità genetica.

Recentemente, la tipizzazione del DNA ha aiutato gli scienziati a svelare il mistero della popolazione messicana di tartarughe marine del Pacifico. Le tartarughe marine del Pacifico si riproducono in Giappone e Australia, ma esemplari molto giovani non sono rari vicino alla costa messicana. I biologi non potevano presumere che le giovani tartarughe fossero in grado di nuotare per 10.000 miglia che separano il Giappone dal Messico e, inoltre, una distanza ancora maggiore dall'Australia, quindi l'origine delle tartarughe marine messicane è rimasta un mistero fino a poco tempo fa. Si è scoperto che le giovani tartarughe provenienti dal Giappone e dall'Australia vengono portate sulle coste del Messico dalle correnti oceaniche e, quando raggiungono la pubertà, intraprendono il viaggio di ritorno ai luoghi di riproduzione.

La tipizzazione del DNA viene utilizzata anche per individuare il commercio illegale di prodotti provenienti da animali di specie protette. Ad esempio, gli esperti giapponesi hanno accertato i fatti della vendita nel paese di carne di balena importata illegalmente e di alcuni frutti di mare proibiti. Studi simili su campioni di avorio hanno rivelato prove di bracconaggio in alcuni paesi in cui è vietata la caccia agli elefanti. Infine, negli Stati Uniti, la tipizzazione del DNA viene utilizzata per impedire l’ingresso nel paese di caviale di storione in via di estinzione.

Evgeniya Ryabtseva
Giornale Internet "Biotecnologia commerciale" http://www..org
Continua.

I risultati ottenuti nello studio della struttura e dell'organizzazione del DNA genomico di animali, piante e microrganismi hanno lasciato un'impronta profonda sulla metodologia della loro sistematizzazione. Il problema dell'assegnazione adeguata di un particolare organismo a un particolare gruppo non è puramente accademico. Basata su criteri precisi, la tassonomia degli organismi viventi, che determina la relazione evolutiva tra loro, oltre che puramente teorica, è di grande interesse pratico. In particolare, la conoscenza dell'origine dei vari ceppi di agenti patogeni che causano infezioni ospedaliere consentirebbe lo sviluppo di efficaci misure protettive contro la loro diffusione.

Recentemente sono stati scoperti marcatori genetici sotto forma di specifiche sequenze di DNA che consentono di identificare le relazioni tra individui della stessa specie attraverso studi intra e interpopolazioni. Tali studi sulle popolazioni umane sono particolarmente importanti da un punto di vista pratico. Attualmente, i metodi di genetica molecolare consentono di identificare una persona nella ricerca medica forense, nonché di risolvere il problema della determinazione della paternità in casi controversi.

Tipizzazione genetica o del DNA chiamato la determinazione delle caratteristiche del genotipo di un organismo analizzando il DNA del suo genoma. In altre parole, nel processo di tipizzazione del DNA, le caratteristiche della struttura primaria del DNA dell'organismo studiato sono determinate in specifici loci genetici. Non sembrano esistere loci genetici assolutamente conservati. I cambiamenti mutazionali nel genoma si accumulano continuamente durante lo sviluppo filogenetico (storico, evolutivo) della specie. Ma lo stesso tipo di cambiamenti si verifica costantemente nei genomi di individui appartenenti alla stessa popolazione o a popolazioni diverse. Naturalmente, il modo più semplice per trovarlo differenze interspecie nelle sequenze nucleotidiche delle regioni studiate del genoma, poiché queste differenze sono solitamente significative, e sono loro che determinano la distanza evolutiva tra le specie (la loro divergenza).

Pertanto, ogni specie di organismi presenta un gran numero di differenze intraspecifiche nella struttura primaria del DNA dei singoli loci genetici. I loci genetici che svolgono la stessa funzione (contenenti lo stesso gene o più geni), ma differiscono nella struttura primaria del DNA, sono chiamati polimorfico, e viene chiamato il fenomeno stesso dell'esistenza di loci polimorfici in una popolazione polimorfismo genetico.

Tipizzazione del DNA dei microrganismi

Riso. II.35. Schema di tipizzazione del DNA di microrganismi mediante PCR e primer di struttura arbitraria

Paragrafo listino prezzi	Studio	Prezzo	Termine prestazione (giorni)
	Identificazione, confronto di campioni (marcatori di autosomi, cromosoma Y, DNA mitocondriale)
20.3.2	Analisi comparativa di due campioni per i marcatori del cromosoma Y	12 600	14
20.5	Analisi comparativa di due campioni per marcatori autosomici. Pannello standard - 15 loci	12 600	14
29.6.1	Analisi comparativa di due campioni per marcatori autosomici. Pannello espanso - 25 loci	18 000	14
22.2	Analisi di un campione aggiuntivo per marcatori autosomici. Pannello standard - 15 loci	4 500	14
25.2	Analisi di un campione aggiuntivo per marcatori autosomici. Pannello espanso - 25 loci	6 400	14
22.3	Analisi aggiuntiva dei campioni per i marcatori del cromosoma Y	4 500	14
22.5	Analisi aggiuntiva del campione per marcatori del DNA mitocondriale	4 500	21
20.4.2	Analisi comparativa di due campioni per marcatori del DNA mitocondriale	12 600	21
	Tipizzazione (marcatori di autosomi, cromosomi X, cromosomi Y, DNA mitocondriale)
23.1	Tipizzazione di un campione per marcatori autosomici. Pannello standard - 15 loci	4 500	14
25.3	Tipizzazione di un campione per marcatori autosomici. Pannello espanso - 25 loci	6 400	14
23.2	Tipizzazione di un campione mediante marcatori del cromosoma X	4 500	14
23.3	Tipizzazione di un campione in base ai marcatori del cromosoma Y	4 500	14
23.4	Tipizzazione di un campione mediante marcatori del DNA mitocondriale	4 500	21
	Isolamento del DNA da materiale biologico (eccetto sangue ed epitelio buccale)
28.1	Isolamento del DNA da materiale biologico (eccetto sangue ed epitelio buccale) (1 campione.)	6 000	14

La sequenza nucleotidica del genoma completo di ogni persona è unica. Questa proprietà può essere utilizzata identificazione. Tuttavia, al momento, il sequenziamento dell’intero genoma è ancora troppo costoso e richiede molto tempo per essere utilizzato di routine identificazione della persona. Fortunatamente, non tutto è così male... Le caratteristiche individualizzanti sono possedute non solo dall'intera sequenza nucleotidica del genoma del DNA umano, ma anche dal suo genotipo secondo un certo numero piuttosto elevato di regioni altamente polimorfiche (loci) del genoma.

Attualmente per identificazione Negli esseri umani, i cosiddetti loci STR sono quasi universalmente utilizzati. L'abbreviazione STR deriva dalla frase inglese Short Tandem Repeat - letteralmente: una breve ripetizione in tandem. I loci di questo tipo sono catene costituite da piccole sequenze identiche (monomeri) lunghe 2-6 nucleotidi o "ripetizioni". Gli alleli di questi loci differiscono nel numero di queste ripetizioni. I loci STR presentano i seguenti vantaggi:

Un gran numero di alleli, che aiuta a ridurre la probabilità di coincidenze casuali di genotipi di persone diverse.
Un gran numero di loci STR conosciuti e la loro distribuzione relativamente uniforme su tutti i cromosomi umani.
La capacità di utilizzare metodi moderni per effettuare una tipizzazione rapida, accurata ed economica dei campioni secondo questi loci.

Lo standard internazionale de facto è diventato il sistema CODICE(COMbined DNA Index System), costituito da 13 loci STR autosomici (D3S1358, THO1, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, vWA, D8S1179, TPOX, FGA). I loci di questo sistema sono selezionati in modo tale che la frequenza di qualsiasi genotipo per essi sia così piccola che su tutta la Terra non possono esserci due persone con lo stesso genotipo secondo l'insieme di loci del sistema CODIS.

Nei laboratori moderni, la genotipizzazione viene eseguita automaticamente utilizzando sistemi hardware e software, che consentono di unificare la procedura di tipizzazione ed eliminare praticamente l'influenza del fattore umano.

Nella fig. 1 mostra un esempio della presentazione dei risultati della tipizzazione umana mediante l'analizzatore genetico 3130 (Applied Biosystems). La tipizzazione viene effettuata secondo il sistema dei loci AmpFlSTR Identifiler (Applied Biosystems), che contiene tutti i loci del sistema CODIS, ulteriori loci STR D2S1338 e D19S433 e il locus AMELOGENIN, che determina il sesso del campione.

Riso. 1. Presentazione dei risultati della tipizzazione umana mediante il complesso hardware-software 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems).

Il profilo genetico risultante è presentato sotto forma di tabella (Tabella 1):

Tabella 1. Un esempio di presentazione dei risultati della tipizzazione umana (il genotipo corrisponde a quello mostrato in Fig. 1).

Luogo	alleli		Luogo	alleli
D8S1179	10	14	D2S1338	23	23
D21S11	29	30	D5S818	12	13
D7S820	9	10	FGA	23	23
CSF1PO	10	11	D19S433	14	15.2
D3S1358	15	16	vWA	15	16
THO1	9	9.3	TPOX	8	8
D13S317	9	12	D18S51	14	17
D16S539	9	12	AMELOGENINA	X	Y

Perché una persona comune ne avrebbe bisogno analisi identificativa?

Possono sorgere situazioni in cui è necessario stabilire l'origine del materiale biologico da una determinata persona. Ciò può essere necessario, ad esempio, per escludere errori nella diagnosi di cancro. Molto spesso le persone a cui è stato diagnosticato un cancro si rivolgono al nostro Centro chiedendo di verificare se il loro materiale biologico è stato effettivamente utilizzato nell'esame istologico. Spesso i risultati dell'analisi di identificazione indicano che i campioni istologici presentati non appartengono alla persona che ha presentato la richiesta, ma a un'altra persona.

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