"Antibiotici e chemioterapia", 2003, 48(10): 32-39.

Articolo pubblicato con il gentile permesso di Olga Efremenkova
Vladimirovna, testa settore ricerca composti naturali
Istituto di ricerca per la scoperta di nuovi antibiotici. G.F. Gause RAMS

Segnali comunicativi dei batteri

V.D. georgiano

Istituto di ricerca per la scoperta di nuovi antibiotici. G. F. Gause RAMS, Mosca

V.D. Georgia. Segnali comunicativi dei batteri

G.F. Istituto Gause di Nuovi Antibiotici, Accademia Russa delle Scienze Mediche, Mosca

Attualmente si assiste al passaggio dall’idea tradizionale dei batteri come organismi strettamente unicellulari all’idea delle comunità microbiche come strutture integrali che regolano le loro risposte comportamentali in base ai cambiamenti delle condizioni ambientali.

Colonie di quasi tutti i tipi di batteri dimostrano la capacità di differenziazione cellulare e di organizzazione multicellulare. Questa capacità è più evidente quando i batteri crescono nei loro habitat naturali, dove formano varie strutture multicellulari: biofilm, tappeti batterici, corpi fruttiferi, ecc.

Il concetto di Quorum Sensing è stato introdotto nel 1994. Significa la percezione da parte delle cellule dei cambiamenti nell'ambiente che si verificano quando una coltura batterica raggiunge un certo numero di soglia e la reazione a questi cambiamenti.

I processi descritti che si verificano solo con una densità di popolazione sufficientemente elevata includono i seguenti fenomeni:

Bioluminescenza nei batteri marini Vibrio fisheri E V.harveyi;
aggregazione delle cellule dei mixobatteri e successiva formazione di corpi fruttiferi con spore;
sporulazione in bacilli e attinomiceti;
stimolazione della crescita degli streptococchi e di numerosi altri microrganismi;
coniugazione per trasferimento plasmidico Enterococcus faecalis e specie affini, nonché batteri del genere Agrobatterio;
sintesi di esoenzimi e altri fattori di virulenza nei patogeni vegetali ( Erwinia carotovora, E.hyacinthii ecc.) e animali ( Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus);
formazione di antibiotici nei membri del genere Streptomiceti e a E. carotovora;
formazione di biofilm nel R. aeruginosa e altri microrganismi.

Vengono divulgati i meccanismi di molti di questi processi, vengono determinati i fattori di comunicazione intercellulare responsabili dei processi che dipendono dalla densità di popolazione.

Un problema serio nella pratica clinica è la diffusa comparsa di forme resistenti di microrganismi, che riduce l'efficacia dell'uso di farmaci antibatterici. Di particolare difficoltà è l’aumento della resistenza ai farmaci dei batteri nei biofilm. I batteri spesso utilizzano reazioni di rilevamento del quorum per sintetizzare fattori di virulenza, antibiotici e formare biofilm. Pertanto, lo studio dei meccanismi di tali reazioni apre nuove opportunità per la prevenzione e il trattamento delle malattie causate da agenti microbici e consente anche di dare uno sguardo diverso al complesso complesso delle interazioni batteriche interspecifiche negli habitat naturali dei microrganismi.

I meccanismi delle reazioni di rilevamento del quorum differiscono nei batteri gram-positivi e gram-negativi, quindi è consigliabile considerarli separatamente.

Reazioni di rilevamento del quorum nei microrganismi Gram-positivi

I batteri Gram-positivi solitamente comunicano utilizzando molecole di segnalazione oligopeptidiche. La segnalazione nella maggior parte dei casi coinvolge un meccanismo di fosforilazione a due componenti. Di norma, lo stato di quorum viene raggiunto quando la popolazione di cellule batteriche entra nella fase stazionaria di crescita. È in questo momento che vengono rilevate le molecole segnale, con l'aiuto delle quali le cellule entrano in contatto tra loro. Lo schema generale di comunicazione dei batteri gram-positivi può essere rappresentato come segue: in primo luogo, nella cellula viene sintetizzato un precursore che, essendo modificato, si trasforma in un oligopeptide maturo. Quest'ultimo viene escreto all'esterno della cellula dall'esportatore. Le molecole di oligopeptidi si accumulano nello spazio intercellulare man mano che aumenta la densità delle cellule batteriche. Una chinasi sensoriale bicomponente che penetra nella membrana riconosce il segnale e lo trasmette nella cellula attraverso una cascata di fosforilazione. Nella cellula, la molecola oligopeptidica interagisce con il gene(i) bersaglio.

Il classico sistema quorum-dipendente del peptide può essere considerato il sistema responsabile del trasferimento coniugativo dei plasmidi in Enterococcus faecalis e specie batteriche affini. Questo sistema stimola la distribuzione nella popolazione microbica di tratti importanti per l'interazione tra il microrganismo e l'animale ospite, nonché per l'eliminazione della competizione. Il plasmide pPDl trasportato dal sistema quorum-dipendente del peptide è responsabile della sintesi delle emolisine, il plasmide pCDl è responsabile della formazione della batteriocina, il plasmide pCFlO è responsabile della resistenza E.faecalis alla tetraciclina. Ciascun esa- o octa-peptide induce l'adesione delle cellule batteriche e la loro coniugazione con il trasferimento dal donatore al ricevente di uno specifico plasmide. Ad esempio, l'ottapeptide cPDl stimola il trasferimento coniugativo del plasmide pPDl. Il plasmide codifica per un recettore situato sulla proteina repressore dell'operone corrispondente. L'interazione dell'oligopeptide con il recettore provoca la dissociazione del repressore dal DNA, innescando così la sintesi del prodotto corrispondente. Il plasmide pPDl comprende anche il gene traC, il cui prodotto è una proteina che facilita la penetrazione del peptide attraverso la parete cellulare. I segnali oligopeptidici vengono sintetizzati intensamente da cellule che non portano i corrispondenti plasmidi (riceventi), mentre la sintesi di tali segnali è soppressa nelle cellule donatrici; inoltre, il plasmide codifica per un peptide inibitorio.

Il prodotto del plasmide pPDl è il peptide iPDl, HHaKTHBHpyiounmcPDl.

Un altro processo dipendente dal quorum trovato in E.faecalis, è la produzione di due fattori di virulenza: gelatinasi (GelE) e serina proteasi (SprE).

Un esempio dell'uso di un segnale peptidico per le interazioni intercellulari è il sistema di rilevamento del quorum, che controlla la sintesi delle esotossine nella fase logaritmica tardiva della crescita in Staphylococcus aureus. In questo sistema, la proteina AgrD viene sintetizzata come un precursore costituito da 46 aminoacidi, che, durante l'esportazione da parte della proteina AgrB, viene convertito in un AIP maturo (peptide autoinducente) composto da 8 aminoacidi. L'AIP è riconosciuto dal sensore chinasi a due componenti AgrC, che trasmette un segnale nella cellula durante la fosforilazione del regolatore di risposta, AgrA. AgrA~P attiva la trascrizione dei geni bersaglio, stimola la trascrizione dell'operone agrB, D, C, A (circuito autoregolatorio positivo) e “proibisce” anche la trascrizione dei geni che codificano per altre esotossine. Basato sulle differenze nell'AIP e nel suo recettore, i ceppi S. aureus può essere assegnato a quattro o più gruppi. Gli oligopeptidi sintetizzati da uno dei gruppi inducono patogenicità in questo gruppo e sopprimono specificamente i sistemi di virulenza Agr in altri gruppi.

L’emergere della competenza nella fase logaritmica tardiva della crescita dipende dalla densità della popolazione. Streptococco pneumoniae. Il gene comC codifica per un precursore costituito da 41 residui aminoacidici. Quest'ultimo viene convertito in un peptide maturo costituito da 17 residui di aminoacidi nel processo di interazione con il sistema di esportazione del peptide (sistema ABC), formato dai prodotti dei geni comAB. Il peptide contatta il suo recettore sulla superficie cellulare, l'istidina chinasi, un prodotto del gene comD. L'istidina chinasi attivata fosforila il prodotto del gene comE. Man mano che le cellule si accumulano, il numero di segnali peptidici aumenta e raggiunge un livello critico nel mezzo. Di conseguenza aumenta anche la quantità di proteina comE fosforilata che, a partire da una certa concentrazione, si lega al promotore dell'operone comCDE, stimolandone il lavoro (circuito autoregolatorio positivo), attiva il promotore dell'operone comAB (il sistema di esportazione della proteina dalla cellula), attiva l'operone comX, che comprende l'intera catena dei geni di competenza tardiva; responsabile del legame e dell'assorbimento del DNA in trasformazione e di tutti gli altri stadi tardivi della trasformazione.

Oltre agli esempi sopra riportati di reazioni di rilevamento del quorum nei batteri gram-positivi, va notato che, oltre agli oligopeptidi, i batteri gram-positivi utilizzano anche sostanze di diversa natura chimica come molecole di segnalazione. Quindi, i rappresentanti dell'ordine Actinomiceti Insieme alle molecole segnale peptidiche, sono state trovate sostanze di natura a basso peso molecolare, la maggior parte delle quali contiene un gruppo lattone.

Negli streptomiceti, i sistemi di rilevamento del quorum coinvolgono i butirrolattoni e i loro corrispondenti recettori proteici, che insieme regolano lo sviluppo morfologico e la produzione di antibiotici nei loro produttori. Il regolatore degli actinomiceti più studiato è il fattore A, che è il 2-iso-capriloil-3-idrossimetil-y-butirrolattone.

L'influenza del fattore A sulla differenziazione morfologica e sulla formazione di antibiotici è soggetta allo schema generale di funzionamento dei regolatori degli streptomiceti contenenti un gruppo lattone. Nelle prime fasi della crescita, quando la concentrazione del fattore A è bassa, il recettore del fattore A (AgrA) si lega e reprime l'espressione dell'ipotetico attivatore comune della biosintesi e della sporulazione della streptomicina. Isolamento di AgrA dal lisato cellulare S. griseusÈ stato dimostrato che l'IFO 13350 è una proteina di 276 aminoacidi con un peso molecolare di 29,1 kDa.

All’aumentare della densità della coltura, la concentrazione del fattore A raggiunge un livello critico al quale si lega ad AgrA, provocando la dissociazione di quest’ultimo dal DNA e attivando così la trascrizione del gene chiave adpA che codifica per AdpA (una proteina di 405 aminoacidi contenente un legame sito nella regione centrale) con DNA, simili ai regolatori della trascrizione della famiglia delle proteine AraC/XylS). AdpA, a sua volta, è un regolatore positivo dell'attivatore citoplasmatico rilevato del cluster genetico della biosintesi della streptomicina e degli attivatori del processo di sporulazione. L'attivatore citoplasmatico, legandosi al DNA nella regione del promotore del gene per la regolazione specifica del cluster di biosintesi della streptomicina strR, induce la trascrizione di questo gene, il gene per la resistenza al proprio antibiotico - aphD, situato dopo di esso, l'adsA gene, che codifica per il fattore a extracitoplasmatico della RNA polimerasi, necessario per la formazione del micelio aereo, nonché per il gene sgmA che codifica per la proteina peptidasi, che, insieme ad altri enzimi idrolitici, è coinvolta nella degradazione del micelio substrato proteine come risultato della formazione del micelio aereo. Il prodotto regolatore del gene strR determina l'inizio della trascrizione dei geni della biosintesi strutturale come parte di un cluster di promotori StrR-dipendenti. L'inizio dell'espressione del promotore del gene strR sotto l'influenza di un attivatore citoplasmatico garantisce anche la produzione del prodotto del gene aphD, l'aminoglicoside fosfotransferasi, e quindi la creazione di un livello base di resistenza del ceppo al proprio antibiotico.

È stato dimostrato che in diverse specie di streptomiceti esiste omologia tra gli elementi strutturali dei regolatori. Sequenze nucleotidiche omologhe al gene agrA in S. griseus, si trovano anche in altri streptomiceti. Ad esempio, a S.coelicolor A3 (2), sono stati trovati due geni srA e srB, che codificano per le proteine simili ad AgrA CrA e CrB, che sono simili al 90,7% tra loro e al 35% ad AgrA.

Reazioni di rilevamento del quorum nei microrganismi Gram-negativi

In più di 450 specie di batteri gram-negativi sono stati trovati sistemi quorum-dipendenti, in cui vari lattoni acilhomoserina fungono da molecole di segnalazione. Lo schema generale di comunicazione nei batteri gram-negativi può essere rappresentato come segue: nel sistema di rilevamento del quorum dei batteri gram-negativi, le proteine della famiglia Luxl sono sintasi autoinduttrici e catalizzano la formazione di specifiche molecole autoinduttrici di acil omoserina lattone. Gli autoinduttori si diffondono liberamente attraverso la membrana e si accumulano all’aumentare della densità cellulare. Le proteine della famiglia LuxR si legano ai relativi autoinduttori quando viene raggiunta una concentrazione sufficientemente elevata di molecole di segnalazione. Il complesso LuxR, un autoinduttore, si lega al promotore dei geni bersaglio, iniziandone la trascrizione.

Batteri del genere Erwinia (E. carotovora, E. chrysanthemii) sono agenti patogeni delle piante. Abbattono le pareti cellulari delle piante con l'aiuto di pectinasi e cellulasi. La formazione di questi enzimi è un importante fattore di virulenza e dipende dalla densità della popolazione. A Erwinia il sistema genetico expI-expR funziona in modo simile al sistema luxI-luxR in V.fisheri. Le reazioni di quorum sensing coinvolgono anche il sistema regolatorio fornito dalla trascrizione dei geni rsmA-rsmB. Dalla densità di popolazione E. carotovora dipende anche dalla sintesi dell'antibiotico carbapenemico. La produzione di questo antibiotico è sotto il controllo del cluster di geni carA-carH e potrebbe essere necessaria per eliminare i microrganismi concorrenti nel locus dell'infezione della pianta.

Viene mostrato un altro esempio dell'uso dei lattoni omoserina come molecole di segnalazione Pseudomonas aeruginosa- un agente patogeno per gli animali. Patogenicità dentro R. aeruginosa a causa di un ampio arsenale di fattori di virulenza. Alcuni di essi sono associati alla cellula (pili, adesine, lipopolisaccaridi), altri vengono secreti (proteasi, ramnolipidi, esoenzima S, esotossina A, antibiotico piocianina, ecc.). La formazione di molti dei fattori di virulenza extracellulare è controllata da sistemi di interazione intercellulare. I componenti centrali di tali interazioni sono i sistemi di rilevamento del quorum las e rhl, che attivano l'espressione genica a seconda della densità cellulare del microrganismo. Ciascun sistema è rappresentato da due geni: uno codifica per un enzima che sintetizza uno specifico autoinduttore: l'omoserina lattone acilato (lasl/rhll); l'altro codifica per un attivatore di trascrizione al quale si lega il corrispondente autoinduttore (lasR/rhIR). L'autoinduttore dei sistemi las e rhi è l'N-(3-ossododecanoil)-L-omoserina lattone (3-oxo-C12-HSL), che viene esportato dalla cellula da un sistema speciale chiamato MexEF-OprN-pump e N- butirril-L-omoserina lattone (C4-HSL), rispettivamente.

Il sistema LAS controlla l'espressione dei geni che codificano per fattori di virulenza come l'elastasi A, B e la proteasi alcalina; sistema rhi - enzimi per la biosintesi dei ramnolipidi, piocianina. Recentemente è stata scoperta una terza molecola di segnalazione coinvolta nelle reazioni di rilevamento del quorum P.aeruginosa- 2-eptil-3-idrossi-4-chinolone (PQS). Questa molecola di segnalazione può controllare il livello di espressione di las B, che codifica per l'elastasi Las B, nonché il livello di espressione di rhil, che codifica per C4-HSL sintasi.

Batterio Agrobacterium tumefaciens provoca la formazione di galle della corona in molte specie vegetali. Le galle sono un analogo vegetale di un tumore maligno e si formano a seguito del trasferimento di frammenti di DNA oncogenico da un batterio nel nucleo di una cellula vegetale mediante plasmidi Ti. Alcuni dei geni del plasmide Ti determinano la sintesi delle opine da parte delle cellule vegetali, che fungono da substrato nutritivo per A.tumefaciens. Il sistema genetico traI-traR omologo luxI-luxR stimola la diffusione dei plasmidi Ti nella popolazione batterica. Il DNA plasmidico tende a diffondersi in tutta la popolazione batterica e, una volta creato un "quorum" sufficiente, induce le cellule portatrici di plasmide a coniugarsi con altre cellule batteriche. Allo stesso tempo, il trasferimento coniugativo dei plasmidi Ti dipende dalle opine. In particolare, la trascrizione di traR è stimolata dal fattore OccR attivato dall'octopina.

Rilevamento del quorum nelle formazioni multicellulari

La capacità dei batteri di formare biofilm è interessante in considerazione del fatto che i rappresentanti di agenti patogeni per l'uomo e gli animali mostrano resistenza all'azione delle sostanze antimicrobiche quando crescono nei biofilm. I biofilm sono comunità batteriche altamente ordinate che consentono ai batteri di vivere in uno stato attaccato. I biofilm possono essere composti da uno o più tipi di batteri. Sono permeati da una rete di canali d'acqua che assicurano la fornitura di nutrienti ai membri della comunità e rimuovono i prodotti metabolici. All'interno di un singolo biofilm si possono osservare diversi modelli di espressione genetica, suggerendo che i singoli membri della comunità hanno "responsabilità specifiche" che, se combinate con altre, migliorano la vitalità dell'intero consorzio.

I biofilm si formano nei polmoni da un agente patogeno P.aeruginosa. Lo spessore di un tale biofilm è di diverse centinaia di micrometri. Le microcolonie in un biofilm maturo si trovano nella matrice polisaccaridica extracellulare. All'interno del biofilm si trova eterogeneità: in esso c'è un gradiente di ossigeno - una diminuzione della concentrazione di ossigeno dalla periferia verso l'interno. Si prevede che gradienti simili siano riscontrabili per il pH e i nutrienti. Questi gradienti forniscono variabilità fisiologica tra le singole cellule del biofilm: ad esempio, le cellule crescono molto più lentamente in profondità che alla periferia. Il batterio in un biofilm così maturo è fenotipicamente resistente agli agenti battericidi. Pertanto, i biofilm causano vari tipi di infezioni batteriche croniche. Formazione di biofilm nel P.aeruginosaè sotto il controllo delle reazioni di rilevamento del quorum. Le mutazioni nel gene lasI compromettono la maturazione del biofilm, poiché la proteina LasI non sintetizza 3-oxo-C12-HSL e la formazione del microfilm non continua dopo la fase di microcolonia. Il ruolo di C4-HSL nei processi di formazione rimane sconosciuto. I biofilm formati dai mutanti della proteina LasI sono sensibili ai detergenti, mentre i biofilm normali sono resistenti. Ciò dà motivo di pensare che la terapia mirasse alla disregolazione del meccanismo di rilevamento del quorum P.aeruginosa, può portare all'arresto della formazione del biofilm, che aumenterà la sensibilità di questo batterio agli agenti antimicrobici.

Formazione di un biofilm in un batterio patogeno Burkholderia cepacia definito anche dal “senso del quorum”. Quando cresce nei biofilm, questo microrganismo è simile a P.aeruginosa mostra una significativa resistenza agli agenti antimicrobici.

Interazioni interspecifiche dei microrganismi

Le comunicazioni interspecifiche nei batteri possono servire a sincronizzare le funzioni specializzate delle specie in un gruppo. La diversità presente in ogni popolazione può migliorare la sopravvivenza dell’intera comunità. Inoltre, le interazioni produttive basate sul quorum sensing possono promuovere lo sviluppo di organizzazioni batteriche multispecie, come i biofilm, nonché la creazione di specifiche associazioni simbiotiche con ospiti eucariotici.

Le interazioni interspecifiche dei microrganismi sono state studiate in modo più approfondito utilizzando l'esempio della comunità microbica della cavità orale e della superficie dei denti umani. Sono state identificate circa 500 specie di batteri nei biofilm sulla superficie dei denti, che funzionano come una comunità coordinata con comunicazioni intra e interspecifiche. Gli streptococchi costituiscono dal 60 al 90% dei batteri che colonizzano la superficie dei denti durante le prime quattro ore dopo la pulizia dal dentista. Tra gli altri tipi di "primi colonizzatori" si trovano rappresentanti Actinomiceti, Capnocitofagi, Eikenella, Emofilo, Prevotella, Propionibatterio E Veillonella.

È probabile che le modalità di comunicazione tra cellule geneticamente identiche differiscano dai segnali nella comunicazione interspecie. Non ci sono prove della presenza di rappresentanti tipici della famiglia dei lattoni acilhomoserina tra le molecole di segnalazione dei batteri orali, che regolano l'espressione genica intraspecifica nei batteri Gram-negativi.

AI-2 è la principale molecola di segnalazione nelle comunicazioni interspecifiche. Ciò è confermato dalla scoperta del gene luxS che codifica l'enzima necessario per la sintesi della molecola AI-2 in diversi generi di batteri orali.

L'AI-2 è stato scoperto per la prima volta in un batterio luminoso marino Vibrio Harveyi, per la quale è una molecola segnale che regola il processo di bioluminescenza. Successivamente, la presenza di AI-2 è stata dimostrata in più di 30 specie di batteri, inclusi microrganismi gram-positivi e gram-negativi.

A volte può essere utile per un gruppo di batteri influenzare negativamente il ciclo di rilevamento del quorum di un gruppo di batteri concorrenti. La ricerca in questo settore rivela diversi esempi di strategie di rilevamento dell'antiquorum che utilizzano popolazioni batteriche coesistenti. COSÌ, Staphylococcus epidermidis utilizza il peptide per controllare il livello della sua virulenza agr, nonché per sopprimere la virulenza Staphylococcus aureus.

Sottoporre a tensione bacillo sp. 240B1 dimostra la capacità di inattivare enzimaticamente i lattoni acilhomoserina, le molecole di segnalazione dei batteri Gram-negativi. È stato dimostrato che in presenza dell'AIA, omoserina lattonasi, costituita da 250 aminoacidi, le molecole di omoserina lattoni prodotte dall'agente patogeno nelle piante vengono distrutte. Erwinia carotovora. Geni omologhi al gene aiiA sono stati trovati anche in 16 sottospecie Bacillus thuringiensis pertanto questi microrganismi sono in grado di degradare anche i lattoni dell'omoserina.

batterio del suolo Paradosso di Variovorax può utilizzare lattoni acilomoserina come unica fonte di carbonio e azoto. Questo fatto indica che nei loro habitat naturali V.paradosso possono crescere sui lattoni acilhomoserina, beneficiando dell’esacerbazione della concorrenza nell’ambiente. In questo caso, l'enzima che distrugge gli acil omoserina lattoni è diverso dall'AiiA-lattonesi: si tratta di un'amminoacilasi che scinde l'anello lattonico dal gruppo acilico.

Dato che i sistemi di rilevamento del quorum controllano la virulenza in molti agenti patogeni animali e vegetali, questi sistemi possono essere considerati potenziali bersagli per l’azione degli agenti antimicrobici. Innanzitutto, una strategia consiste nell'inibire la sintesi delle molecole precursori dell'acilhomoserina lattone o degli stessi lattoni acilhomoserina. In secondo luogo, i sistemi che controllano il rilascio e la diffusione degli acil-omoserina lattoni possono fungere da bersagli per i farmaci. In terzo luogo, gli antagonisti simili al lattone dell'acilomoserina possono competere con gli lattoni dell'acilomoserina per il legame con gli omologhi LuxR. In quarto luogo, è possibile utilizzare enzimi che scindono gli acil omoserina lattoni, nonché anticorpi contro queste molecole. E, infine, come è stato recentemente dimostrato, i geni aiiA che codificano per lattonasi che degradano i lattoni acilomoserina possono essere introdotti nel genoma della pianta, esprimendosi in cui potrebbero proteggere la pianta ospite dai microrganismi patogeni. Pertanto, le piante di tabacco transgeniche con un gene aiiA incluso hanno resistito con successo all'infezione E. carotovora.

Citochine batteriche

È stato scoperto che i microrganismi procarioti sintetizzano sostanze simili agli ormoni dei vertebrati (compresi gli steroidi e gli ormoni polipeptidici come l'insulina). Un numero crescente di prove evidenzia l’importanza delle interazioni cellula-cellula mediate chimicamente nelle colture batteriche per eventi quali sporulazione, coniugazione, virulenza e bioluminescenza. Pertanto, attualmente, molti studi nel campo della microbiologia sono dedicati alle interazioni tra microrganismi basate sull'uso di citochine batteriche.

È noto che i microrganismi sono in grado di adattarsi in modo flessibile alle mutevoli condizioni ambientali (in particolare alla mancanza di nutrienti). Allo stesso tempo, alcuni di loro hanno un'organizzazione specifica del metabolismo geneticamente fissata, che consente loro di esistere a concentrazioni molto basse di nutrienti (oligotrofi). Le cellule di un'altra categoria (copiotrofi), quando l'ambiente è esaurito, sono in grado di attivare programmi speciali per sperimentare condizioni avverse. Alcuni di essi formano strutture specializzate (spore e cisti) estremamente resistenti a vari stress, mentre i batteri non sporulanti sono in grado di sopravvivere a condizioni avverse, rimanendo cellule vegetative con attività metabolica ridotta, cioè. passando in uno stato speciale VBNC (vitale ma non coltivabile - vitale, ma non coltivato). Naturalmente, i batteri non coltivati rimangono fuori dall'ambito dei metodi di ricerca generalmente accettati (la semina su terreni solidi o liquidi non ne consente il rilevamento). Ad esempio, gli agenti causali di malattie pericolose come il colera e la campilobatteriosi tendono a formare forme incolte. L'esame microscopico di campioni isolati dall'ambiente (suolo, acque fluviali e marine, ecc.) ha rivelato molte cellule che, avendo attività metabolica, non possono formare una coltura completa (cioè incolte). Attualmente sono noti solo pochi esempi di trasformazione di tali batteri in normali cellule in coltura. Il concetto di crescita dei microrganismi citochina-dipendente ci consente di riconsiderare il problema della selezione dei terreni per il ripristino di forme non coltivabili.

Forme incolte di batteri patogeni si trovano non solo nell'ambiente, ma anche nei tessuti, negli organi dell'uomo e degli animali. Molto spesso sono molto diversi morfologicamente e biochimicamente. Ad esempio, l'agente eziologico della tubercolosi nei tessuti forma forme coccoidi atipiche. È possibile che tali cellule siano forme speciali sopravvissute in grado di attivarsi e riprodursi. L'esistenza di tali forme dormienti può spiegare le ricadute ricorrenti della malattia in pazienti apparentemente guariti. È stato dimostrato che le cellule Mycobacterium tuberculosis può trasformarsi in uno stato coccoide non replicante in condizioni microaerofile in vitro che spesso si verificano in vivo(ad esempio, nei granulomi). Sono state trovate anche forme coccoidi Campylobacter jejuni E Helicobacter pylori. Si presume che si formino nei tessuti in risposta agli effetti dei farmaci e, possibilmente, siano cellule quiescenti resistenti agli antibiotici. Tuttavia, i dati sulla coltivazione di tali forme sono molto contraddittori. È possibile che tali batteri possano essere attivati da alcuni specifici fattori di crescita, il cui ruolo è probabilmente svolto dalle citochine dell'ospite. Ad esempio, la crescita dei bacilli della tubercolosi all’interno dei monociti è stata significativamente stimolata dal fattore di crescita trasformante (TGF-1), mentre la crescita cellulare M.tubercolosi E M.avium all'interno dei macrofagi è stata significativamente accelerata in presenza del fattore di crescita epidermico. Ovviamente, i fattori citochinici dell'ospite possono svolgere un ruolo importante sia nell'attivazione di batteri dormienti che nella riproduzione di patogeni attivi. Una diminuzione del livello di insulina nel sangue dei pazienti con diabete mellito porta ad una significativa proliferazione delle cellule. Pseudomonas pseudomallei, che sono gli agenti causali della melioidosi, e la transferrina è di grande importanza per la crescita e la sopravvivenza delle cellule all'interno dei macrofagi del topo Francisella tularensis.

È possibile che anche specifiche citochine batteriche svolgano un ruolo significativo nella formazione di forme quiescenti e nel loro recupero in cellule attive in divisione. Quindi, tenendo conto dei problemi legati all'emergere della resistenza agli antibiotici, è difficile sopravvalutare l'importanza di trovare fattori di crescita autocrini necessari per la crescita di batteri patogeni e, quindi, di essere un bersaglio per l'azione di antibiotici fondamentalmente nuovi che sono non tossico per il paziente.

L'uso di citochine batteriche specifiche può anche migliorare significativamente la situazione con la coltivazione di batteri non coltivabili in terreni non del tutto adatti alla loro riproduzione. Ad esempio, i micrococchi che di solito non crescono su un mezzo succinato minimo iniziano a moltiplicarsi normalmente in presenza del fattore autocrino Rpf (fattore di promozione della rianimazione), mentre le cellule lavate Mycobacterium smegmatis, che crescono su terreno minimo solo aggiungendo Rpf estratto da Micrococco luteo, può essere considerato come un modello di una popolazione di batteri "affamati" nel suolo, che probabilmente richiede la presenza di una citochina specifica per iniziare la divisione. L'uso di citochine batteriche specifiche può anche migliorare significativamente la situazione con la coltivazione di batteri non coltivabili in terreni non del tutto adatti alla loro riproduzione. Geni simili al gene che codifica per la proteina Rpf M. luteus, sono ampiamente distribuiti tra i batteri Gram-positivi con un alto contenuto di G+C, che comprendono streptomiceti, corinebatteri e micobatteri. Questo fatto apre nuove possibilità per la prevenzione e il trattamento delle malattie causate da agenti microbici e ci consente anche di dare uno sguardo diverso al complesso complesso delle interazioni batteriche interspecifiche negli habitat naturali dei microrganismi.

Ultimo aggiornamento: 20/02/2004

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Capitolo 2 Rilevamento del quorum

2.1. Caratteristiche generali e meccanismo del quorum sensing

Il sistema di comunicazione intercellulare nei microrganismi è chiamato sistema rilevamento del quorum (QS). Oggi, il sistema QS è definito come un sistema di espressione genica coordinata in una popolazione, a seconda del suo indice di densità, utilizzando piccole molecole di segnalazione. Come notato sopra, questo meccanismo fu descritto per la prima volta nel 1970 da Nilson in un batterio marino Vibrio fisheri come sistema di regolazione della bioluminescenza. Inizialmente, si presumeva che questo meccanismo di regolazione fosse caratteristico solo di un piccolo numero di specie strettamente imparentate del genere Vibrione, tuttavia, ulteriori studi hanno dimostrato la diffusa prevalenza di questo meccanismo di regolazione nel mondo dei microrganismi. Si è scoperto che con l'aiuto del sistema QS i microrganismi sono in grado di regolare molti processi vitali, in particolare la patogenicità, il metabolismo secondario, la formazione di biofilm e molto altro. È stato dimostrato che il sistema QS si trova non solo nei batteri, ma anche in alcuni eucarioti inferiori, come i funghi simili a lieviti del genere Candida E Criptococco. Inoltre, si è scoperto che con l'aiuto di questo sistema i microrganismi sono in grado di interagire non solo con i propri simili, ma anche di effettuare comunicazioni interregionali, anche con gli eucarioti superiori.

In generale, il funzionamento del sistema QS si basa su una serie di principi chiave (Fig. 1):

L'uso di piccole molecole di segnalazione: nel sistema QS, la trasmissione del segnale da una cellula all'altra viene effettuata utilizzando molecole di segnalazione di varia natura chimica.
La presenza di recettori specifici - molecole di segnalazione non influenzano direttamente l'espressione dei geni bersaglio. L'attivazione dei geni bersaglio avviene solo dopo il legame delle molecole segnale ai recettori corrispondenti.
Influenza della densità di popolazione cellulare – il sistema QS viene avviato solo dopo aver raggiunto un certo valore di densità di popolazione cellulare, che è correlato alla concentrazione di molecole di segnalazione nell’ambiente.
Automantenimento del funzionamento: il controllo della sintesi di nuove molecole di segnalazione e recettori viene effettuato allo stesso modo dei geni bersaglio in assenza di attivazione dei sistemi di repressione.
La presenza di meccanismi di regolazione negativa selettiva - nelle cellule dei microrganismi sono presenti sia geni dipendenti che indipendenti di regolazione negativa QS, i cui prodotti sono in grado di disattivare selettivamente interi collegamenti del sistema QS o l'intero sistema nel suo insieme .

Riso. 1. Schema generale di funzionamento del sistema di rilevamento del quorum.

Questi principi sono comuni a quasi tutte le tipologie di sistemi QS, indipendentemente dalla loro specifica organizzazione strutturale. L'inizio del sistema QS coincide solitamente nel tempo con la fase iniziale di crescita esponenziale, caratterizzata da un rapido aumento della densità della popolazione cellulare. L'espressione dei geni bersaglio, al contrario, inizia solitamente con l'uscita della popolazione cellulare nella fase stazionaria, ed è solitamente complessa, cioè implica l'inizio della biosintesi di quasi tutti i prodotti regolati dal QS in un breve periodo di tempo. tempo. Pertanto, le prime fasi del sistema QS devono essere avviate. garantendo la biosintesi delle molecole di segnalazione e dei loro recettori, fino a un certo punto, che coincide con l'accumulo della massima concentrazione di molecole di segnalazione nello spazio intercellulare, al raggiungimento del quale il funzionamento del sistema QS entra in uno stato di autosostentamento.

I meccanismi alla base dell’attivazione precoce del sistema QS non sono stati ancora del tutto chiariti. Nonostante siano stati scoperti numerosi regolatori diversi, ai quali viene attribuito un certo ruolo nell’attivazione anticipata del sistema, molte domande rimangono irrisolte. Innanzitutto non è chiaro come sia regolato l’accumulo primario delle molecole di segnalazione e dei loro recettori. Esiste un'ipotesi che un certo numero di molecole di segnalazione e i loro recettori siano costantemente presenti nelle cellule e il loro accumulo primario avvenga secondo lo stesso meccanismo di autosostentamento, mentre parte del pool intracellulare di questi composti viene spesa per la sintesi della segnalazione molecole e recettori. Il resto viene escreto dalle cellule e, una volta raggiunta la concentrazione soglia, viene riassorbito e innesca l'espressione dei geni bersaglio. Tuttavia, in base alle caratteristiche di funzionamento di alcuni tipi di sistemi QS, ciò sembra improbabile. James P. Pearson, al contrario, ritiene che il lancio iniziale di QS avvenga con l'aiuto di regolatori di trascrizione non specifici come MvaT E Vfr(V irulenza F attori R regolatore) Pseudomonas aeruginosa, e il sistema entra in uno stato di autosostentamento molto più tardi.

2.2. Reazioni di rilevamento del quorum nei microrganismi Gram-positivi

Il prodotto del plasmide pPDl è il peptide iPDl, HHaKTHBHpyiounmcPDl.

Un altro processo dipendente dal quorum trovato in E.faecalis, è la produzione di due fattori di virulenza: gelatinasi (GelE) e serina proteasi (SprE).

Negli streptomiceti, i butirrolattoni e i loro corrispondenti recettori proteici sono coinvolti nei sistemi di rilevamento del quorum, che regolano congiuntamente lo sviluppo morfologico e la produzione di antibiotici nei loro produttori. Il regolatore degli actinomiceti più studiato è il fattore A, che è il 2-iso-capriloil-3-idrossimetil-y-butirrolattone.

La formazione, la crescita e la migrazione delle forme cellulari planctoniche per la colonizzazione nei biofilm sono regolate a livello di popolazione attraverso i meccanismi di comunicazione intercellulare. Il "quorum sensing" (QS) è un processo di coordinazione collettiva dell'espressione genica in una popolazione batterica che media il comportamento cellulare specifico. Il meccanismo di funzionamento del QS si basa su una complessa regolazione gerarchica dei loci bersaglio del genoma della cellula batterica. In questo caso, la regolazione viene effettuata a diversi livelli di influenza: trascrizionale, traduzionale, post-traduzionale.

Le cellule di una popolazione rispondono a uno specifico segnale cellulare con una risposta specifica. Ad oggi, è stato stabilito che le relazioni cellula-cellula influenzano la differenziazione cellulare intrapopolazione, l'espressione dei geni di virulenza, regolano i processi di crescita, la natura e la direzione della mobilità (tassi), nonché l'apoptosi batterica e la formazione di tossine.

Il lavoro di QS può essere paragonato alla regolazione ormonale dell'attività funzionale di vari organi e tessuti in un organismo multicellulare.

I microrganismi Gram-positivi e Gram-negativi utilizzano diversi sistemi di segnalazione e diversi trasmettitori di segnali chimici. I primi sintetizzano peptidi a 7-8 membri (Enterococcus spp.), ciclopeptidi (Staphylococcus spp.); secondo: una varietà di lattoni acil-omoserina (AHL).

Consideriamo il lavoro di QS sull'esempio di Pseudomonas aeruginosa. Questo microrganismo ha almeno tre sistemi regolatori. Il più studiato è il sistema LasI - LasR (AHL con una lunga catena acilica funge da segnale chimico); Sistema RhlI - RhlR (messaggero - AHL con una catena acilica corta, C4-HSL); e il sistema PQS dei chinoloni. L'interazione di questi tre sistemi permette di regolare l'espressione di circa il 6-10% del genoma. Nel sistema LasI - LasR, l'AHL sintasi, un prodotto del gene lasI, è responsabile della biosintesi delle molecole di segnalazione. La sua espressione è a livello basale, quindi l'accumulo di molecole segnale richiede molto tempo e l'effetto biologico inizia a manifestarsi solo nella fase stazionaria della crescita della popolazione. Nelle cellule, l'AHL interagisce con la proteina LasR (un prodotto del gene lasR, la cui espressione è anche a livello basale), formando un omodimero, un regolatore della trascrizione. Questo regolatore attiva molti geni coinvolti nella formazione della virulenza e nei processi di formazione del biofilm, attiva anche il regulon cromosomico las Box, che è responsabile dell'espressione di vari fattori di patogenicità (proteasi, elastasi, ecc.). Il complesso LasR + AHL attiva il secondo sistema di segnalazione. Ciò si verifica dopo l'interazione con il promotore del gene Rhl. L'espressione di RhlI provoca la formazione di una proteina per la sintesi di AHL con brevi residui acilici (C4-HSL). Il gene rhlR codifica per una proteina (RhlR) che interagisce con le molecole di segnalazione C4-HSL. Il risultante tandem proteico RhlR + C4-HSL regola la trascrizione dei geni che codificano per vari composti strutturali della matrice del biofilm (alginato, ramnolipide, ecc.), nonché lipasi e piocianina. Inoltre, questo regolatore trascrizionale attiva l'espressione di un altro regolatore - RpoS (fattore sigma della fase di crescita stazionaria di P. aeruginosa), che avvia la formazione di proteine dello stress nella cellula e partecipa a reazioni adattative. Tra gli isolati clinici di P.aeruginosa, è stato riscontrato che oltre al funzionamento dei sistemi di segnalazione AHL, entra in parallelo il sistema dei chinoloni (gene locus - pqsABCDE), i messaggeri sono idrossialchilchinoloni e idrossieptilchinoloni. Questo sistema funziona allo stesso modo dei meccanismi regolatori sopra descritti e media un aumento dell'espressione dei fattori di virulenza, in particolare la sintesi di elastasi e lectine. L'interazione dei tre sistemi di segnalazione colpisce un gran numero di geni, in relazione ai quali esiste una regolazione globale della trascrizione, che porta ad una labilità molto flessibile dei processi fisiologici della cellula, ed è una conseguenza dell'enorme potenziale adattativo di batteri nella popolazione.

I sistemi di segnalazione funzionano secondo il principio dell'autoinduzione, le molecole di segnalazione sintetizzate agiscono sulla propria cellula e, man mano che si accumulano nell'ambiente extracellulare, vengono attivati promotori sempre più dipendenti, i reguloni del genoma cellulare. Il QS basato su AHL è stato trovato in molti batteri Gram-negativi: Acinetobacter, Aeromonas, Brucella, Burkholderia, Erwinia, Enterobacter, Chromobacterium, Hafnia, Serratia, Vibrio, Yersinia, ecc. Strutture della molecola di segnalazione stessa.

Ma tra gli isolati clinici di batteri gram-negativi si osserva spesso anche la comunicazione incrociata, che garantisce l'interazione di popolazioni di diverse specie nel focus infettivo. Cross-QS può sia attivare che inibire i geni bersaglio dipendenti nelle associazioni batteriche. Ad esempio, P. aeruginosa, Serratia liquefaciens, Aeromonas hydrophila sintetizzano un tipo di molecole di segnalazione. Il QS di C.violaceum e A.idrophila è inibito dalle molecole AHL con lunghi residui acilici, che sono sintetizzati da vari microrganismi gram-negativi. Pseudomonas aeruginosa forma molecole di segnalazione con residui acilici lunghi e corti e non sono inibite a vicenda, tuttavia, i messaggeri di E. coli della stessa struttura molecolare con residui acilici lunghi sono in grado di inibire il sistema di segnalazione rhl di P. aeruginosa. Nei biofilm misti di P.aeruginosa e Burkholderia cepacia, Burkholderia risponde ai segnali di Pseudomonas aeruginosa (che a sua volta è insensibile ai segnali di B.cepacia), pertanto la popolazione di P.aeruginosa regola molti processi fisiologici del suo associato. Esistono prove che alcuni ceppi di P. aeruginosa isolati da pazienti con iscidosi non sono in grado di sintetizzare autonomamente gli autoinduttori del sistema di segnalazione rhl, con conseguente diminuzione della virulenza e formazione incompleta di biofilm negli esperimenti in vitro. Tuttavia, in vivo, questi stessi ceppi di Pseudomonas aeruginosa formano biofilm completi. Si è scoperto che la microflora isolata dal muco degli stessi pazienti sintetizza autoinduttori rhl, regolando così la virulenza e la formazione di biofilm di P.aeruginosa e avviando il processo infettivo. Le stesse molecole AHL influenzano diversamente altri gruppi di batteri; Le molecole di segnalazione dei procarioti possono anche influenzare il comportamento delle cellule fungine, vegetali e persino animali. Pertanto, P.aeruginosa AHL sopprime il processo di filamentazione della Candida albicans.

Negli esseri umani, le molecole AHL inibiscono la proliferazione dei leucociti e la formazione del fattore di necrosi tumorale b. Ad alte concentrazioni, l'AHL avvia l'apoptosi di vari tipi di cellule immunocompetenti. In generale, gli autoinduttori batterici hanno un effetto immunosoppressivo. È a causa delle reazioni QS che si instaurano relazioni “sociali” all'interno della popolazione, si forma una “rete di comunicazione chimica” di un biofilm, che può coprire una comunità multi-acqua.

Non meno interessante è il lavoro dei sistemi di segnalazione tra i microrganismi gram-positivi. Ad esempio, Enterococcus spp. QS regola il trasferimento dei plasmidi (dalle cellule del donatore alle cellule riceventi) attraverso il meccanismo della coniugazione. La cellula ricevente sintetizza un segnale peptidico specifico (feromone batterico “sessuale”), che si accumula nel mezzo e si lega specificamente ai recettori delle cellule donatrici che trasportano un plasmide che corrisponde a questo feromone. Il sistema di regolamentazione lanciato in questo caso garantisce l'espressione di fattori che mediano l'interazione cellulare e il trasferimento del plasmide (componenti di coniugazione). Come notato sopra, un feromone specifico corrisponde a un determinato plasmide. A causa di un meccanismo di interazione così rigido, viene effettuata la selezione batterica delle cellule all'interno del biofilm. Attraverso tale comunicazione, vengono traslocati plasmidi che trasportano geni per la resistenza agli antibiotici, geni per l'emolisina e batteriocine. Tipicamente, i peptidi segnale biologicamente attivi sono codificati nel cromosoma e le proteine recettrici che forniscono affinità per i feromoni sono codificate nei plasmidi stessi. Dopo la traslocazione del plasmide nella cellula ricevente, inizia la sintesi degli inibitori dei feromoni, ogni tipo di feromone ha il proprio inibitore. Questa funzione consente di disattivare il segnale per un plasmide esistente e migliorare l'accumulo di molecole di feromoni per un altro tipo di plasmide. cellula di microrganismi del biofilm

A causa del funzionamento di un tale sistema nella popolazione del biofilm, si verifica costantemente una selezione positiva di ceppi con proprietà benefiche e una selezione negativa - l'eliminazione di ceppi con fenotipi "non necessari". Nelle lesioni infettive, tali meccanismi di comunicazione per il trasferimento di elementi genetici mobili consentono di distribuire con la massima velocità i geni di resistenza agli antibiotici, virulenza e capacità fisiologiche aggiuntive.

Di grande interesse è il QS, che è coinvolto nella regolazione dell'espressione dei fattori di virulenza negli stafilococchi. La base genetica di questo sistema è agrBCD, il locus cromosomico. Come trasmettitori di segnali agiscono i ciclopeptidi: autoinduttori (AIP, peptide autoinducente), che sono classificati per struttura ed effetto biologico in gruppi e sottogruppi, ad esempio i sottogruppi 1 e 4 in S. aureus aumentano l'espressione dei fattori di virulenza. Queste molecole sono estremamente specifiche, la sostituzione anche di un solo amminoacido nella struttura del composto porta alla perdita della funzione biologica. Come negli esempi del sistema segnale-inibitore negli enterococchi, il sistema stafilococcico risponde solo a un tipo di autoinduttori, non appena la cellula ha ricevuto un segnale specifico, i geni inibitori vengono attivati e la cellula non è più in grado di percepire altri segnali . Questo meccanismo prevede una rigida selezione della popolazione. Le molecole segnale sintetizzate interagiscono con il sistema di membrana dell'istidina chinasi (agrC), che attiva il regolatore della trascrizione (agrA) attraverso una cascata di reazioni. Questa proteina regola bifunzionalmente i due promotori P2 e P3. Di conseguenza, le trascrizioni di questi geni dipendenti sono RNA II e RNA III, il primo contiene i principali geni agr, quindi si manifesta la risposta autoinduttiva del sistema. A sua volta, l'RNA III provvede alla regolazione della sintesi dei fattori di virulenza (DNasi, fibrinolisina, enterotossina, b-, c-, d-tossine, ecc.). Una caratteristica interessante in questa fase della regolazione è che la trascrizione dell'RNA III da 500 bp non contiene informazioni codificate, ad eccezione di un frame di lettura aperto per la d-tossina. La stragrande maggioranza della molecola di trascrizione stessa agisce come un inibitore ribosomiale. L'RNA III blocca il processo di traduzione del fattore di repressione della virulenza Rot (repressore delle tossine), che regola la sintesi delle tossine stafilococciche, con conseguente formazione incontrollata di esotossine. Pertanto, il sistema agr fornisce la regolazione della popolazione dell'espressione dei fattori di virulenza stafilococcica. Utilizzando varie varianti di studi PCR, si è scoperto che l'espressione dell'agr-locus nelle cellule è osservata in molte lesioni da stafilococco: infezioni cutanee, endocardite, artrite, sepsi. La popolazione del biofilm accumula molecole di segnalazione sintetizzate dalla stragrande maggioranza delle cellule, che costituiscono il "nucleo, quorum" metabolico e genetico della popolazione, determinano il comportamento metabolico e i cambiamenti fenotipici per tutte le cellule. Ciò è dovuto all'accumulo di segnali attraverso la proprietà di autoinduzione, e all'inibizione di altri segnali sintetizzati da una minoranza, o in generale da altri ceppi nel biofilm, grazie ad un parallelo meccanismo di inibizione. 1.5 Significato clinico dei biofilm.

Il concetto di biofilm, confermato utilizzando le moderne tecniche di imaging, ha cambiato il modo in cui guardiamo alle malattie infettive. Tutti i nuovi dati indicano che le infezioni croniche sono fondamentalmente diverse da quelle acute nella formazione di biofilm e che i fagociti del macroorganismo non sono in grado di assorbire i biofilm, a differenza delle singole cellule batteriche.

L’esistenza di biofilm nelle infezioni croniche richiede approcci completamente nuovi alla loro diagnosi e trattamento. Inoltre, i metodi batteriologici tradizionali non rilevano la maggior parte dei batteri coinvolti nel processo infettivo. Gli ultimi metodi molecolari, genomici, trascrizionali e proteomici hanno permesso di determinare che solo circa l'1% delle cellule di microbiocenosi patogene vengono determinate isolando una coltura pura. Di conseguenza, il trattamento prende di mira solo 1-2 specie batteriche tra i numerosi ceppi presenti nel biofilm (compresi possibilmente i funghi).

Ad oggi, il ruolo dei biofilm microbici nella comparsa e nello sviluppo di malattie comuni come le infezioni associate al cateterismo vascolare causate da Staphylococcus aureus e altri microrganismi Gram-positivi è stato dimostrato in modo affidabile; infezioni delle valvole cardiache e delle protesi articolari causate da stafilococchi; parodontite causata da un numero di microrganismi orali; infezioni delle vie urinarie determinate da E. coli e altri agenti patogeni; infezioni dell'orecchio medio - causano, ad esempio, Haemophilus influenzae, fibrosi cistica causata da P. aeruginosa, ecc.

Tutte queste malattie sono difficili da trattare, hanno un alto tasso di recidiva e alcune di esse possono essere fatali. I meccanismi attraverso i quali i microrganismi che formano biofilm causano processi patologici nel macroorganismo sono tutt’altro che chiari.

Oltre ai tessuti ospiti, i biofilm microbici colonizzano diversi dispositivi medici non biologici introdotti nel corpo umano (cateteri, pacemaker, valvole cardiache, dispositivi ortopedici). Studi su dispositivi medici impiantati mediante microscopia elettronica hanno dimostrato la presenza di biofilm batterici.

L’aumento della resistenza agli antibiotici e lo sviluppo di biofilm batterici rappresentano le principali sfide nel trattamento delle infezioni del tratto urinario.

È stato stabilito che le proprietà delle cellule e della matrice extracellulare sono alla base dell'aumento della resistenza. La matrice del biofilm può o meno legarsi e/o inattivare gli antibiotici. La resistenza dovuta alle proprietà delle cellule del biofilm si spiega con una diminuzione della loro superficie libera dovuta ai contatti tra loro e alla formazione di batteri speciali, chiamati persistenti.

Le persistenti sono cellule altruistiche che si formano nella fase stazionaria della crescita, sono metabolicamente inattive e garantiscono la sopravvivenza della popolazione materna in presenza di fattori letali per tutte le cellule. Nei biofilm, questa sottopopolazione rappresenta l'1-5% della massa cellulare totale. La formazione di tali cellule dipende dal grado di crescita della popolazione; nella fase logaritmica la coltura non forma o forma una percentuale molto piccola di persistenti, il loro numero aumenta verso la fase stazionaria. La formazione di una sottopopolazione dipende inversamente dal livello di attività metabolica di tutte le cellule del biofilm, nonché dall'azione di fattori sfavorevoli esogeni. Il fenotipo persistente è caratterizzato da una biologia interessante; rallentano tutti i processi fisiologici e diventano tolleranti all'azione di vari fattori, compresi gli effetti dei farmaci antimicrobici.

La proprietà della tolleranza agli antibiotici differisce dai meccanismi di resistenza. L'azione di tutti i meccanismi di resistenza batterica, in sostanza, può essere ridotta a un fenomeno: questa è la prevenzione dell'interazione di un antibiotico con il suo bersaglio (a causa di cambiamenti nei bersagli stessi o attraverso la sintesi di enzimi che neutralizzano gli antibiotici ). La tolleranza è mediata dalla capacità di una cellula microbica di sopravvivere in presenza di un antibiotico rallentando il metabolismo e “spegnendo” i principali processi biologici della cellula.

I principali meccanismi di aumento della resistenza batterica agli antibiotici nei biofilm sono:

1. limitare la penetrazione degli antibiotici attraverso i biofilm;

2. la restrizione alimentare e il microambiente alterato nel biofilm portano ad una diminuzione del tasso di divisione batterica, per cui ci sono meno bersagli per l'azione degli antibiotici;

3. reazioni adattative;

4. variabilità genetica nei batteri che persistono in un biofilm.

Sulla base dei dati accumulati, ne consegue che gli antibiotici sono divisi in due tipi in base all'azione sui batteri nei biofilm. Il primo comprende gli antibiotici che penetrano nei biofilm e inibiscono o uccidono i microrganismi che li formano. Il secondo tipo sono gli antibiotici, che praticamente non penetrano nei biofilm, ma ne impediscono efficacemente l'insediamento a causa della migrazione dei batteri. Pertanto, alcuni antibiotici non penetrano nei biofilm e non distruggono le comunità esistenti, ma impediscono solo il loro aumento in numero e distribuzione nel corpo umano. A questo proposito, negli ultimi anni sono iniziati gli studi sulla capacità degli antibiotici di penetrare nei biofilm di vari microbi.

È stato riscontrato che l'ampicillina penetra scarsamente nei biofilm di Klebsiella pneumoniae e che l'ampicillina, il co-trimaxosolo e la vancomicina penetrano scarsamente nelle comunità di Enterococcus faecalis. L'amoxicillina ampiamente utilizzata penetra male nei biofilm di numerosi microbi.

I fluorochinoloni sono tra gli antibiotici che penetrano bene nei lipidi cellulari. Questo gruppo di farmaci antimicrobici è in grado di agire sui principali agenti patogeni delle malattie urologiche, in concentrazione sufficiente penetra nel fuoco dell'infezione. L'esperienza esistente con l'uso degli antibiotici indica che il processo infettivo, soprattutto le sue manifestazioni cliniche, possono essere affrontati con l'aiuto di antibiotici, sia penetranti che non penetranti nei biofilm. Tuttavia, c'è una differenza tra loro ed è piuttosto significativa. È stato dimostrato che le differenze tra gli antibiotici che penetrano e quelli che non penetrano nei biofilm possono manifestarsi nei risultati a lungo termine del trattamento. L'uso di antibiotici che non penetrano bene nel biofilm porta molto rapidamente alla formazione e selezione di ceppi resistenti. Inoltre, le ricadute si verificano più spesso e si formano focolai di processi cronici.

L'effetto terapeutico sui biofilm può essere mirato ai meccanismi di adesione iniziale dei batteri alla superficie, bloccando la sintesi o la distruzione della matrice polimerica, interrompendo lo scambio di informazioni intercellulari e può anche essere combinato con gli stessi agenti battericidi. Tale trattamento, che influenza la struttura o la funzione dei biofilm, potrebbe essere più efficace della terapia antibiotica standard.

Comunicazione chimica nei batteri (regolamento sul quorum sensing)

I.A. Khmel, IMG RAS

Negli ultimi anni, l’attenzione di numerosi ricercatori che lavorano con i microrganismi in vari campi della biologia e della medicina è stata attirata da un fenomeno chiamato Quorum Sensing (QS). Il Quorum Sensing (QS) è un tipo speciale di regolazione dell'espressione genica batterica che dipende dalla densità della loro popolazione. I sistemi QS includono molecole di segnalazione a basso peso molecolare chiamate autoinduttori, che si diffondono facilmente attraverso la parete cellulare, e proteine regolatrici a cui si legano gli autoinduttori (AI). Quando la popolazione batterica aumenta e raggiunge un livello critico, l'IA si accumula fino alla soglia richiesta e interagisce con le proteine regolatrici appropriate, il che porta ad una forte attivazione (induzione) dell'espressione di alcuni geni nei batteri. Con l'aiuto dell'intelligenza artificiale, viene effettuata la comunicazione dei batteri: trasferimento intercellulare di informazioni tra individui di batteri appartenenti alla stessa specie, genere e persino famiglia diversa; pertanto le molecole segnalatrici sono considerate "parole" in questo peculiare "linguaggio" dei batteri. Attraverso la regolazione del QS, i batteri acquisiscono la capacità di controllare in modo coordinato l’espressione genica in tutta la comunità. In questo comportamento dei batteri si manifestano caratteristiche di somiglianza con gli organismi multicellulari; i batteri approfittano del comportamento "sociale" che non era loro disponibile come cellule individuali. Il trasferimento di informazioni da cellula a cellula utilizzando sistemi QS, che porta all'induzione di set di geni specializzati, promuove il rapido adattamento delle popolazioni batteriche alle mutevoli condizioni ambientali e la loro sopravvivenza in condizioni naturali.

La regolazione QS è stata scoperta e descritta per la prima volta all'inizio degli anni '70 in un batterio marino luminoso Vibrione fischeri. In questo batterio è codificata la capacità di bioluminescenza dovuta alla sintesi della luciferasi lux operone ( luxCDABE) e la bioluminescenza si verifica solo con un'elevata densità di popolazione batterica (fino a 10¹¹ cellule/ml). V. fischeri vive in simbiosi con alcuni animali marini, in un organo luminoso specializzato dell'animale. In questa associazione simbiotica, l'animale ospite fornisce al batterio un ricco mezzo nutritivo e il batterio ospite fornisce luce. Ogni organismo eucariotico utilizza la luce per i propri scopi specifici. Ad esempio, una lumaca Eurimna scolope illuminandoti con V. fischeri, non proietta ombre alla luce della luna e delle stelle, il che la aiuta a fuggire dai nemici. Pescare Monocentrico japonicus usa la luce per attirare un partner [su 3].

Per molto tempo si è creduto che la regolamentazione QS fosse un caso molto raro, tuttavia negli ultimi anni è diventato chiaro che questo tipo di regolamentazione è diffusa nei batteri di vari gruppi tassonomici. Ad oggi, la regolazione del QS è stata riscontrata in più di 50 specie batteriche. Un'ampia varietà di composti viene utilizzata dai batteri come autoinduttori dei sistemi QS; il numero di IA recentemente scoperte è in aumento. Allo stesso tempo, un tipo di batteri può utilizzare e riconoscere più di un tipo di molecole di segnalazione.

È stato ora dimostrato che i sistemi regolatori di tipo QS svolgono un ruolo chiave in un gran numero di processi cellulari batterici. Sono coinvolti nell'interazione di molti batteri con organismi superiori, animali e piante, nella regolazione della virulenza batterica, nella formazione di biofilm, nella regolazione dell'espressione genica associata alla sintesi di vari esoenzimi, tossine, antibiotici e altri metaboliti secondari, la coniugazione, ecc. e l'analisi proteomica hanno mostrato che i sistemi QS funzionano come fattori regolatori globali. Lo studio dei sistemi regolatori del QS, il loro ruolo nel metabolismo e nell'interazione dei batteri definisce un approccio completamente nuovo allo studio del comportamento dei batteri in condizioni naturali; questi studi possono essere di grande importanza pratica.

Il ruolo dei sistemi QS è particolarmente importante nella regolazione dei processi di interazione tra i batteri patogeni e l'organismo ospite eucariotico. Il processo infettivo avviene quando vengono raggiunte popolazioni sufficientemente numerose di batteri patogeni; allo stesso tempo, un aumento della concentrazione di molecole di segnalazione nel mezzo porta ad una sintesi sincrona di fattori di virulenza che contribuiscono alla distruzione dei tessuti corporei. Tale strategia contribuisce al successo del superamento della risposta immunitaria dell'organismo ospite da parte dei batteri.

La capacità dei batteri di formare biofilm è un fattore essenziale della loro patogenicità. I biofilm sono strutture fisiche con caratteristiche uniche formate da comunità microbiche legate alla superficie. La formazione di biofilm è una delle principali strategie che aumentano la sopravvivenza dei batteri nell’ambiente, compreso l’organismo ospite. La capacità dei batteri di esistere come parte dei biofilm crea grandi difficoltà per la pratica medica, poiché aumenta significativamente la resistenza dei batteri all'azione dei farmaci antibatterici, nonché agli effetti dei disinfettanti, fattori ambientali avversi, come bassi o alti Livelli di pH, elevata forza osmotica, ecc. e l'azione della difesa immunitaria dell'organismo ospite. La formazione di biofilm batterici su apparecchiature impiantabili (ad es. cateteri, valvole cardiache artificiali, lenti, ecc.) è la causa di una serie di gravi malattie croniche estremamente difficili da trattare. È stato dimostrato che la regolazione QS svolge un ruolo fondamentale nella formazione del biofilm.

Il fatto che il QS possa essere un fattore importante nella regolazione della virulenza batterica ha portato a una nuova linea di ricerca relativa all’uso del regolamento QS come potenziale bersaglio per combattere le malattie infettive. Si ipotizza che la soppressione dei sistemi QS possa fornire nuovi trattamenti, con conseguente conversione effettiva di batteri patogeni in batteri non patogeni senza l’uso di antibiotici e altri farmaci comunemente usati. Questo approccio è attualmente considerato una nuova promettente strategia per la terapia antimicrobica. Un gran numero di laboratori ricercano e studiano sostanze che sopprimono il QS. Di seguito considereremo i sistemi QS conosciuti nei batteri e le prospettive per la creazione di farmaci di nuova generazione volti direttamente a sopprimere la patogenicità dei batteri.

Quorumrilevamento sistemi nei batteri loromeccanismi molecolari

le loro azioni

QSsistemi di batteri gram-negativiLuxI- LuxRtipo.

Nei batteri Gram-negativi, i sistemi QS che funzionano con la partecipazione di autoinduttori di N-acil-omoserina lattoni (AHL o AI-1) sono quelli meglio studiati. Gli AHL includono un anello lattone omoserina e gruppi acilici pendenti. Sono stati descritti più di 40 AHL, che differiscono per la lunghezza delle catene aciliche nella molecola. La specificità dell'azione dell'AHL è determinata dal numero di gruppi acilici (da C4 a C16) e dalla presenza di alcuni gruppi aggiuntivi. Gli AHL contenenti corte catene aciliche si diffondono liberamente attraverso le membrane cellulari; Gli AHL con lunghe catene aciliche richiedono un trasporto attivo per uscire dalle cellule. Gli AHL interagiscono con proteine regolatrici omologhe alla proteina LuxR Vibrione fischeri, che costituiscono la famiglia delle proteine LuxR-simili. Le molecole di queste proteine contengono due domini che determinano il legame delle proteine all'AHL e al DNA. L'attaccamento di AHL modifica la configurazione della proteina simile a LuxR in modo che possa legarsi al DNA e funzionare come attivatore della trascrizione.

Nella biosintesi dell'AHL in diversi batteri studiati a questo proposito, sono coinvolti la S-adenosil metionina (SAM) (formazione di un anello lattone omoserina) e la proteina ACP, trasportatrice di gruppi acilici.

I sistemi QS, funzionanti con la partecipazione di AHL, si trovano in un gran numero di batteri gram-negativi, compresi i generi Agrobatterio, Aeromonas, Burkholderia, Cromobatterio, Citrobacter, Enterobatteri, Erwinia, afnia, pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Rodobatteri, Rizobio, Serratia, Vibrione, Yersinia ecc. Tra questi ci sono batteri patogeni e fitopatogeni.

La regolamentazione QS è stata studiata nei minimi dettagli. lux operone Vibrione fischeri. Coinvolge due principali componenti regolatori: 1) proteina LuxI (sintasi

autoinduttore) è responsabile della produzione di N-(3-ossoesanoil)- omoserina lattone (3OC12-HSL); 2) La proteina LuxR lega l'autoinduttore e quindi il complesso LuxR-3OC12-HSL, legandosi al promotore lux operone, ne attiva la trascrizione, che porta alla sintesi della luciferasi e all'emissione di luce. Quando la cultura Vibrione fischeri cresce, 3OC12-HSL si accumula fino a un livello soglia sufficiente per attivare LuxR, legandolo alla regione del promotore lux operone e l'induzione di questo operone. Perché il gene sintasi dell'autoinduttore LuxI fa parte di questo operone, la quantità di AI in queste condizioni aumenta notevolmente, il che porta a un'ulteriore induzione lux sintesi dell'operone e della luciferasi.

Tra i batteri patogeni, i sistemi QS sono i meglio studiati. Pseudomonas aeruginosa. Nelle gabbie Pseudomonas aeruginosa, patogeno umano opportunista che causa gravi infezioni del tratto respiratorio, un gran numero di geni, compresi i geni responsabili della sintesi dei fattori di virulenza, vengono attivati da due sistemi QS di tipo LuxI-LuxR: LasI-LasR e RhlI-RhlR. La proteina LasI è responsabile della produzione dell'autoinduttore N-3 (ossododecanoil) omoserina lattone (3OC12-HSL), la proteina RhlI è una sintasi dell'N-butanoil-omoserina lattone (C4-HSL), partecipa alla regolazione della formazione del biofilm. Il sistema LasI-LasR regola la sintesi dei fattori di virulenza secreti responsabili della distruzione dei tessuti dell'ospite all'inizio di un processo infettivo: l'elastasi, codificato dal gene lasB, una proteasi codificata lasA, un'esotossina codificata toxA, fosfatasi alcalina codificata dal gene aprA. Il sistema LasR-LasI QS attiva anche l'espressione genica del secondo sistema QS P. aeruginosa, RhlI-RhlR, portando alla sua induzione. Il complesso proteico RhlR con il corrispondente autoinduttore C4-HSL induce l'espressione di due geni regolati dal sistema QS del primo tipo, lasB E aprA, E. molti altri geni importanti per la virulenza dei batteri e la loro sopravvivenza in condizioni naturali. È stato dimostrato che l'espressione di più di 600 geni P. aeruginosa controllato da QS.

È stato dimostrato che 3OC12-HSL può avere un effetto diretto sull'organismo: le molecole 3OC12-HSL interagiscono con componenti del sistema immunitario, come le interleuchine, modulando la risposta immunitaria dell'organismo alle infezioni P. aeruginosa; inibire la proliferazione dei linfociti, la differenziazione delle cellule T, la produzione di citochine, ridurre la produzione di fattori di necrosi tumorale; le iniezioni di questo composto hanno indotto un processo infiammatorio nei topi.

A P. aeruginosa è stato scoperto un autoinduttore di natura diversa: il 2-eptil-3-idrossi-4-chinolone (chiamato PQS). PQS regola parzialmente l'espressione del gene dell'elastasi lasB insieme ai due sistemi QS sopra descritti. L'espressione del PQS richiede la proteina LasR e il PQS, a sua volta, attiva la trascrizione genica rhI.

Pertanto, i sistemi QS sono coinvolti nel controllo della virulenza P. aeruginosa in una complessa rete gerarchica di regolazione.

La microscopia polmonare di pazienti con fibrosi cistica (CF) lo ha scoperto P. aeruginosa vive lì principalmente nella composizione dei biofilm. È stato dimostrato che le cellule P. aeruginosa, cuscinetto lasI mutazione, non formano biofilm maturi, la formazione dei biofilm si ferma allo stadio di microcolonie. Queste mutazioni potrebbero essere integrate dall'aggiunta esogena dell'autoinduttore 3OC12-HSL. Ricerca effettuata con P. aeruginosa hanno dimostrato che la formazione di biofilm può essere il fattore più importante nella colonizzazione polmonare da parte di questo patogeno.

Un altro batterio patogeno in cui viene studiato attivamente il ruolo del QS nella regolazione della virulenza è Burkholderia cepacia, contiene il sistema CepI-CepR QS coinvolto nella regolazione dei fattori di patogenicità (esoproteasi, siderofori). La sintesi degli autoinduttori QS della regolazione dell'N-ottanoil-omoserina lattone (C8-HSL) e dell'N-esanoil-omoserina lattone (C6-HSL) in questo batterio è molto debole. E 'stato mostrato. che nella maggior parte dei casi nei pazienti affetti da fibrosi cistica, i polmoni sono stati infettati contemporaneamente B. cepacia E P. aeruginosa. Allo stesso tempo, la comunicazione interspecie tra questi batteri potrebbe aumentare la patogenicità. B. cepacia. Pertanto, l'aggiunta di fluido di coltura P. aeruginosa alle culture B. cepacia ha portato ad un aumento significativo dell'attività dell'esoproteasi e della produzione di siderofori. Questo è stato il primo esempio in cui un batterio poteva regolare la produzione dei suoi fattori di patogenicità attraverso la sintesi dell'IA da parte di un altro batterio. Lo studio di tali caratteristiche del comportamento dei batteri in condizioni naturali apre nuovi aspetti importanti per l'epidemiologia. In effetti, l'epidemiologia non tiene conto di situazioni del tutto possibili in cui l'interazione di batteri non patogeni che producono AHL e batteri debolmente patogeni (o praticamente non patogeni in determinate condizioni) può portare allo sviluppo di un'infezione. I dati attualmente disponibili sollevano fortemente la questione della necessità di studi seri sulla comunicazione di vari batteri in condizioni naturali e sui meccanismi molecolari di tale comunicazione.

QSnei batteri Gram-positivi

Nei batteri Gram-positivi, diversi sistemi coinvolti nel controllo della virulenza Stafilococco aureola, nella regolazione della competenza (cioè la capacità di accettare DNA esogeno durante la trasformazione) in Streptococco polmonite, regolazione della competenza e della sporulazione in bacillo subtilis. I peptidi secreti, AIP, sono utilizzati come autoinduttori dei sistemi QS nei batteri Gram-positivi. Tra questi ci sono peptidi lineari e peptidi contenenti un anello tiolattone. Sono riconosciuti da recettori specifici, le istidina chinasi sensoriali bicomponenti legate alla membrana. Le molecole di segnalazione peptidica non si diffondono attraverso la membrana cellulare; Apparentemente, gli esportatori di peptidi sono responsabili del loro rilascio dalla cellula nel mezzo. Nella maggior parte dei casi si verifica l'elaborazione e la modifica dei peptidi. Vari batteri Gram-positivi sintetizzano varie molecole di segnalazione peptidica. Il meccanismo di segnalazione funziona attraverso una cascata di fosforilazione/defosforilazione. La chinasi sensoriale viene fosforilata, dopo di che il gruppo fosforilico viene trasferito alla proteina corrispondente, il regolatore della risposta. Il regolatore della risposta fosforilata si lega al DNA e attiva la trascrizione del gene bersaglio.

Il sistema meglio studiato è QS Stafilococco aureola. S. aureola utilizza una strategia bifasica per l'infezione dell'ospite. A una bassa densità di popolazione di batteri (il primo stadio dell'infezione), le cellule producono fattori proteici che ne promuovono l'attaccamento e la colonizzazione; ad alta densità di popolazione (secondo stadio), i batteri reprimono la sintesi di questi fattori e in essi inizia la secrezione di tossine e proteasi; questa fase è regolata dal sistema Agr QS. Il sistema include il peptide autoinduttore AIP e agrBDCA-operone. Gene agrD codifica AIP, geni agrC E agrA- due proteine bicomponenti, chinasi sensore, AgrC e AgrA. Gene agrB codifica per una proteina che esporta e modifica l'AIP (aggiunge un anello tiolattone). Il legame di AIP con AgrC porta alla fosforilazione di AgrA. L'AgrA fosforilato induce l'espressione dell'RNA regolatore (RNAIII), che reprime l'espressione dei fattori di adesione cellulare durante la seconda fase dell'infezione. Anche l'AgrA attivato induce l'espressione aggr operone, che provoca l'induzione della sintesi AIP.

Si conoscono quattro gruppi S. aureola, sintetizzando AIP con sequenze diverse. È interessante notare che ciascun tipo di AIP attiva il proprio recettore AgrC, ma inibisce l'attivazione delle proteine recettrici negli altri tre gruppi a causa del legame competitivo con queste proteine; di conseguenza, l’AIP di ciascun gruppo di stafilococchi sopprime l’attivazione della cascata di virulenza dei restanti tre gruppi S. aureola. Secondo questa strategia, il peptide purificato AIP II del gruppo stafilococcico sopprime la virulenza S. aureola gruppo I nell'infezione dei topi.

Il secondo meccanismo QS, funzionante in S. aureola, include la proteina RAP (nota anche come proteina ribosomiale L2) e la proteina TRAP; quest'ultimo è un fattore di trascrizione citoplasmatica. La TRAP nello stato fosforilato attiva l'RNA III; la sua fosforilazione è stimolata dalla proteina RAP. Virulenza S. aureola può essere inibito dal peptide RIP (peptide inibitore dell'RNA III). Il peptide RIP inibisce la fosforilazione della proteina TRAP, portando all'inibizione della sintesi dell'RNA III, che porta alla soppressione della sintesi delle tossine e ad una diminuzione della virulenza cellulare. La fosforilazione della TRAP può essere inibita anche in presenza di AIP; ciò dimostra che una complessa rete di trasduzione del segnale è coinvolta nella regolazione della patogenesi S. aureola.

In altri batteri gram-positivi, gli streptomiceti, tra i quali sono i principali produttori di sostanze antibiotiche utilizzate in medicina, composti di diversa natura, i γ-butirrolattoni, vengono utilizzati come autoinduttori dei sistemi QS. Il QS in questi batteri è coinvolto nella regolazione della loro differenziazione morfologica e nella produzione di metaboliti secondari. È interessante notare che le molecole di segnalazione degli streptomiceti sono strutturalmente simili ai lattoni N-acil0-omoserina dei batteri Gram-negativi. Non è noto, tuttavia, se esista in natura una comunicazione tra questi gruppi di batteri tassonomicamente distanti che utilizzano queste molecole di segnalazione.

QSsistema autoinduttoreAI-2

L'autoinduttore AI-2 è stato scoperto per la prima volta nelle cellule Vibrione Harveyi; è un composto dalla struttura insolita, un diestere di furanosil borato. L'AI-2 si accumula nella seconda metà della fase di crescita esponenziale, ma il suo contenuto diminuisce drasticamente quando la coltura entra nella fase stazionaria.

L'AI-2 sintasi è la proteina LuxS codificata dal gene luxS; geni luxS altamente omologhi tra i batteri. In effetti, il gene luxS presente nella metà di tutti i genomi batterici sequenziati.

L'AI-2 viene prodotto dalla S-adenosilmetionina attraverso tre fasi; Il substrato per la LuxS sintasi è la S-adenosil-omocisteina, che viene ulteriormente convertita in adenina, omocisteina e 4,5-diidrossi-2,3-pentanedione (DPD). Il DPD, un prodotto altamente reattivo che si riorganizza facilmente ed entra in ulteriori reazioni, può formare molecole segnale che varie specie batteriche riconoscono come AI-2. Recentemente è stata determinata la struttura di un'altra molecola segnale, AI-2 Salmonella typhimurium; questa sostanza di natura furanica differisce da AI-2 V. Harveyi, Compreso, non contiene un atomo di boro. È stato dimostrato che questi due AI-2 e i loro precursori derivati dal DPD possono essere in equilibrio in condizioni naturali e facilmente interconvertirsi. Si presume che la comparsa del boro nella molecola AI-2 V. Harveyi potrebbe essere dovuto all'elevata concentrazione di questo elemento nell'acqua di mare, dove vive questo batterio; allo stesso tempo, la sua concentrazione nell'habitat S. typhimurium molto inferiore. La presenza di boro nella molecola AI-2 V. Harveyi e la sua assenza in AI-2 S. typhimurium, apparentemente essenziali per l'azione di questi autoinduttori nelle cellule degli organismi che li producono.

Pertanto, questi ancora pochi studi sui sistemi QS, compresi gli autoinduttori del tipo AI-2, hanno dimostrato che, utilizzando una via biosintetica conservativa utilizzando l'enzima LuxS, i batteri sintetizzano intermedi di molecole di segnalazione, il cui ulteriore destino può essere determinato dal caratteristiche dell'ambiente.

A Vibrione Harveyi la proteina del sensore del recettore è LuxP, che lega direttamente l'AI-2. Il complesso LuxP-AI-2 interagisce con l'istidina chinasi legata alla membrana LuxQ. A basse densità di popolazione batterica, LuxQ viene fosforilato e il fosfato viene trasferito alla proteina citoplasmatica LuxU e quindi da questa proteina alla proteina regolatrice legante il DNA LuxO. Successivamente, si verifica una complessa catena di eventi, inclusa l'attivazione di geni che codificano cinque piccoli RNA regolatori da parte della proteina fosfo-LuxO e della subunità sigma 54 della RNA polimerasi; questi RNA interagiscono con la proteina chaperone Hfq RNA, determinando il legame e la destabilizzazione dell'mRNA che codifica per l'attivatore della trascrizione LuxR. LuxR è richiesto per l'attivazione della trascrizione lux operone Vibrione Harveyi; a basse densità di popolazione batterica mRNA luxR degrada e di conseguenza non c'è bioluminescenza. Ad elevate densità di popolazione batterica, la quantità di AI-2 aumenta notevolmente, il che porta alla defosforilazione della proteina LuxO. LuxO non fosforilato non può indurre l'espressione di piccoli RNA regolatori. Di conseguenza, la traduzione dell'mRNA diventa possibile. luxR, Sintesi proteica LuxR e bioluminescenza. Pertanto, l’accumulo di AI-2 alla fine provoca l’attivazione dell’espressione genica lux operone. Di grande interesse è il fatto che nel regolamento lux operone V. Harveyi prendono parte tre tipi di sistemi QS autoinduttori che interagiscono tra loro: AI-2, AHL (tab.) e CAI-1.

Al momento, la questione del ruolo dell’AI-2 come molecola di segnalazione e regolatore dell’espressione genica in diversi batteri rimane insufficientemente studiata e richiede ulteriori ricerche.

Per quanto riguarda i batteri patogeni basati sullo studio di mutanti con un gene inattivato lux S, questo gene, ritenuto essere il gene AI-2 sintasi, ha dimostrato di essere coinvolto nella regolazione dell'espressione di geni associati alla virulenza dei ceppi enteropatogeni. E. coli, Vibrione colera, Streptococco piogene. I sistemi QS di questo tipo sono regolatori globali dell'espressione genica batterica; quindi è stato dimostrato lux S è coinvolto nella regolazione della trascrizione di 242 geni E. coli, costituendo il 5,6% del genoma di questo batterio.

Tra i batteri della famiglia Enterobatteriacee I sistemi QS di Tipo II sono i più studiati E. coli E S. typhimurium. A S. typhimurium sono stati trovati geni che codificano per un tipo di recettore AI-2 diverso dal recettore AI-2 LuxP V. Harveyi. È un trasportatore dipendente dall'ATP denominato LsrB (regolamentato da LuxS). Lo stesso recettore AI-2 è stato trovato in altri membri della famiglia Enterobatteriacee. Una volta all'interno della cellula, l'AI-2 viene fosforilato e si lega alla proteina LsrR. In assenza di AI-2, la proteina LsrR reprime lsr operone. L'AI-2 si accumula nella seconda metà della fase di crescita esponenziale, il suo contenuto nel mezzo diminuisce drasticamente quando la coltura entra nella fase stazionaria. Celle E. coli E S. typhimurium importare AI-2 durante la transizione alla fase stazionaria utilizzando il trasportatore Lsr.

Basato sullo studio dell'effetto delle mutazioni che inattivano il gene lux S, si è concluso che la LuxS sintasi è coinvolta nella regolazione dell'espressione dei geni associati alla virulenza nei ceppi patogeni E. coli EHEC ed EPEC - controllano l'espressione del sistema di secrezione di tipo III, che è codificato dai geni del locus LEE, è coinvolto nella regolazione della migrazione cellulare, nella formazione di biofilm, nella sintesi di tossine, ecc. L'analisi del trascrittoma ha mostrato che LuxS è un regolatore globale dell'EHEC, che controlla l'espressione di oltre 400 geni. È stata pubblicata una grande quantità di dati che dimostrano che le mutazioni nel gene lux S portano all'assenza della sintesi AI-2 e hanno un effetto significativo sui processi cellulari di vari batteri della famiglia Enterobatteriacee: S. marcescens, Serratia sp. , Erwinia carotovora E amylovora.

Tuttavia, negli esperimenti di complementazione, si riscontrano mutazioni nel gene lux S quando si utilizza AI-2 isolato e sintetizzato chimicamente, si è riscontrato che non tutti i fenotipi dipendono da lux S , controllato direttamente da AI-2. Il ruolo normativo dell'AI-2 è stato dimostrato con precisione per il ceppo di bioluminescenza V. Harveyi BB170 ed espressione lsr-operone y S. typhimurium. Questi risultati indicano che i dati sull’effetto dell’AI-2 su alcune proprietà delle cellule precedentemente considerate dipendenti dal sistema QS di tipo II dovrebbero essere riconsiderati, tenendo conto che la sintesi dell’AI-2 non è l’unica funzione della LuxS sintasi. Nelle cellule batteriche con geni inattivati lux S accumula S-ribosil-omocisteina, poiché non viene ulteriormente scissa in omocisteina e DPD. In questo caso, il livello di omocisteina, necessario per la sintesi della metionina, diminuisce drasticamente nella cellula e la cellula utilizzerà altri modi per formarla, in particolare attraverso l'ossalacetato. Pertanto, i cambiamenti nell'espressione di vari geni in lux I mutanti S possono essere determinati non (o non solo) dalla regolazione del QS, ma anche da gravi disturbi nel metabolismo batterico, che causano effetti pleiotropici.

Per rispondere alla domanda se l'influenza lux Mutanti S per vari fenotipi batterici con l'assenza del funzionamento dei sistemi QS basati su AI-2, o è il risultato di effetti pleiotropici nei disordini metabolici, è stata effettuata un'analisi dei database genomici per la presenza di geni di noto Recettori AI-2 (recettore LuxP Vibrio Harveyi e il recettore Lsr S. typhimurium) È stato suggerito che la dipendenza dei fenotipi dalla regolazione del QS di tipo II sia limitata prevalentemente agli organismi portatori dei geni del recettore AI-2 e la variazione fenotipica in lux S i mutanti che non contengono questi geni possono essere spiegati da disturbi nel metabolismo cellulare. L'analisi genomica ha permesso di stabilire la presenza di recettori AI-2 simili a Lsr nei membri della famiglia Enterobatteriacee, ad esempio E. coli, Photorhabdus luminescens, Klebsiella pneumoniae,Yersinia spp., Shigella dissenterie E Shigella flexneri, Salmonella spp.

Omologhi dei recettori AI-2 noti non sono stati trovati nelle banche di sequenze genetiche e proteiche pubblicate di batteri del genere Serratia E Erwinia. Anche se non sorprende, l’assenza della chinasi sensoriale bicomponente LuxPQ (questo recettore è stato finora trovato solo nei membri della famiglia Vibrionaceae), l'assenza del complesso recettore Lsr nel genoma di questi batteri è stata una sorpresa. Questo fatto solleva seri dubbi sull'esistenza in essi di sistemi QS che funzionano con la partecipazione di AI-2 e suggerisce un ruolo prevalentemente metabolico di LuxS in questi batteri. Anche se, ovviamente, non si può escludere la possibilità che non abbiano ancora studiato i recettori AI-2.

Pertanto, le funzioni delle sostanze del tipo AI-2 possono essere diverse nei diversi batteri. Tuttavia, anche nei casi in cui queste sostanze nella composizione dei sistemi QS non sono regolatori dell'espressione genica della cellula ospite, possono, una volta rilasciate nell'ambiente, partecipare alla regolazione dei processi cellulari di altri batteri nella popolazione, svolgendo la loro azione comunicazione. Relazioni simili sono state dimostrate per popolazioni batteriche miste artificiali costituite da cellule E. coli E V. Harveyi, E V. colera, con cui può coesistere E. coli nel corpo umano.

Sistemi QS che utilizzano un autoinduttoreAI-3 e ormoni

L'AI-3 è stato descritto per la prima volta come un componente del terreno di coltura utilizzato del ceppo patogeno EHEC, che attivava l'espressione dei geni responsabili dell'adesione batterica alle cellule eucariotiche. Esperimenti sullo studio della struttura dell'AI-3 hanno dimostrato che questo composto è di natura aromatica, è stato suggerito che la natura aminoacidica dell'AI-3. Tuttavia, la struttura completa e il meccanismo di sintesi di questa molecola di segnalazione non sono stati ancora determinati. Si presume che, come nel caso dell'AHL, esista un'intera famiglia di composti simili all'AI-3. È stato dimostrato che la sintesi dell'AI-3 è indipendente dal gene lux S V E. coli, in contrasto con la sintesi di AI-2. È stato scoperto che l'AI-3 attiva la trascrizione dei geni di virulenza del locus LEE nei ceppi EHEC E. coli. Per determinare l'AI-3, sono stati ottenuti biosensori: ceppi E. coli K-12 contenente costrutti nel cromosoma basati sui geni del locus LEE e sul gene reporter lac Z. Con l'aiuto di biosensori, si è scoperto che vari batteri della microflora intestinale, ceppi non patogeni E. coli E Enterobatteri cloache e specie patogene Shigella, Salmonella E Klebsiella, sintetizzare

Perché l'AI-3 funzioni E. coliè richiesto un sistema a due componenti, incluso il sensore chinasi QseC e il regolatore di risposta QseB. In presenza di AI-3 nello spazio periplasmatico, QseC viene prima fosforilato, quindi trasferisce il fosfato a QseB, che si lega ai promotori corrispondenti e attiva l'espressione del proprio gene e dei propri geni. flhDC-operone responsabile della sintesi dei flagelli. L'AI-3 è anche coinvolto nella regolazione dei geni del locus LEE. Si è scoperto che un sistema a due componenti, chiamato QseEF, è responsabile della regolazione di questi geni.

I sistemi QseCB e QseEF, oltre ad AI-3, rispondono ad un'altra classe di molecole di segnalazione, gli ormoni catecolaminici, in particolare l'epinefrina/norepinefrina (o epinefrina/norepinefrina) sintetizzata dall'organismo ospite. L'analisi dei genomi batterici ha dimostrato che le cascate di segnalazione AI-3/epinefrina/norepinefrina sono presenti in un gran numero di specie batteriche.

QSe l'apoptosi nei batteri.

Oltre ai sistemi QS sopra descritti, E. coli è stato scoperto il sistema QS, che funziona con la partecipazione di peptidi come molecole di segnalazione, coinvolte nella regolazione dell'apoptosi batterica. L'apoptosi o morte cellulare programmata (PCD) è un programma geneticamente determinato di morte cellulare negli organismi eucarioti multicellulari. La PKC contribuisce al normale funzionamento del sistema biologico, liberandolo dalle cellule danneggiate che hanno completato il loro ciclo vitale o compaiono a seguito di mutazioni di cellule potenzialmente pericolose. Sistemi con una funzione simile sono stati trovati anche nei procarioti. La morte di una parte della popolazione cellulare può essere considerata un analogo procariotico dell'apoptosi. batteri in condizioni di arresto della crescita della popolazione, ad esempio nella fase stazionaria della crescita quando il substrato nutritivo è esaurito o sotto l'influenza di fattori di stress. Come risultato della morte e dell'autolisi di alcune cellule, le restanti cellule viventi possono utilizzare i prodotti dell'autolisi come substrato nutritivo e continuare a crescere, sintetizzando i componenti cellulari necessari, utili per la sopravvivenza delle popolazioni batteriche. La PCD può facilitare lo scambio di informazioni genetiche in una popolazione batterica rilasciando DNA come risultato della lisi cellulare. Inoltre, la distruzione delle cellule con danni all’apparato genetico è benefica anche per la popolazione batterica.

I meccanismi genetici della PCD nei sistemi procariotici non sono stati completamente chiariti. Molta attenzione è stata dedicata allo studio dei sistemi tossina-antitossina (sistemi TA) presenti in Escherichia coli e altri batteri. I moduli TA sono costituiti da una coppia di geni nei genomi batterici: un gene che codifica per una tossina stabile che causa la morte cellulare e un gene che codifica per un'antitossina labile che inibisce l'attività delle tossine; i geni della tossina sono co-trascritti con i geni delle corrispondenti antitossine all'interno dello stesso operone.

Sistema E. coli maz EF è uno dei sistemi AT più studiati. Gene maz Codici F per una proteina citotossica stabile e maz E è un'antitossina instabile degradata dalla serina proteasi ClpAP ATP-dipendente. La tossina MazF è un'endoribonucleasi che taglia preferenzialmente gli mRNA a filamento singolo nella sequenza ACA e agisce anche sull'RNA 16S nel centro di decodificazione della subunità 30S del ribosoma, con conseguente inibizione della sintesi proteica. Finché MazE e MazF sono co-espressi, MazE interagisce con MazF per neutralizzare i suoi effetti tossici. Nelle cellule che crescono normalmente, la tossina e l'antitossina formano un complesso stabile, che impedisce alla tossina di esercitare il suo effetto tossico. In condizioni di stress che impediscono l'espressione maz L'operone EF, le proteasi indotte dallo stress degradano MazE e, di conseguenza, la tossina MazF stabile può agire sugli RNA cellulari, portando alla morte cellulare e all'autolisi della maggior parte della popolazione.

maz L'apoptosi mediata da EF dipende dalla densità della popolazione, è regolata dal fattore QS EDF (fattore di morte extracellulare, fattore di morte extracellulare). EDF è un pentapeptide lineare Asn-Asn-Trp-Asn-Asn. È stato scoperto che EDF aumenta l'attività di MazF In vitro. Allo stesso tempo, l’attivazione di MazF ha portato ad un aumento della sintesi di EDF, che a sua volta ha causato un aumento della morte cellulare in condizioni di stress. È stato trovato un legame sito-specifico diretto di EDF e MazF. I risultati degli studi condotti mostrano che il sistema QS coinvolto nella regolazione dell’apoptosi in E. coli, è fondamentalmente diverso dai sistemi QS sopra descritti Enterobatteriacee: 1) EDF è l'unica molecola di segnalazione peptidica trovata in E. coli; 2) la maggior parte delle molecole conosciute coinvolte nel funzionamento di QS controllano l'espressione genica a livello trascrizionale e EDF a livello post-trascrizionale.

Recentemente sono stati scoperti diversi piccoli peptidi QS che differiscono nella sequenza aminoacidica dall'EDF sintetizzato dai batteri Gram-negativi. Pseudomonas aeruginosa e Gram positivi bacillo subtilis, che potrebbe essere coinvolto nella regolazione della morte cellulare controllata da maz EF . Ciascuno di questi peptidi, nonostante le differenze nella struttura, ha attivato l'attività endoribonucleolitica di MazF. E. coli, apparentemente interagendo con vari siti su questa proteina. Così è stata scoperta la famiglia QS di peptidi EDF, che in seguito potrà diventare la base per ottenere un nuovo tipo di regolatori che attivano PKC.

I suddetti sistemi QS e gli autoinduttori coinvolti nel loro funzionamento non esauriscono tutti quelli attualmente conosciuti; il numero di nuove aperture è in costante aumento.

inibizioneQSsistemi di batteri: un nuovo approccio alla creazione di farmaci contro la patogenicità

Uno dei problemi più importanti della medicina moderna è la crescente diffusione di batteri patogeni resistenti ai farmaci tradizionali. Questo problema è particolarmente evidente nell’ampia diffusione delle infezioni ospedaliere, che ormai si registrano nei reparti di terapia intensiva in oltre il 20% dei pazienti. La diffusione di forme resistenti di batteri patogeni, che riduce l’efficacia e svaluta il numero crescente di farmaci tradizionali comunemente usati, e la necessità di sviluppare metodi per sopprimere la formazione di biofilm da parte dei batteri solleva la questione di nuove strategie per combattere le malattie infettive , la creazione di farmaci di nuova generazione che influenzano specifici sistemi biochimici di microrganismi.

Attualmente è generalmente accettato che uno degli "obiettivi" più promettenti di questo tipo sia la regolamentazione del Quorum Sensing. I sistemi QS, come notato sopra, sono coinvolti nella regolazione della virulenza batterica e nella formazione di biofilm da parte loro.

Si propone che i farmaci volti a sopprimere i sistemi QS siano chiamati "veleni di patogenicità", perché. essi, a differenza dei classici farmaci antimicrobici (antibiotici principalmente), non hanno un effetto battericida o batteriostatico sui batteri patogeni e quindi non creano una pressione selettiva che porta alla formazione di forme di batteri patogeni resistenti alle sostanze antibatteriche. Recentemente, all'estero sono state costituite società di biotecnologia, che mirano a sviluppare agenti che inibiscono la regolazione QS e, di conseguenza, riducono la patogenicità dei batteri e prevengono la formazione di biofilm da parte loro.

La soppressione del funzionamento dei sistemi QS può essere ottenuta in diversi modi.

1. Soppressione della sintesi di autoinduttori QS sistemi.

Come accennato in precedenza, la S-adenosilmetionina (SAM) è un substrato per la sintesi dei sistemi autoinduttori AHL e AI-2 QS di due tipi. È stato dimostrato che vari analoghi della SAM, ad esempio la S-adenosilomocisteina, la S-adenosilcisteina, agivano come forti inibitori della sintesi di AHL in Pseudomonas aeruginosa. Va notato che l'interazione dell'AHL sintasi con la SAM sembra essere molto specifica, nonostante il fatto che la SAM sia un precursore comune in molte vie biochimiche procariotiche ed eucariotiche. Ciò ci consente di sperare che gli analoghi della SAM possano essere utilizzati come inibitori specifici della sintesi di autoinduttori dei sistemi regolatori del QS batterico che non influenzano gli enzimi eucariotici.

È stato dimostrato che alcuni antibiotici - macrolidi, inibitori della sintesi proteica a livello ribosomiale, sopprimono la sintesi di AHL e alcuni fattori di virulenza a concentrazioni che non inibiscono la crescita batterica. Ad esempio, concentrazioni subinibitorie di eritromicina hanno soppresso la sintesi di AHL e fattori di virulenza dell’emolisina, proteasi ed emoagglutinine nell’organismo. Pseudomonas aeruginosa. I batteri trattati con antibiotici erano meno virulenti nei topi. Questi dati erano coerenti con i risultati delle osservazioni cliniche che dimostrano l'efficacia dell'uso di basse dosi di eritromicina e altri macrolidi nelle infezioni causate da ceppi P. aeruginosa, resistenti a questi antibiotici. Azitromicina ad una concentrazione di 2 μg / ml, non inibisce la crescita P. aeruginosa, ha inibito la sintesi di AHL, nonché la produzione di fattori di virulenza elastasi e ramnolipidi. Allo stesso tempo, l’aggiunta di AHL alla coltura in modo esogeno ha portato al ripristino della produzione di questi fattori di virulenza, dimostrando che era la sintesi di AHL il bersaglio primario dell’antibiotico. Il meccanismo d’azione degli antibiotici macrolidi sulla sintesi dell’AHL rimane attualmente poco chiaro.

2. Inibizione del legame degli autoinduttori al corrispondente

proteine regolatrici .

La soppressione del funzionamento dei sistemi regolatori del QS può essere ottenuta utilizzando molecole antagoniste autoinduttrici che interferiscono con il legame dell'AI con le molecole proteiche del recettore. È stato dimostrato che tali inibitori possono competere con l’AHL; in questo caso sono strutturalmente simili alla molecola segnale dell’autoinduttore e si legano al sito di legame dell’AHL della proteina recettore, ma non attivano questa proteina. Gli inibitori non competitivi possono avere poca o nessuna somiglianza con l'AHL; questi composti si legano a vari siti sulla proteina recettore. Attualmente tali inibitori vengono studiati attivamente; la ricerca di inibitori competitivi viene effettuata utilizzando la progettazione computerizzata.

Sono stati ottenuti dati sull'inibizione della regolazione del QS da parte degli analoghi dell'AHL che apportano modifiche in varie parti delle molecole dell'AHL - nelle catene aciliche e nell'anello lattone dell'omoserina. È stato dimostrato che la lunghezza della catena acilica è essenziale per l'attività dell'AHL. Gli analoghi dell'AHL con catene aciliche più lunghe dell'AHL nativo potrebbero essere inibitori dell'attività del sistema QS. La sostituzione dei gruppi 3-oxo nelle molecole AHL con gruppi 3-idrossile o metilici, l'introduzione di legami insaturi nelle catene aciliche porta ad una significativa diminuzione dell'attività AHL.

Le modifiche nell'anello lattone omoserina delle molecole AHL influenzano significativamente la loro attività. Gli AHL naturali sono gli-isomeri; gli isomeri d generalmente non mostrano attività biologica. La presenza della catena acilica sembra essere essenziale per l'attività biologica dell'AHL. La sostituzione dell’anello lattone omoserina con quello omocisteina lattone ha ridotto l’attività dell’AI di un ordine di grandezza, mentre la sostituzione con l’anello lattamico omoserina ha comportato l’assenza di proprietà attivanti o antagoniste di questa molecola. Tuttavia, le molecole in cui l'omoserina lattone viene sostituita con l'omoserina tiolattone possono mantenere l'attività durante il funzionamento di alcuni sistemi QS.

Quando si studia l'azione degli analoghi del sistema AHL Las P. aeruginosa con sostituzioni nell'anello lattone omoserina, è stato dimostrato che l'atteggiamento verso queste sostituzioni era diverso nel caso dell'interazione di questi analoghi con le proteine RhlR e LasR. Questo fatto potrebbe indicare che ci sono due proteine recettrici P. aeruginosa differiscono in modo significativo in

i loro siti di legame AHL.

Recentemente è stata prestata molta attenzione agli antagonisti naturali del QS degli autoinduttori, ai derivati del furanone, compresi quelli alogenati. Sono state trovate alghe rosse australiane Delisea pulchra sintetizza vari tipi di furanoni alogenati; la loro produzione impedisce la colonizzazione di queste alghe da parte di batteri marini, nei quali il sistema QS è coinvolto nella regolazione dei processi metabolici, e quindi protegge le piante dall'azione dei batteri. Furanoni D. pulchra contengono un anello furanico con una catena acilica sostituita nella posizione C-3 e atomi di bromo nella posizione C-4. Le sostituzioni nella posizione C-5 possono variare. I furanoni provenienti da fonti naturali sono alogenati in varie posizioni con atomi di bromo, iodio o cloro.

Dopo la scoperta dell'effetto dei furanoni si formarono D. pulchra, in vari laboratori è stato effettuato un ampio screening di sostanze di origine naturale ed è stata effettuata la produzione di sostanze chimicamente sintetizzate, derivati dei furanoni, inibitori del QS. Tra questi c'erano derivati dei furanoni con catene aciliche di varia lunghezza. È stato dimostrato che anche un derivato furanonico senza catena acilica con due atomi di bromo era un inibitore del sistema QS P. aeruginosa. Si è scoperto che i derivati del furanone sono prodotti da vari organismi: alghe marine verdi, rosse e brune, funghi, ascidi, attinomiceti, ecc.

Lo studio del meccanismo d'azione di queste sostanze sul sistema QS ha dimostrato che composti di natura furanonica competono con AHL per il sito di legame alle proteine recettrici di tipo LuxR. Il legame dei furanoni alla proteina recettore influenza la stabilità del complesso proteina-ligando, portando ad una rapida scissione della proteina recettore.

L'azione dei furanoni ha comportato l'inibizione dei processi cellulari regolati dal QS: bioluminescenza Vibrione fischeri; produzione di fattori di virulenza, inclusa la formazione di biofilm, e patogenesi P. aeruginosa; virulenza Erwinia carotovora. Molti furanoni sintetizzati chimicamente erano molto più efficaci di quelli naturali. Di grande interesse è il fatto che i furanoni sintetici erano attivi contro i batteri nei biofilm alle stesse concentrazioni che contro la regolazione del QS dei batteri planctonici, in contrasto con l’azione degli antibiotici classici usati per combattere le infezioni. P. aeruginosa; in quest'ultimo caso la concentrazione dell'antibiotico durante la crescita dei batteri nei biofilm avrebbe dovuto essere 100-1000 volte superiore.

L'uso dell'analisi trascrittomica ha permesso di determinare che l'aggiunta di composti furanonici alle cellule influenza l'espressione di 93 geni P. aeruginosa PAO1; il funzionamento dell'80% di questi geni è stato regolato con la partecipazione di sistemi QS, ad esempio geni che codificano per l'elastasi, la proteasi LasA coinvolta nella sintesi di ramnolipidi, fenazine, cianuro e chitinasi.

Recentemente è stato dimostrato che un derivato furanonico prodotto dalle alghe D. pulchra, (5Z)-4-bromo-5-(bromometilene)-3-butil-2(5H)-furanone, ha inibito il QS nelle cellule Escherichia coli con la partecipazione dell'autoinduttore AI-2; questo composto ha anche inibito la formazione di biofilm e ha represso 56 geni E. coli, il 79% dei quali sono stati indotti da AI-2. Sotto l'azione di questo composto, la concentrazione extracellulare di AI-2 è stata dimezzata; si presume che questo effetto sia avvenuto a livello post-trascrizionale.

I dati sopra riportati mostrano che i derivati furanonici sono promettenti per la preparazione di agenti terapeutici contro la patogenicità dei batteri. Tuttavia, i composti attualmente testati con azione inibitoria sulla regolazione del QS sono tossici per uso medico. Un compito urgente è la loro modifica e la ricerca di nuove sostanze non tossiche per uso pratico.

I batteri e gli organismi eucarioti producono sostanze di diversa natura che sopprimono la regolazione del QS nei batteri: dipeptidi ciclici (dichetopiperazine); sono stati menzionati sopra come composti capaci di attivare il sistema QS. Si ritiene inoltre che interagiscano con i siti di legame AHL sulle proteine recettrici.

3. Degradazione AHL .

La degradazione degli autoinduttori dei sistemi QS è uno dei modi promettenti per combattere le infezioni batteriche regolate da questi sistemi. La degradazione dell'AHL può essere dovuta all'azione di enzimi specifici di batteri e organismi superiori; inoltre, possono decomporsi a seguito dell'idrolisi alcalina, a pH elevato, a temperature elevate per la crescita dei batteri. È attualmente in corso lo screening attivo degli enzimi che degradano l'AHL, principalmente le lattonasi che degradano l'anello lattone dell'omoserina.

Nei bacilli sono state trovate lattonasi che idrolizzano l'AHL; la proteina corrispondente è stata denominata AiiA. È stato dimostrato che la presenza di questo enzima nelle cellule batteriche determina in gran parte la loro capacità di sopprimere i batteri fitopatogeni, la cui virulenza è regolata dai sistemi QS con la partecipazione di AHL. Trasferimento del gene ricombinante AHL-lattonasi nelle cellule Pseudomonas fluorescens aumentata la capacità del ceppo di biocontrollare le malattie delle piante causate da batteri fitopatogeni. Inoltre, è stato dimostrato che le piante transgeniche contengono il gene introdotto aiiA, espressi nella pianta erano significativamente meno suscettibili alle infezioni Erwinia carotovora. Introduzione del gene aiiA nelle cellule di questo fitopatogeno hanno ridotto la sintesi di AHL e, di conseguenza, hanno ridotto l'attività degli enzimi pectolitici e la manifestazione di altri sintomi di marciume vegetale. Si sta studiando anche il potenziale delle acilasi AHL prodotte dai batteri di degradare l'AHL.

Gli organismi superiori mostrano anche meccanismi per la degradazione specifica dell'AHL. Di grande interesse è l’evidenza che le cellule epiteliali delle vie aeree umane sono in grado di inattivare l’AHL. P. aeruginosa– 3OC12HSL, ma non C4-HSL. Questa inattivazione sembra essere di natura enzimatica. Anche altri AHL vengono degradati, come C6-HSL. La capacità di degradare l'AHL è stata riscontrata in alcune cellule di mammiferi, ma non in tutte. Questa scoperta apre una nuova area di ricerca e solleva la speranza che il corpo umano abbia un’altra linea di difesa contro le infezioni batteriche, attraverso l’interazione con la regolazione QS della virulenza batterica.

La ricerca e lo studio degli enzimi che degradano gli autoinduttori dei sistemi QS rappresenta una nuova strada promettente per ottenere agenti terapeutici mirati a combattere le infezioni batteriche.

4. Soppressione QS sistemi di batteri gram-positivi.

Virulenza Stafilococco aureola, controllati dai sistemi QS, possono essere inibiti dai peptidi RIP naturali, dai loro analoghi sintetizzati chimicamente e dai peptidi chimerici. Questi peptidi competono con il peptide RAP inibendo la fosforilazione della proteina TRAP e, di conseguenza, sopprimono la sintesi dell'RNAIII, che porta all'inibizione della virulenza batterica. È stato dimostrato che i peptidi RIP inibiscono la formazione di biofilm in vivo. S. aureola E S. epidermide. L'efficacia dei peptidi è stata dimostrata quando utilizzati come modello su vari animali infettati S. aureola. L'uso simultaneo di peptidi RIP e antibiotici ha fornito un effetto sinergico, portando alla sopravvivenza del 100% dei topi infettati con S. aureola. È anche possibile sfruttare l'effetto inibitorio dell'AIP sul QS S. aureola, quanto detto sopra.

I dati ottenuti confermano il potenziale utilizzo di peptidi che interagiscono con i sistemi QS degli stafilococchi per combattere le infezioni cliniche causate da questi batteri. Un altro approccio per la terapia antibatterica dei batteri gram-positivi è la vaccinazione del corpo con proteine, componenti del sistema QS. Ad esempio, è stato dimostrato che la vaccinazione dei topi con la proteina RAP li protegge dalle infezioni. S. aureola.

Conclusione

Studi approfonditi sulla regolamentazione del Quorum Sensing negli ultimi anni hanno dimostrato che i sistemi QS effettuano una regolazione globale di un gran numero di processi cellulari in batteri di vari gruppi tassonomici. Questo tipo di regolazione sembra essere diffusa nei batteri. È stata trovata un'ampia gamma di regolatori a basso peso molecolare con diverse strutture coinvolte nei processi di regolazione del QS; il numero di composti identificati con attività simile è in aumento. La regolamentazione QS richiede sicuramente studi dettagliati e approfonditi. I meccanismi molecolari del funzionamento dei sistemi QS di vario tipo sono stati poco studiati; in molti casi non è chiaro quali proprietà dei batteri siano controllate da questi regolatori; I sistemi QS e il loro ruolo nel metabolismo batterico sono stati studiati solo per un piccolo numero di batteri.

Recentemente è stato dimostrato che gli autoregolatori dei sistemi QS non funzionano solo nei batteri: la loro influenza sui processi cellulari è stata riscontrata anche negli organismi eucarioti. Sopra, l'influenza diretta di 3OC12-HSL (AHL coinvolto nella regolazione della virulenza P. aeruginosa) su alcune proprietà delle cellule di mammifero. Si è scoperto che l'organismo vegetale ( Medicago truncatula) è in grado di rispondere agli AHL batterici (3OC12-HSL e 3OC16-HSL prodotti rispettivamente dall'agente patogeno P. aeruginosa e pianta simbionte Sinorhizobium meliloti). Utilizzando la proteomica, è stato determinato che questi AHL causano cambiamenti globali nella produzione di oltre 150 proteine vegetali. Inoltre, hanno indotto la secrezione da parte delle piante di sostanze che potrebbero interagire con la regolazione del QS batterico, inibendo o stimolando il QS.

Apparentemente, gli organismi eucarioti, piante e animali, nel processo di evoluzione hanno acquisito la capacità di riconoscere i segnali QS e di rispondere ad essi, producendo sostanze strutturalmente simili a queste molecole di segnalazione ed essendo loro concorrenti, oltre a sintetizzare enzimi che distruggono queste molecole di segnalazione. Gli eucarioti possono utilizzare strategie terapeutiche naturali contro la colonizzazione e l’invasione di batteri patogeni, con conseguente inibizione dei processi guidati dal QS.

Quanto precede indica che lo studio dei sistemi di regolazione del QS rappresenta un nuovo vasto campo di attività per i ricercatori in vari campi della biologia e della medicina; questo fenomeno merita la massima attenzione dei ricercatori. L'identificazione e lo studio dei sistemi QS di vari microrganismi possono aprire molte nuove strade nella regolazione dei processi cellulari.

Particolare attenzione è rivolta allo studio della partecipazione dei sistemi QS nella regolazione dei processi associati alla patogenicità dei batteri. Come mostrato sopra, il ruolo essenziale del QS nella regolazione della sintesi del fattore di virulenza nei batteri apre la possibilità di un approccio fondamentalmente nuovo alla creazione di farmaci per la terapia antibatterica - farmaci mirati direttamente a sopprimere la regolazione del QS e, di conseguenza, a sopprimere la patogenicità dei batteri. Attualmente vengono condotti screening e ricerche intensivi sugli effetti di varie sostanze derivate da fonti naturali e come risultato della sintesi chimica sulla regolazione del QS e sull'espressione dei geni correlati al QS. È stata riscontrata un'interazione con QS di sostanze legate ai polifenoli; Perché i polifenoli sono ampiamente distribuiti nel regno vegetale e si suggerisce che possano essere importanti nella protezione delle piante dai batteri patogeni. È stato dimostrato che numerose sostanze prodotte dalle piante sono in grado di interagire con i sistemi QS; la natura di queste sostanze è allo studio.

Attualmente, ci sono tutte le ragioni per credere che i farmaci che inibiscono il QS possano rappresentare un’alternativa promettente ai tradizionali farmaci terapeutici antibatterici per la medicina, l’agricoltura e la tecnologia alimentare. O, almeno, potranno potenziare l’effetto antimicrobico dei farmaci utilizzati. Il lavoro in questa direzione viene svolto attivamente in molti laboratori e aziende in tutto il mondo.