Ceppo di E coli top 10. Escherichia coli - malattie, vie di trasmissione, sintomi di infezioni intestinali e malattie del tratto genito-urinario (in una donna, in un uomo, in un bambino), metodi di trattamento

Una massiccia epidemia di infezione da E. coli di tipo O104 in Europa ha infettato più di 1.800 persone e causato una complicanza potenzialmente fatale nota come sindrome emolitica uremica in più di 500 persone.

L’epidemia ha attraversato i confini di almeno 13 paesi e ha ucciso circa 20 persone.

Mentre le autorità sanitarie faticano a individuare le epidemie nel settore alimentare, l’attenzione internazionale si concentra sulle complesse traiettorie che seguono i prodotti agricoli in un’era di commercio globale.

Un aspetto dell’epidemia, tuttavia, ha ricevuto poca attenzione: questo ceppo anomalo è resistente a molti tipi di antibiotici.

Tra tutte le questioni urgenti sollevate dall’epidemia, questa resistenza del ceppo ci sta facendo suonare tutti i campanelli d’allarme e spingendo a prendere in seria considerazione la questione della frenare l’uso eccessivo di antibiotici causato dall'infezione.

Si è parlato di sfuggita della resistenza del ceppo O104, ma più come un punto curioso che contraddistingue questa infezione che come un problema.

Questo è importante perché il modo più sicuro per trattare le infezioni da E. coli è produce anche tossine come l'Escherichia coli.

Evitare l'uso di antibiotici perché quando i farmaci uccidono i batteri, producono tossine che possono causare i peggiori sintomi della malattia.

Pertanto, poiché gli antibiotici non possono essere utilizzati contro un’infezione da E. coli, la questione se funzioneranno è diventata oggetto di interesse accademico, uno dei tanti dibattuti online da ricercatori volontari che eseguono test rapidi in tutto il mondo.

Anche se non è rilevante per le vittime attuali, è degna di nota la significativa resistenza agli antibiotici di questa infezione da E. coli.

Ciò è in parte dovuto al fatto che la tossina Shiga, prodotta dall'infezione intestinale di ceppi come O104:H4 e il suo ceppo molto più noto O157:H7, è estremamente resistente.

Anche solo per questo motivo è necessario sviluppare nuovi metodi di protezione contro questo terribile nemico.

Ancora più importante, tuttavia, da almeno un decennio sono emersi in Europa nuovi fattori di resistenza che aumentano la resistenza del ceppo O104.

Il loro passaggio a un ceppo dimostra che i fattori di resistenza possono vagare indefinitamente tra gli organismi non appena compaiono.

Ciò dovrebbe evidenziare l’importanza di rallentare lo sviluppo della resistenza agli antibiotici frenando l’uso inappropriato degli antibiotici nella medicina quotidiana e nelle aziende agricole.

Secondo l’Istituto tedesco Robert Koch, il ceppo O104 è resistente a più di dieci antibiotici otto classi:
penicillina
streptomicina
tetraciclina
chinoloni (acido nalidixico)
trimetoprim/sulfametossazolo
tre generazioni di cefalosporine
amoxil/acido clavulanico
piperacillina/sulbactam
piperacillina/tazobactam.

La resistenza a un tale numero di farmaci indica che il ceppo O104 contiene il batterio resistente ESBL.

Secondo l'analisi dell'Istituto Koch, infatti, il ceppo contiene due geni che causano questa resistenza: TEM-1 e CTX-M-15.

Questa proprietà fa venire i brividi ai medici dagli anni '90, quando i ceppi dei batteri resistenti ESBL e Klebsiella causarono gravi infezioni nosocomiali che dilagarono in tutta Europa.

Poiché inizialmente colpivano i pazienti ricoverati nelle unità di terapia intensiva, questi ceppi non hanno suscitato molta preoccupazione nel mondo.

Ma intorno al 2001 questi fattori resistenti si sono infiltrati nella vita quotidiana e hanno causato il panico.

A causa della rilocazione genetica che il batterio ha sempre fatto, i geni della resistenza si sono spostati in alcuni ceppi di batteri E. coli, non tanto negli alimenti, creando tossine, ma diffondendosi in generale, causando infezioni del tratto urinario e altre infezioni solitamente lievi malattie.

All’improvviso, gli ospedali di Bermingham e Shropshire hanno segnalato significative epidemie di infezioni da E. coli ed ESBL, e i medici ospedalieri si sono scambiati segnalazioni di giovani donne che soffre di infezioni ricorrenti della vescica causate dai nuovi farmaci.

Questo non era un fenomeno solo negli anni 2000.

Nel marzo 2010, l'ospedale universitario del North Staffordshire ha registrato un'epidemia causata dai batteri ESBL e Klebsiella, a seguito della quale il paziente è morto.

Da dove provengono questi fattori di resistenza?

Lo sviluppo della resistenza è un processo biologico inevitabile; in questo modo il batterio è protetto dai componenti letali, sia che questi componenti siano prodotti da un altro batterio o prodotti artificialmente in un laboratorio di ricerca.

Tuttavia, l’uso eccessivo di antibiotici accelera il processo e rende i suoi risultati imprevedibili.

Questo uso eccessivo si verifica ogni volta che qualcuno assume antibiotici per malattie per le quali non è adatto, come raffreddore o infezioni alle orecchie.

Ciò accade ancora più spesso quando nel complesso agroindustriale vengono aggiunte piccole dosi di antibiotici per tonnellata di prodotto, senza alcuna osservazione e studio dei virus emergenti.

Studi condotti in Spagna e negli Stati Uniti mostrano collegamenti tra l'agrocomplesso e la comparsa del batterio ESBL: hanno identificato un batterio resistente nella carne di pollo venduta in un supermercato.

Anche se i ricercatori identificassero le verdure che potrebbero aver causato l’epidemia, non sarebbero mai in grado di dire come il batterio resistente sia entrato nei prodotti.

Nel 2006, negli Stati Uniti si è verificata un'epidemia nazionale di un'infezione intestinale del ceppo O157, i cui batteri hanno contaminato gli spinaci freschi.

E anche se il sospetto dei ricercatori è caduto sul letame del bestiame o dei maiali selvatici vicino alle fattorie, non sono riusciti a identificare le cause dell'infezione.

Ma sappiamo già perché in questa epidemia si manifesta la resistenza agli antibiotici e, data la promiscuità del batterio a spostare materiale genetico, sappiamo che il ceppo O104 è resistente perché contiene un batterio simile e può trasmetterlo ad altri tipi di infezione.

È giunto il momento che i governi e le autorità sanitarie facciano tutto ciò che è in loro potere per rallentare lo sviluppo della resistenza ai farmaci, frenare l’uso eccessivo di antibiotici nel mondo.

SOSTANZA: l'invenzione riguarda la biotecnologia e riguarda l'ottenimento di produttori di preparati probiotici - preparati batterici a base di colture vive di microrganismi simbionti utilizzati per la prevenzione e il trattamento della disbatteriosi e di altri disturbi del tratto gastrointestinale. Un plasmide non coniugativo e non mobilizzabile p Сolap è stato introdotto nel ceppo Escherichia coli M17, produttore del preparato probiotico colibacterin, che trasporta i geni per la produzione della colicina E1 e il determinante della resistenza all'ampicillina a dosi fino a 150 mg /l. Il ceppo risultante è privo di un fenotipo adesivo indesiderato inattivando il gene dell'adesina fimH pili di tipo 1 integrando il gene della resistenza alla kanamicina - neomicina npt. Il ceppo E.coli M17 fim H::Kan/p Colap è stato depositato presso il VKPM con il numero B-7448, ciò consente di realizzare un preparato probiotico con ridotta capacità di colonizzare nicchie diverse da quella intestinale, con aumentata attività antagonista e residente in corso di terapia antibiotica. Le caratteristiche introdotte nel ceppo costruito sono stabilmente preservate nella popolazione. Ciò facilita la preparazione di una preparazione standard in base al ceppo e garantisce che quando la preparazione viene assunta da un paziente senza concomitante terapia antibiotica, non si verifichi l'eliminazione del plasmide. 4 illustrazioni, 1 tab.

La presente invenzione riguarda il settore delle biotecnologie e riguarda la creazione di un ceppo migliorato di Escherichia coli, utilizzabile per ottenere probiotici, preparati batterici a base di colture vive di microrganismi simbionti. I probiotici (altri nomi di farmaci in questo gruppo: normoflora, eubiotici, microbiotici) sono uno strumento efficace per la prevenzione e il trattamento della disbatteriosi intestinale. La disbatteriosi è un cambiamento pronunciato nelle specie e nel rapporto quantitativo dei microbi, che si manifesta nel rapido sviluppo di microrganismi opportunistici, in particolare batteri del gruppo intestinale (Enterobacteriaceae), ed è accompagnato da varie manifestazioni dolorose. Una causa importante di disbatteriosi è l'uso di antibiotici e altri antimicrobici [Krasnogolovets VN "Significato clinico della disbatteriosi intestinale derivante dall'uso di antibiotici". Nel libro. "L'uso del colibacterin per la prevenzione e il trattamento delle malattie intestinali e la tecnologia della sua produzione". M., 1967, pag. 223 - 243]. Attualmente in Russia sono noti preparati di probiotici "Colibacterin" e "Bifikol", ottenuti sulla base del ceppo Escherichia coli M17, che, in sostanza, è un derivato del ceppo E. coli isolato da A. Nissle e utilizzato per ottenere il farmaco "Mutaflor" (Germania) [Peretz L.G. "Colibacterin secco. Nuovi metodi di diagnostica, cura e prevenzione delle malattie intestinali". Nel libro. "Estratti delle relazioni al Plenum del Consiglio medico accademico del Ministero della sanità della RSFSR". M., 1961, pag. 52-54]. Tuttavia, a differenza del ceppo originale, il ceppo E. coli M17 ha perso la capacità di sintetizzare la colicina B e, quindi, ha ridotto la sua attività antagonista contro i batteri del gruppo intestinale [Shemchuk L.F. "Standardizzazione dei colibatteri", Ph.D. candidato in scienze biologiche, M., 1983, p. 16]. Un altro svantaggio del ceppo E. coli M17 e del suo predecessore è la presenza di un fenotipo di fimbrie Mn di tipo 1 altamente adesivo, che è insolito e indesiderabile per un ceppo intestinale. Tale fenotipo si trova spesso in ceppi isolati dal macroorganismo nelle infezioni del tratto urinario e nella polmonite nosocomiale [Sokurenko E.V., Chesnokova V.L. "Un metodo per modificare il fenotipo adesivo degli isolati selvatici di E. coli in applicazione a ceppi - produttori del farmaco colibatterino". Bollettino di Biologia e Medicina Sperimentale, 1997, Volume 124, N 9, p. 334 - 338]. Lo svantaggio del ceppo E. coli M17 è anche la sua sensibilità agli antibiotici. Pertanto, i preparati basati su di esso non possono essere efficaci durante l'assunzione di antibiotici. Nel frattempo, l'uso simultaneo di antibiotici e probiotici può prevenire lo sviluppo della disbatteriosi e quindi aumentare l'efficacia delle misure terapeutiche e ridurre la durata del trattamento. L'obiettivo dell'invenzione è creare un ceppo di E. coli - un derivato di E. coli M17, che consenta di eliminare gli svantaggi sopra menzionati del noto ceppo di E. coli M17, vale a dire: attività antagonista ridotta, fenotipo adesivo indesiderato, sensibilità agli antibiotici. Il risultato tecnico consiste nella costruzione di un ceppo con aumentata attività antagonista, ridotta capacità di colonizzare nicchie diverse da quelle intestinali primarie nel macroorganismo e con resistenza a dosi moderate di antibiotici penicillinici. Questo obiettivo viene raggiunto utilizzando metodi genetici e di ingegneria genetica per costruire un ceppo di E. coli M17 fimH::kan/pColap, che produce colicina E1, è resistente a concentrazioni moderate di ampicillina (fino a 150 UI/ml) e contiene un gene fimH inattivato, che codifica per l'adesione fimbriale. Il ceppo E. coli M17 fimH::kan/pColap è stato depositato nella Collezione tutta russa di microrganismi industriali con il numero di registrazione B-7448. Il design brevettato del ceppo si basa sulle seguenti disposizioni. Abbiamo dimostrato per la prima volta che l'inattivazione del gene dell'adesina fimH dei pili di tipo 1 nel genoma del ceppo M17 di Escherichia coli e l'introduzione di un plasmide pColap non coniugativo e non mobilizzabile che trasporta i geni per la produzione della colicina E1 e il determinante della resistenza all'ampicillina a dosi fino a 150 mg/l nel ceppo Escherichia coli M17 consente di creare un preparato probiotico con ridotta capacità di colonizzare nicchie diverse da quella intestinale, con aumentata attività antagonista e residente in presenza di antibiotici terapia. L'essenza della soluzione brevettata di ingegneria genetica è illustrata dai disegni, dove: in Fig. 1 mostra uno schema per ottenere un ceppo ricombinante di E. coli M17fimH::kan/pColap con un difetto nel gene dell'adesina fimH del pili di tipo 1; 2 è uno schema della costruzione del plasmide ibrido pColap, FIG. 3 mostra i risultati di uno studio dell'attività adesiva del ceppo costruito di Escherichia coli M17 fimH::kan/pColap, FIG. 4 - risultati degli studi di stabilità del ceppo costruito di Escherichia coli M17 fimH::kan/pColap. Dopo aver ricevuto il ceppo E. coli M17 fimH::kan/pColap come fonte è stato utilizzato l'analogo più vicino: il ceppo E. coli M17. Per eliminare l'adesina fimbriale, che conferisce un fenotipo Mn altamente adesivo indesiderato alle cellule M17 di E. coli, è stato ottenuto un ceppo ricombinante in cui il gene di resistenza alla kanamicina-neomicina npt è stato integrato nel gene cromosomico fimH che codifica l'adesina. A questo scopo è stato utilizzato il plasmide pCH103, un derivato del plasmide R6K, che ha un sistema di replicazione pir-dipendente e può essere mantenuto solo in ceppi contenenti il ​​gene pir che ne assicura la replicazione [Sokurenko E.V., Chesnokova V.L. "Un metodo per modificare il fenotipo adesivo degli isolati selvatici di E. coli in applicazione a ceppi - produttori del farmaco colibatterino". Bollettino di Biologia e Medicina Sperimentale, 1997, Volume 124, N 9, p. 334 - 338]. Il plasmide pCH103 trasporta il gene di resistenza all'ampicillina e un frammento cromosomico contenente i geni del cluster fim, in cui l'integrità del gene fimH viene interrotta dall'inserimento del gene di resistenza alla kanamicina (neomicina) npt. Una volta trasformato in E. coli M17, non può essere mantenuto nelle cellule e possono formarsi trasformanti resistenti alla kanamicina quando è integrato nell'intero cromosoma come risultato di un singolo crossover o come risultato di un doppio crossover (Fig .1). I trasformanti della seconda classe rimangono sensibili all'ampicillina. Tra questi, è stato selezionato un ceppo denominato E. coli M17fimH::kan (o M17 fimH::npt). Lo studio condotto ha confermato l'assenza di adesione mannosio-sensibile nel ceppo ottenuto; FimH - fenotipo. Per aumentare l'attività antagonista del ceppo di E. coli M17 e renderlo resistente all'ampicillina basata sul plasmide ColE1 mediante metodi noti ["Metodi di genetica molecolare e ingegneria genetica", 1990, Novosibirsk, "Nauka", ramo siberiano, p. 7-10, 39-44] è stato costruito un plasmide ibrido pColap (FIG. 1). Il plasmide originale ColE1, isolato da un ceppo di E. coli non patogeno, è stato studiato in dettaglio. Ha una gamma piuttosto ristretta di ospiti (principalmente ceppi di Escherichia coli) ed è mantenuto stabilmente nelle cellule batteriche. Si conosce la sua sequenza nucleotidica completa, le funzioni di tutti i suoi elementi genetici e la regolazione della loro attività. Il plasmide determina la sintesi della colicina E1, che ha un effetto dannoso sulle cellule dei batteri correlati. Lo svantaggio del plasmide ColE1 è la sua capacità di mobilitarsi in altre cellule utilizzando plasmidi coniugativi, dovuta alla presenza della regione mob nella sua struttura. Utilizzando l'endonucleasi di restrizione BspLu11.1, questa regione è stata completamente rimossa e, allo stesso tempo, altri elementi genetici del plasmide non sono stati praticamente influenzati. Quindi, utilizzando l'endonucleasi di restrizione BspH1, un frammento contenente il gene b1a che codifica per la sintesi delle lattamasi è stato eliminato dal noto vettore pUC19 e legato con un frammento del plasmide ColE1 privo della regione mob. Il risultato è stato il plasmide pColap. Questo plasmide non è coniugativo e non mobilizzabile e quindi praticamente non può essere trasferito alle cellule di altri batteri. A differenza del vettore pUC19 e di altri plasmidi, pColap fornisce solo un livello moderato di resistenza all'ampicillina ai ceppi di E. coli che ha trasformato (Tabella 1). Un tale deterioramento nell'espressione del gene - lattamasi è osservato a causa di violazioni nella regione del promotore del gene (Gilbert box) e 5" - il sito che aumenta l'efficienza dell'espressione, che si è verificato a seguito di manipolazioni genetiche durante il costruzione del plasmide ricombinante pColap La sensibilità dei ceppi portatori di pColap a concentrazioni elevate Pertanto, se per qualche motivo la presenza di ceppi contenenti questo plasmide nell'intestino di un paziente diventa indesiderabile, o se, a seguito di qualche evento eccezionale, il Il plasmide viene trasferito ad un altro ceppo, quindi tutte le cellule che lo contengono possono essere eliminate. Il ceppo di E. coli M17 fimH::kan è stato trasformato con il plasmide pColap per produrre il ceppo di E. coli M17 fimH::kan/pColap. 1,5 - 2 micron di lunghezza. Segni culturali e fisiologici. Agar carne-peptone e brodo di agar Hotinger. Dopo 36 ore di crescita a 37°C si formano colonie rotonde biancastre traslucide con un diametro di 1,5 - 2,5 mm, la superficie delle colonie è liscia, i bordi sono regolari, la struttura è omogenea, la consistenza è pastosa, facilmente emulsionabile. Terreno minimo agarizzato M9 con glucosio (0,2%). Dopo 40 ore di crescita forma colonie di 1-2 mm di diametro, grigio-biancastre, traslucide, rotonde, convesse, con bordi lisci. Brodo di carne e peptone e brodo di Hotinger. Dopo 18-24 ore di crescita a 37°C si presenta una forte torbidità uniforme, un piccolo precipitato, un odore caratteristico. Terreno minimo liquido M9 con glucosio (0,2%). Dopo 20-24 ore di crescita con aerazione si osserva una forte torbidità uniforme, l'odore è debole o assente. Crescita mediante iniezione in agar carne-peptone. Buona crescita durante tutta l'iniezione. Il microrganismo è un anaerobio facoltativo. Relazione con la temperatura e il pH dell'ambiente. Cresce bene a temperature comprese tra 30 e 42 o C e ad un pH compreso tra 6,8 e 7,2. proprietà biochimiche. Assorbe bene glucosio, saccarosio, lattosio, fruttosio, mannosio, xilosio, mannitolo e sorbitolo con formazione di acido e gas. Ramnosio, galattosio e arabinosio - con debole formazione di acido; salicina - con formazione ritardata di acido e gas; raffinosio - solo con formazione di acido. L'inositolo non viene assorbito. L'idrogeno solforato non si forma; produce indolo. atteggiamento nei confronti degli antibiotici. Resistente all'ampicillina a concentrazioni nel mezzo fino a 150 mg/L. produzione di batteriocine. Produce la colicina E1. Contenuto di plasmidi. Le cellule contengono un plasmide multicopia non coniugativo e non mobilizzabile pColap (5239 bp), che determina la resistenza all'ampicillina e la sintesi della colicina E1. Il ceppo ha una formula antigenica O2:L1:H6 ed è agglutinato dal siero con un titolo sierico di almeno 1:64000. L'invenzione è illustrata da esempi che caratterizzano la resistenza all'ampicillina di ceppi che trasportano vari plasmidi, la stabilità dei loro tratti durante la coltivazione. Esempio 1. Studio della crescita del ceppo di E. coli M17 e dei suoi derivati ​​contenenti plasmidi su terreni con diverse concentrazioni di ampicillina (Tabella 1). I ceppi studiati di Escherichia coli (tabella 1) sono stati coltivati ​​per 18 ore in brodo Luria (LB - 10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito, 5 g di NaCl per 1 litro di acqua distillata) a 37 o C con aerazione. Successivamente sono state preparate diluizioni seriali di colture batteriche fino a 10 -7 in soluzione salina e ciascuna coltura è stata seminata su piastre con LA (LB + 1,6% agar) contenente ampicillina alle seguenti concentrazioni (μg/ml): 5, 50, 75, 100 , 125, 150, 200, 250. La crescita delle colonie è stata valutata dopo 18-24 ore. I risultati sono presentati nella tabella 1. Come si può vedere dalla tabella 1, il ceppo originale di Escherichia coli M17 è altamente sensibile all'ampicillina. Il plasmide pUC19 contenuto nel ceppo M17/pUC19, che è stato la fonte del gene della lattamasi per il plasmide pColap da noi costruito, rende la cellula batterica resistente a concentrazioni di ampicillina fino a 2 g/l. Allo stesso tempo, il plasmide pColap contenuto nel ceppo M17 fimH::kan/pColap fornisce resistenza a concentrazioni di ampicillina non superiori a 150 mg/l. Pertanto, i ceppi risultanti hanno un livello moderato di resistenza all’ampicillina. Esempio 2. Studio delle proprietà adesive e determinazione del fenotipo adesivo del ceppo E. coli M17 e suoi derivati. Il fenotipo adesivo è stato determinato mediante il metodo standard dello "studio della crescita". Da una coltura fresca dei ceppi batterici studiati con una densità ottica di 1,0 ad una lunghezza d'onda di 540 nm è stata preparata una sospensione di cellule batteriche in soluzione salina fisiologica. Parallelamente, sono state preparate piastre per microtitolazione con pozzetti a fondo piatto con substrati immobilizzati nei pozzetti per l'adesione, vale a dire: MN (mannano di lievito), PH (RNasi B bovina) e BSA (albumina sierica bovina). Successivamente la sospensione batterica è stata posta nei pozzetti e incubata per 40 minuti. Le cellule batteriche non legate sono state lavate accuratamente con soluzione salina. Ai pozzetti è stato aggiunto un mezzo nutriente ricco e incubati con agitazione costante a 37 oC per 2,5 - 3 ore fino alla comparsa di torbidità nei pozzetti. La densità ottica in ciascun pozzetto è stata letta su un lettore automatico di micropiastre (Molecular Devices, Inc., Menlo Park, California, USA). In questo esperimento sono stati studiati i seguenti ceppi di E. coli: M17 - il ceppo originale; M17 fimH::kan - ceppo M17 con gene dell'adesina fimH inattivato: M17 fimH: : kan/pPKL91 - ceppo fimH::kan trasformato con il plasmide pPKL91 contenente il gene regolatore fimB, comprendente l'espressione dei pili di tipo 1 da parte di una cellula batterica; ceppo M17fimH::kan/pColap - Ceppo M17 fimH::kan trasformato con il plasmide pColap da noi costruito, portante determinanti della resistenza all'ampicillina e della produzione di colicina E1. I risultati dello studio dell'attività adesiva di ceppi di E. coli M17 e derivati ​​del ceppo di E. coli M17, valutati utilizzando il metodo degli "studi di crescita", sono presentati nelle Figg. 3 (in ordinata sono riportati i valori di densità ottica alla lunghezza d'onda di 540 nm; in ascissa sono riportati i ceppi di E. coli studiati: 1 - M17; 2 - M17 fimH::kan, 3 - M17fimH::kan/pPKL91, 4 - M17 fimH ::kan/pColap). Come si può vedere dalla figura. 3, il ceppo M17 originale di E. coli si lega bene sia alla RNasi B che al mannano, indicando un fenotipo adesivo MH indesiderabile per il ceppo intestinale di E. coli. Il ceppo ricombinante M17 fimH::kan da noi ottenuto presenta attività adesiva pari a zero sia da solo che dopo l'introduzione di un plasmide in esso, inclusa l'espressione dei pili di tipo 1. L'attività adesiva pari a zero viene mantenuta in questo ceppo anche dopo l'introduzione del plasmide pColap (ceppo M17 fimH::kan/pColap). Esempio 3. Studio della stabilità dei tratti del ceppo di Escherichia coli M17 fimH::kan/pColap determinati dal plasmide pColap. Il plasmide pColap da noi costruito garantisce la produzione di colicina E1 e la resistenza all'ampicillina. La conservazione di queste caratteristiche dipende dalla stabilità del mantenimento del plasmide nelle cellule batteriche: la perdita del plasmide è accompagnata dalla perdita delle caratteristiche corrispondenti. La stabilità nel mantenimento della resistenza all'ampicillina e della colicinogenicità dei ceppi ottenuti è stata determinata quando sono stati coltivati ​​in un mezzo nutriente liquido in assenza di un agente selettivo per 100 generazioni. Il plasmide ColE1 originale è stato utilizzato come controllo positivo e il plasmide pBR322, un derivato di ColE1 che non contiene il cer locus, che influisce sulla stabilità dei plasmidi, è stato utilizzato come controllo negativo. Le colture dei ceppi M17 fimH::kan/pColap, M17/ColE1 e M17/pBR322 sono state coltivate per 18 ore con aerazione potenziata a 37 oC in LB con ampicillina (100 μg/ml). Il ceppo M17/ColE1 è stato coltivato nelle stesse condizioni ma senza ampicillina. Le colture risultanti contenevano circa 10° di cellule batteriche per ml. Quindi, 10 μl (10 6) della coltura batterica corrispondente sono stati aggiunti a provette con 10 ml di LB (senza aggiunta di antibiotico). La sospensione risultante è stata coltivata come descritto sopra. Con tale coltivazione, le cellule batteriche hanno avuto il tempo di compiere 10 divisioni. Ripetendo questa operazione 10 volte, abbiamo ottenuto una coltura batterica che aveva attraversato 100 generazioni dalla prima inoculazione nel terreno senza agente selettivo. Campioni di colture batteriche sono stati prelevati prima di ogni inoculazione e testati per le proprietà di resistenza all'ampicillina e la produzione di colicina. Per questo, le sospensioni cellulari sono state piastrate su piastre LA fino all'ottenimento di singole colonie. Successivamente, è stata testata la capacità di crescere sullo stesso terreno in presenza di ampicillina (100 μg/ml) di 100 colonie di ciascun ceppo. Inoltre, è stata testata la capacità delle colonie di produrre colicina E1. A tale scopo è stato utilizzato un test con l'applicazione dell'agar superiore (Miller J. "Experiments in molecolare genetics", M., "Mir", 1976, pp. 183-189). Il test è il seguente: su piastre con un terreno nutritivo solido contenente l'1,6% di agar, le colonie in esame vengono forate con un replicatore o uno stuzzicadenti. Le piastre vengono incubate a 37°C per 3-4 ore, la produzione di colicina viene indotta mediante irradiazione ultravioletta per 4-5 secondi e incubate nelle stesse condizioni durante la notte. Le cellule vengono quindi lisate con vapore di cloroformio a temperatura ambiente per 30–40 minuti. È importante assicurarsi che nella fase successiva tutto il cloroformio sia evaporato dalla tazza. Adagiare sullo strato inferiore dell'agar 3 - 5 ml di agar semiliquido (0,7%) contenente 10 7 / ml di cellule batteriche del ceppo test di E. coli (sensibile alla colicina E1). Incubare per una notte a 37°C. Registrare la presenza di zone di illuminazione nello strato di coltura di prova attorno alle macchie dei ceppi studiati. I risultati di stabilità del ceppo di Escherichia coli costruito M17/pColap sono mostrati in FIG. 2 (ColE1 corrisponde al ceppo M17/ColE1, pBR322 al ceppo M17/pBR322, pColap al ceppo M17/pColap). La presenza del plasmide nella cellula batterica deriva dalla preservazione delle sue proprietà originarie (colicinogenicità e/o resistenza all'ampicillina). I risultati dell'esperimento (Fig. 2) indicano che il plasmide pBR322 privato del cer locus viene rapidamente eliminato dalla popolazione batterica quando coltivato in un terreno privo di antibiotici, mentre gli altri due plasmidi (ColE1 originale e pColap ricombinante) sono ereditati stabilmente dalle cellule in queste condizioni. Questa proprietà è uno degli importanti vantaggi del nostro progetto, poiché, da un lato, facilita la preparazione di un preparato standard basato su un ceppo contenente pColap e, dall'altro, garantisce che non avvenga l'eliminazione del plasmide quando il farmaco viene assunto da un paziente senza concomitante terapia antibiotica. Applicabilità industriale. La descrizione sopra riportata del metodo per costruire il ceppo brevettato di Escherichia coli M17 rimH::kan/pColap è sufficiente per ottenere nuovamente il ceppo utilizzando tecniche, reagenti e apparecchiature standard utilizzati nella ricerca di ingegneria genetica.

Reclamo

Ceppo batterico Escherichia coli M 17 fim H::kan/p Colap VKPM B-7448 utilizzato per ottenere un preparato probiotico.

Brevetti simili:

L'invenzione riguarda la biotecnologia, in particolare l'ingegneria genetica e la medicina, in particolare la virologia medica e l'immunologia, e può essere utilizzata per l'immunodiagnostica della febbre emorragica di Marburg, nonché per ottenere anticorpi specifici contro il virus di Marburg e vaccini geneticamente modificati contro la febbre di Marburg virus

I microbiologi distinguono circa un centinaio di ceppi di Escherichia coli. Alcuni di essi non sono patogeni, cioè quelli che non causano lo sviluppo di una malattia infettiva. Inoltre, tali batteri sono una componente essenziale della normale microflora intestinale. Ma esistono anche ceppi patogeni, chiamati anche diarroici. Si tratta di ceppi di Escherichia coli che possono causare infezioni intestinali e in alcuni casi generalizzate.

Escherichia coli patogeno

Escherichia coli (Escherichia coli) - batteri appartenenti al genere Escherichia e alla famiglia delle Enterobacteriaceae. Questi microrganismi sono altamente resistenti, sono in grado di vivere per mesi nell'acqua, nel suolo, nelle feci. Gli E. coli possono anche essere conservati per lungo tempo e persino moltiplicarsi nei prodotti alimentari, in particolare latticini e carne.

Gli Escherichia coli patogeni (diarroici), a seconda delle loro proprietà, sono generalmente suddivisi in cinque categorie principali:

1. Enterotossigenico (ETCP);
2. Enteroinvasivo (EICP);
3. Enteropatogeno (EPKP);
4. Enteroemorragico (EHEC);
5. Enteroaggregativo (EAggKP).

Ciascuno di questi gruppi di Escherichia coli ha le sue caratteristiche. COSÌ, bacilli enterotossigeni provocare un'infezione intestinale simile al colera nei bambini e negli adulti, poiché questi batteri producono una tossina simile al colera.

Escherichia coli enteroinvasiva provocare lo sviluppo di infezioni intestinali nei bambini e negli adulti. UN bastoncini enteropatogeni a differenza dei ceppi precedenti, colpiscono soprattutto i bambini e provocano loro lo sviluppo di coli-enterite.

L'Escherichia coli enteropatogeno causa lo sviluppo di enterocolite emorragica e enteroaggregativo - porta a infezioni intestinali principalmente in individui debilitati.

Cause

L'E. coli diarroico porta allo sviluppo di una malattia infettiva chiamata escherichiosi (infezione da coli intestinale) . Questa infezione è caratterizzata da sintomi di intossicazione e danni agli organi del tratto gastrointestinale.

La fonte dell'infezione sono i pazienti con escherichiosi, in misura minore - portatori di batteri. Il meccanismo di trasmissione è fecale-orale. Una persona può contrarre l'infezione da coli mangiando cibo contaminato (latticini e prodotti a base di carne, verdure), acqua, attraverso le mani sporche e oggetti per la cura, giocattoli.

Sintomi di escherichiosi

L'eserechiosi è accompagnata da sintomi di lesioni del tratto gastrointestinale. Tuttavia, le caratteristiche del quadro clinico dipendono dal ceppo da cui la persona è infettata.

Quindi, l'escherichiosi causata dai bacilli enterotossigeni si manifesta con danni principalmente all'intestino tenue, mentre l'intossicazione è lieve. La malattia si manifesta in modo acuto con un'improvvisa comparsa di debolezza, debolezza. La temperatura può essere leggermente elevata o addirittura normale. Nell'addome (principalmente nell'epigastrio) compaiono quelli versati. Pancia, determinata dal rimbombo.

Per diagnosticare le malattie degli organi del sistema genito-urinario, è necessario produrre. Tuttavia, la presenza di E. coli nelle urine non sempre indica la presenza della malattia. I batteri trovati in piccole quantità possono significare che la donna non ha eseguito le procedure igieniche adeguate prima di eseguire il test. Tuttavia, se nell'analisi delle urine in presenza di sintomi della malattia vengono rilevati almeno 10 2 -10 4 Escherichia coli, ciò indica a favore del processo infiammatorio che si verifica nei reni o nella vescica.

L'E. coli è un microrganismo abbastanza comune che causa numerosi problemi al tratto digestivo, al sistema urinario e riproduttivo negli esseri umani, che ha la capacità di essere presente sulla pelle e sulle mucose di vari sistemi corporei come variante della norma.

L'E. coli (Escherichia coli o E. coli) è un batterio Gram-negativo (non si colora negli strisci colorati con Gram), appartenente alla famiglia degli Enterobatteri, a forma di bastoncino, essendo un anaerobio facoltativo (cioè si sviluppa principalmente senza la presenza di ossigeno, ma in determinate condizioni anche l'ingresso di ossigeno non perde la sua vitalità). L'E. coli fu scoperto nel 1885 dal batteriologo tedesco Theodor Escherich. I bastoncini hanno estremità arrotondate, la dimensione va da 0,4 a 3 micron. Alcuni ceppi sono mobili a causa della presenza di flagelli, mentre altri sono immobili.

La temperatura ottimale di crescita per l'Escherichia coli è di 37°. E. coli è abbastanza stabile nell'ambiente esterno, in mezzi come l'acqua, il suolo e le feci rimane vitale per lungo tempo. Hanno la capacità di moltiplicarsi nei prodotti alimentari (ad esempio il latte). Quando viene bollito, muore quasi immediatamente, a una temperatura di 60º per 15 minuti, i disinfettanti (soluzioni di cloramina, formalina, ecc.) Hanno un effetto dannoso su E. coli per un breve periodo.

Esistono numerosi ceppi (varietà) di Escherichia coli, la maggior parte dei quali sono innocui e in condizioni normali si trovano sulle mucose del tratto digestivo e principalmente nelle sue sezioni inferiori.

L'escherichia coli è normale

In condizioni normali, l'E. coli colonizza l'intestino umano (i suoi ceppi sicuri), la quantità media varia da 10 6 a 10 8 CFU / g di contenuto dell'intestino distale (CFU - unità formante colonie). Il contenuto di E.coli nell'altra microflora intestinale non è superiore all'1%. In condizioni normali, l'Escherichia coli partecipa al normale funzionamento dell'intestino, sintetizza le vitamine K, B1, B2, B3, B5, B6, B9, B12. Una funzione molto importante è l'interazione competitiva con la flora intestinale opportunistica (limitando la riproduzione di microrganismi opportunisti).

Il ceppo non patogeno Nissle 1917 (Mutaflor) viene utilizzato a scopo terapeutico nei bambini come probiotico nella disbatteriosi intestinale. Nell'intestino sono più utili i cosiddetti E. coli lattosio positivi, il contenuto di quelli lattosio negativi non deve superare le 10 5 CFU / g e l'E. coli emolitico deve essere completamente assente.

La composizione qualitativa e quantitativa di E. coli nell'intestino crasso in persone sane di diverse età, sia nei bambini di età inferiore a un anno che in quelli di età superiore ai 60 anni, non differisce. Per l'E. coli tipico è di 10 7 -10 8 CFU/g feci, E. coli lattosio-negativi< 10 5 , гемолитические кишечные палочки в норме отсутствуют. Состав остальной флоры кишечника отличается по возрастам по другим параметрам.

Vengono chiamate deviazioni nel contenuto di ceppi non patogeni di Escherichia coli nell'intestino dysbacteriosis e hanno più livelli.

Gradi di disturbi microbiologici di E. coli nella disbatteriosi intestinale

1° grado di disturbi microbiologici: Escherichia tipica fino a 10 6 -10 5 CFU / g, è possibile aumentare il contenuto di Escherichia tipica fino a 10 9 - 10 10 CFU / g
2° grado di disturbi microbiologici: aumento del contenuto di Escherichia emolitica ad una concentrazione di 10 5 -10 7 CFU/g
3° grado di disturbi microbiologici: rilevazione di E. coli in associazione con altri microrganismi opportunisti ad una concentrazione di 10 6 -10 7 CFU/g e superiore

Escherichia coli patogeno

Esistono più di 100 ceppi di E. coli patogeni, raggruppati in 4 classi:
- E. Coli enteropatogeno (ETEC);
- E. coli enterotossigenico;
- E. coli enteroinvasivo (EIEC);
- E. coli enteroemorragico (EHEC).

Morfologicamente non sono diversi. Una caratteristica dei ceppi patogeni è la capacità di produrre enterotossine (termostabili o resistenti alle alte temperature e termolabili o in rapida decomposizione) quando entrano nel corpo umano, a causa delle quali si verifica la diarrea. Ad esempio, E. coli O157:H7, che produce tossine simili. Inoltre, ogni gruppo ha le proprie caratteristiche dei sintomi della malattia.

Danni da Escherichia coli al tratto gastrointestinale

Escherichiosi- malattie derivanti dall'ingestione di ceppi patogeni di Escherichia coli, caratterizzate da intossicazione e danni principalmente al tratto gastrointestinale, ma talvolta colpiscono il sistema urinario, le vie biliari e altri organi con possibilità di sepsi in alcuni pazienti.

Il meccanismo di infezione è alimentare, per via oro-fecale. I fattori di trasmissione sono acqua e cibo contaminati. Si ammalano soprattutto i bambini piccoli.

Il periodo di incubazione (dal momento dell'infezione alla comparsa del quadro clinico) varia molto spesso da 48 a 72 ore (meno spesso viene ridotto a 1 giorno o esteso a 10 giorni).

Escherichiosi causata da Escherichia coli enteropatogeno: sono colpiti più spesso i neonati e i bambini del primo anno di vita. Causano diarrea negli ospedali di maternità. Nei pazienti giovani, vomito o rigurgito, frequenti feci molli senza impurità patologiche (sangue), forti dolori addominali, ansia infantile, rifiuto di mangiare, sonno disturbato.

Escherichiosi causata da Escherichia coli enterotossigenico: Questi ceppi hanno la capacità di attaccarsi alle cellule dell'epitelio intestinale, compromettendone significativamente la funzione e provocando una grave diarrea acquosa. Si manifesta spesso anche nei bambini, negli adulti e con la cosiddetta "diarrea del viaggiatore". I pazienti hanno feci acquose, assenza di sangue, voglia di vomitare, dolore all'addome.

Escherichiosi causata da Escherichia coli enteroemorragico: provoca colite emorragica, nei casi gravi, manifestazioni di sindrome emolitico-uremica (SEU). A colite emorragica i pazienti presentano febbre alta fino a 39-39,5º, sintomi di intossicazione, dolore crampiforme (o spastico) all'addome, nonché comparsa di feci acquose miste a sangue. Le complicanze possono essere lo sviluppo di anemia emolitica, insufficienza renale acuta e sindrome emorragica.
Sindrome emolitica uremica (SEU)- una sindrome specifica, caratterizzata da una triade di sintomi: anemia emolitica, insufficienza renale acuta e calo critico della conta piastrinica. Si verifica più spesso nella fascia di età dei bambini da 6 mesi a 4 anni, così come nei pazienti anziani. Nel 90% dei casi si manifesta con infezioni intestinali (E. coli produttore di verotossina, Shigelle e altre). Il motivo è il danno alle cellule endoteliali vascolari. Si verifica in media una settimana dopo l'infezione. Clinicamente possono comparire ittero color limone, violazione del deflusso di urina, gonfiore, emorragie sulla pelle e altre manifestazioni gravi. Tuttavia, con la comparsa di questi sintomi, possiamo parlare di un quadro clinico dettagliato della SEU. I suoi primi segni sono di laboratorio: la comparsa di proteine ​​nelle urine - proteinuria, la comparsa di globuli rossi nelle urine - eritrocituria, un aumento della creatinina sierica, nonché una diminuzione dei globuli rossi e dell'emoglobina nel sangue.

Escherichiosi causata da Escherichia coli enteroinvasivo: secondo le proprietà biochimiche, gli E.coli enteroinvasivi sono simili alla shigella - gli agenti causali della dissenteria, in particolare, hanno la capacità di penetrare nelle cellule dell'epitelio di una certa sezione dell'intestino (colon) e di moltiplicarsi lì. Ciò spiega la comparsa di alcuni sintomi di tale escherichiosi: dolore nella regione iliaca sinistra (addome inferiore sinistro), feci abbondanti e acquose miste a sangue. A differenza della dissenteria, più spesso si tratta ancora di feci acquose e non povere di muco e sangue (come nella shigellosi).
Riassumendo quanto sopra, è chiaro che non esiste un unico quadro specifico di escherichiosi, i reclami dei pazienti possono essere diversi: temperatura, vomito, feci acquose senza impurità e con sangue, dolore all'addome di diversa localizzazione di natura dolorosa.

Infezione da E. coli delle vie urinarie

Il meccanismo dell'infezione è più spesso associato all'assunzione diretta di E. coli dall'intestino crasso in caso di inosservanza o di igiene personale insufficiente, nonché quando si utilizzano metodi non tradizionali di contatto sessuale (uso del sesso anale).

Fino all'80-85% delle infezioni del tratto urinario sono associate a E. coli. Più del 60% dei processi acuti nell'infiammazione della prostata è associato a questo agente patogeno. La stragrande maggioranza delle prostatiti croniche è associata all’Escherichia coli.

Le forme cliniche delle lesioni del sistema urinario sono diverse. Può essere uretrite, cistite, pielonefrite, prostatite.

Danni al sistema riproduttivo da Escherichia coli

La maggior parte dei processi infiammatori nell'epididimo (epididimite), l'infiammazione dei testicoli (orchite), così come la loro lesione combinata, l'infiammazione delle ovaie (annessite) è associata proprio all'E. coli.

Diagnosi delle infezioni causate da Escherichia coli

1) Metodo batteriologico- inoculazione di materiale biologico su speciali terreni nutritivi. Il materiale viene utilizzato per le infezioni intestinali - feci e vomito, per le infezioni del sistema urinario - urina, per le infezioni del sistema riproduttivo - strisci e raschiature dalle mucose degli organi genitali. Dopo l'identificazione dell'agente causale, viene eseguito un antibiogramma (determinazione della sensibilità agli antibiotici).
Quando il contenuto di Escherichia coli nelle feci viene deviato, si verifica un certo grado di disturbi microbiologici (disbatteriosi) o vengono rilevati ceppi patogeni di Escherichia coli. La presenza di E. coli nelle urine è chiamata batteriuria. In assenza di sintomi, la diagnosi viene posta quando i microrganismi compaiono in una quantità di 10 5 o più CFU / ml di urina. Se il loro numero è inferiore, questo è considerato un segno di contaminazione (contaminazione delle urine durante il campionamento). Se i sintomi della malattia sono chiaramente espressi, sono sufficienti 10 2 -10 4 CFU / ml di urina.

2) Metodi generali di ricerca clinica(coprogramma, analisi generale delle urine, del sangue, analisi del sangue biochimiche e altri) sono aggiuntivi.
3) Metodi di ricerca strumentale(sigmoidoscopia, urografia, ecografia e altri).

Principi generali per il trattamento delle infezioni causate da Escherichia coli

1. Misure organizzative e di regime (ospedalizzazione secondo indicazioni cliniche), regime dietetico in base alla sconfitta di determinati sistemi corporei (tabella n. 4 con danno intestinale, tabella n. 7 con danno al sistema genito-urinario).

2. La terapia farmacologica comprende la terapia etiotropica (antibiotici, batteriofagi), la terapia patogenetica (spesso infusione), la terapia post-sindromica.

Terapia antibatterica deve essere effettuata tenendo conto dell'antibiogramma dell'Escherichia coli isolato. La sensibilità dell'Escherichia coli ai farmaci del gruppo dei fluorochinoloni (ciprofloxacina, levofloxacina), amoxicillina, nitrofurani e altri viene rilevata più spesso. E il farmaco stesso, la sua dose e la durata del trattamento sono prescritti solo da un medico. L'automedicazione per prevenire lo sviluppo della resistenza agli antibiotici di E. coli è inaccettabile!

Inoltre, i batteriofagi sono abbastanza efficaci contro l'E. coli (usato per il danno intestinale): si tratta di un batteriofago liquido, un batteriofago intestinale, un batteriofago coliproteico, un piobatteriofago liquido combinato, un piobatteriofago liquido combinato polivalente e altri.

Ceppi di Escherichia coli appositamente ottenuti fanno parte di alcuni farmaci utilizzati per la disbatteriosi con mancanza di E. coli nell'intestino (helac forte, bifikol, colibacterin). Inoltre, con la disbatteriosi con crescita eccessiva di Escherichia coli, vengono prescritti probiotici (linnex, acipol, acilact, lactobacterin, bifiform, bifistim e altri).

Terapia patogenetica si riduce alla terapia per infusione - l'introduzione nel flusso sanguigno di varie soluzioni di un certo volume e concentrazione al fine di disintossicare e reintegrare le perdite di liquidi in caso di danno al tratto gastrointestinale, nonché disintossicare il corpo in caso di danno renale .

Terapia posindromicaè prescritto da un medico individualmente, a seconda della sindrome principale della malattia.

Caratteristiche del trattamento di bambini e donne incinte: in questi gruppi di pazienti, i regimi di trattamento iniziano con l'uso di biacteriofagi e probiotici e, solo se questi farmaci sono inefficaci, vengono prescritti farmaci antibatterici, tenendo conto dell'età e del grado di danno.

Prevenzione delle infezioni causate da Escherichia coli

In primo luogo nella prevenzione c'è l'osservanza dell'igiene personale e le regole del trattamento termico e della conservazione degli alimenti, del lavaggio di frutta e verdura, nonché di evitare il consumo di acqua da fonti sconosciute.

Specialista in malattie infettive Bykova N.I.