L'utilizzo del test combibest nella diagnosi dell'hiv. Metodi moderni per diagnosticare l'infezione da HIV Il più interessante dei test immunoenzimatici è l'ELISA per l'HIV

I titolari del brevetto RU 2283497:

L'invenzione riguarda il campo della biotecnologia e della medicina. Il sistema di test ELISA per l'identificazione dello spettro degli anticorpi del virus dell'immunodeficienza umana (HIV) del primo e del secondo tipo, del primo tipo del gruppo O e il rilevamento dell'antigene del virus dell'immunodeficienza umana del primo tipo p24 comprende un immunoassorbente basato su antigeni del virus dell'immunodeficienza umana che rappresentano gp41 (env HIV-1 e HIV-2 gruppo O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), anticorpi contro l'antigene HIV 1 p24, e reagenti di rilevamento, mentre i suddetti antigeni dell'HIV e anticorpi dell'HIV vengono assorbiti in diversi pozzetti di piastre per il test immunoenzimatico, e per l'assorbimento vengono utilizzate piastre pieghevoli o non pieghevoli di polistirene da 96 pozzetti. L'invenzione prevede una maggiore sensibilità, semplificazione, esclusione della soggettività della valutazione dei risultati. 1 z.p. f-ly, 10 tab., 1 ill.

L'invenzione riguarda il campo della biotecnologia e della medicina. Utilizzo: rilevamento differenziato di tutte le classi di anticorpi specifici contro le proteine ​​del virus dell'immunodeficienza umana 1 e 2, HIV 1 gruppo O e antigene HIV 1 p24.

Essenza: ottenere un sistema di test immunoenzimatico per identificare lo spettro di anticorpi di tutte le classi contro singole proteine ​​e HIV 1 e 2, HIV 1 gruppo O e HIV 1 antigene p24 nel siero del sangue (plasma), immunoglobuline ed emoderivati ​​al fine di identificare lo spettro degli anticorpi anti-HIV 1 e 2, HIV 1 gruppo O, rilevamento dell'antigene HIV 1 p24 e conferma di risultati di screening positivi o indeterminati per gli anticorpi anti-HIV 1 e 2, HIV 1 gruppo O e antigene HIV 1 p24.

DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE

La diagnosi di laboratorio dell'infezione da HIV si basa su tre aree: a) indicazione dell'HIV e dei suoi componenti; b) rilevazione di anticorpi contro l'HIV; c) determinazione dei cambiamenti nel sistema immunitario. Tra i metodi esistenti di diagnostica di laboratorio, i più comuni sono i metodi sierologici: il rilevamento di anticorpi contro gli antigeni virali.

Per rilevare gli anticorpi nell'infezione da HIV vengono utilizzati principalmente il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) e l'immunoblotting (IB). L'ELISA si basa sull'immobilizzazione degli antigeni virali su piastre, che legano gli anticorpi del paziente, e il complesso antigene-anticorpo viene rilevato utilizzando anticorpi monoclonali di topo coniugati con perossidasi di rafano contro le immunoglobuline umane G e M. Il metodo è abbastanza specifico e sensibile e consente di rilevare anticorpi specifici del virus nel 95% dei pazienti. Il restante 5% dei casi si verifica nelle fasi iniziali dell'infezione, quando nel siero del sangue sono ancora presenti pochi anticorpi, oppure nelle fasi terminali della malattia, quando l'organismo non è più in grado di sintetizzare anticorpi a causa di una forte deplezione di anticorpi. il sistema immunitario. Sono possibili anche risultati ELISA falsi positivi, soprattutto in pazienti con malattie autoimmuni e oncologiche, nonché in infezioni causate dal virus Eshptein-Barr. In questo caso si verifica una reazione crociata di anticorpi contro il fattore reumatoide, il virus Epstein-Barr o verso determinanti antigenici simili alle proteine ​​del complesso maggiore di istocompatibilità di classe 1 e 2 (HLA-4 e DQW3) e aventi la capacità di legarsi a Antigeni dell'HIV. Risultati falsi positivi si osservano spesso nelle donne incinte e negli anziani. Anche emolisi, lipemia, contaminazione batterica dei sieri possono essere causa di risultati inaffidabili.

A questo proposito, sono stati proposti e vengono utilizzati numerosi metodi per testare la specificità dei risultati del rilevamento degli anticorpi. Di questi metodi, la reazione più comunemente utilizzata è l'"immune blot" nella modifica del "Western Blot". L'essenza del metodo è la seguente: nella prima fase, le proteine ​​dell'HIV vengono separate in base al peso molecolare mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide. Segue il trasferimento elettroforetico dal gel di poliacrilammide alla superficie della membrana di nitrocellulosa. Gli antigeni così trasferiti vengono rilevati sulla membrana mediante analisi indiretta: la membrana viene incubata con il materiale da testare; gli anticorpi contenuti si legano agli antigeni dell'HIV trasferiti su una membrana di nitrocellulosa, quindi le strisce di membrana vengono incubate con il coniugato; quando si forma un complesso antigene-anticorpo, il coniugato si attacca ad esso, dopo il lavaggio dal coniugato e l'incubazione con il substrato, avviene la colorazione di quelle sezioni di nitrocellulosa dove avviene la formazione del complesso antigene-anticorpo-coniugato. Il disegno mostra esempi di risultati immunoblot positivi, debolmente positivi e negativi.

Nel siero di persone infette da HIV-1 e HIV-2 si trovano anticorpi contro le seguenti proteine ​​(p) e glicoproteine ​​(gp): Tabella A.

La tabella B presenta i criteri per valutare i risultati dell'immunoblotting raccomandati dall'OMS e dal Centro russo per la prevenzione e il controllo dell'AIDS.

In base ai criteri dell'OMS, sono considerati positivi i sieri in cui vengono rilevati anticorpi contro due qualsiasi proteine ​​dell'involucro dell'HIV-1 mediante il metodo IB. Se si verifica una reazione con una sola delle proteine ​​dell'involucro (gp160, gp120, gp41), in combinazione con una reazione con altre proteine ​​o senza di essa, il risultato è considerato dubbio. Secondo il Centro scientifico e metodologico federale del Ministero della sanità della Federazione Russa per la prevenzione e il controllo dell'AIDS, i sieri possono essere interpretati come positivi anche in presenza di anticorpi contro una sola proteina del rivestimento.

Il rilevamento di anticorpi contro l'antigene p24 può indicare il periodo di inizio della sieroconversione, poiché gli anticorpi contro questa proteina compaiono per primi. Reazioni positive con proteine ​​gag e pol senza reazione con proteine ​​env possono riflettere lo stadio di sieroconversione precoce, nonché indicare la presenza di infezione da HIV-2 o di una reazione non specifica.

L’uso dell’immunoblotting come metodo esperto per la diagnosi dell’HIV presenta una serie di svantaggi significativi:

1. L'impossibilità di confermare il rilevamento dell'antigene p24 dell'HIV 1 nel caso di utilizzo di test che determinano simultaneamente l'antigene e gli anticorpi dell'HIV, il che rende inappropriato (privo di significato) l'uso di test di screening per il rilevamento simultaneo di antigene e anticorpi all'HIV (Ordinanza del Ministero della Sanità della Federazione Russa n. 292 del 30.07.2001: "per esaminare i donatori nelle stazioni trasfusionali è necessario utilizzare sistemi di test che rilevano sia l'antigene che gli anticorpi dell'HIV").

2. Rilevazione degli anticorpi solo della classe IgG. È impossibile confermare completamente i risultati positivi ottenuti utilizzando i test di 3a e 4a generazione (rilevazione degli anticorpi IgG e IgM).

3. La soggettività dell'interpretazione del punteggio del test, soprattutto nei casi di risultati "dubbi" e "incerti" e nelle fasi iniziali della sieroconversione (le bande rilevabili sulle membrane di nitrocellulosa in questi casi sono sfocate, appena visibili ad occhio nudo , e spesso ci sono disaccordi quando vengono valutati da persone diverse).

4. L'impossibilità di una valutazione quantitativa automatizzata dei risultati dell'analisi.

5. Sensibilità inferiore rispetto all'ELISA.

6. Fragilità di conservazione (durante la conservazione, le strisce di membrana di nitrocellulosa sbiadiscono e non possono costituire una conferma oggettiva del rilevamento o del mancato rilevamento dell'HIV in casi controversi).

7. Difficoltà nell'impostazione della reazione e nella conservazione (le strisce di membrana di nitrocellulosa sono molto fragili e spesso si rompono).

8. Costo elevato dei kit IS.

Reagente noto, che è un kit per la determinazione simultanea di antigeni e anticorpi contro lo stesso agente patogeno, compreso l'HIV (DE 4236189 F1, 28.04.1994). Tuttavia, non viene divulgato un sistema di test che consenta di diagnosticare l'infezione da HIV in vari stadi.

L'obiettivo della presente invenzione è quello di ottenere un sistema di test con il quale sia possibile confermare risultati positivi o dubbi di test di screening per anticorpi anti-HIV 1 e 2, HIV 1 gruppo O e antigene HIV 1 p24 utilizzando test per la rilevazione simultanea di antigeni e anticorpi.

La soluzione tecnica proposta si ottiene mediante un sistema di test immunoenzimatico per identificare lo spettro di anticorpi contro il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) del primo e del secondo tipo, il primo tipo del gruppo O e il rilevamento dell'antigene p24 del virus dell'immunodeficienza umana del primo tipo p24, caratterizzato dal fatto di comprendere un immunoassorbente a base di antigeni del virus dell'immunodeficienza umana, che sono gp41 (env HIV-1 e HIV-2 gruppo O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol) , gp36 (env HIV-2), anticorpi contro l'antigene HIV 1 p24 e reagenti di rilevamento, in cui i suddetti antigeni HIV e anticorpi HIV sono adsorbiti in diversi pozzetti di piastre per test immunoenzimatico.

Inoltre, per l'assorbimento vengono utilizzate piastre in polistirene pieghevoli o non pieghevoli da 96 pozzetti per test immunoenzimatici.

Il risultato tecnico raggiunto dalla presente invenzione è la possibilità di confermare risultati positivi per gli anticorpi anti-HIV 1 e 2, HIV 1 gruppo O e HIV 1 antigene p24, alta sensibilità, possibilità di interpretazione automatizzata dei risultati, che elimina la soggettività di la valutazione, la facilità di esecuzione del test, è inferiore rispetto ai costi IS esistenti.

Questa soluzione tecnica differisce da quelle note:

1. Utilizzo come piastra portante in fase solida per reazioni immunologiche.

2. Uso simultaneo di anticorpi contro l'HIV p 24 e un set di antigeni dell'HIV come assorbente.

L'invenzione è illustrata dal seguente esempio.

I principi attivi del sistema di test sviluppato "DS-IFA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AG p24 HIV 1" sono:

Immunoassorbente - antigeni ricombinanti simili alle proteine ​​strutturali dell'HIV-1: gp41 (env HIV-1 e HIV 1 gruppo O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), HIV-2: gp36 (env) e monoclonale anticorpi murini contro l'antigene dell'HIV 1(p24) adsorbiti separatamente su strisce di una piastra pieghevole in polistirolo.

Per la preparazione dell'uso immunoassorbente:

1. HIV-1 gp41 è una proteina prodotta dal ceppo di E. Coli n. AHIV 103.

2. HIV-1 gp120 è una proteina prodotta dal ceppo di E. Coli n. AHIV 109.

3. HIV-1 p24 - proteina prodotta dal ceppo di E. Coli n. HIV 105.

4. HIV-1 p31 - proteina prodotta dal ceppo di E. Coli n. HIV 108.

5. HIV-2 p36 - proteina prodotta dal ceppo di E. Coli n. HIV 106.

Coniugato 1, anticorpi monoclonali murini anti-HIV1 p24, liofilizzati o liquidi, coniugati con biotina.

1. Coniugato 2, liofilizzato o liquido, - una miscela di antigeni ricombinanti simili alle proteine ​​strutturali dell'HIV-1: gp41 (env HIV-1 e HIV 1 gruppo O), gp120 (env), p24 (gag), p31 ( po1); HIV-2: gp36 (env) coniugato con biotina;

2. Coniugati 3, 4 - liofilizzati o liquidi - streptavidina marcata con perossidasi di rafano;

Nel corso degli studi preliminari è stata scelta la progettazione del sistema di test, è stata elaborata la tecnologia per la preparazione dei suoi componenti e sono state ottimizzate le condizioni per lo svolgimento del test immunoenzimatico.

Quando si imposta l'ELISA nel sistema di test "DS - ELISA - ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + Ag p24 HIV 1", 25 μl di coniugato-1 vengono aggiunti ai pozzetti della piastra con anticorpi adsorbiti contro p24 e nei pozzetti con gli antigeni adsorbiti - 25 µl di coniugato-2. Lo schema di reazione è mostrato di seguito. Successivamente, a ciascun pozzetto vengono aggiunti 25 μl del campione da testare. Allo stesso tempo, nei pozzetti con gli antigeni, il colore cambia dall'arancione al rosa, e nel pozzetto con gli anticorpi, dal verde al grigio. La miscela viene incubata per 45 minuti a 37°C su un agitatore (o 1 ora a 37°C in un termostato). Quindi, senza lavare, 50 μl di coniugato-3 vengono aggiunti ai pozzetti della compressa per determinare l'antigene p24 e 50 μl di coniugato-4 vengono aggiunti ai pozzetti per determinare gli anticorpi. Dopo incubazione per 20 minuti a 37°C su un agitatore (o 30 minuti a 37°C in un termostato), la piastra viene lavata e sviluppata con la miscela di substrato. Tempo di reazione totale 1 ora e 25 minuti (o 1 ora e 50 minuti). L'antigene p24 presente nel campione da testare si lega agli anticorpi monoclonali anti p24 e gli anticorpi specifici formano un complesso con gli antigeni ricombinanti sulla piastra. Il risultante complesso immunitario anti-p24 con p24 viene rilevato con i coniugati anti-p24-biotina, quindi con streptavidina-perossidasi, e gli immunocomplessi Ag-HIV con At-HIV vengono rilevati con il coniugato Ag-biotina, quindi con streptavidina-perossidasi .

Schema di impostazione della reazione.

La contabilizzazione dei risultati viene effettuata spettrofotometricamente a due lunghezze d'onda: 450 /620-680 nm con lo strumento impostato su "aria". Prendiamo in considerazione i risultati ad una lunghezza d'onda di 450 nm.

I risultati dell'analisi vengono presi in considerazione se i valori medi della densità ottica (OD) nei pozzetti con K- non sono superiori a 0,2, nei pozzetti con K+ - non inferiori a 1,0. OP critico. calcolato dalla formula:

OP critico. gp41 = cfr. valore OP K-(gp41)+0,15

OP critico. gp120 = cfr. valore OP K-(gp120)+0,15

OP critico. p24 = cfr. valore OP K-(р24)+0,15

OP critico. p31 = cfr. valore OP K-(р31)+0,15

OP critico. gp36 = cfr. valore OP K-(gp36)+0,15

OP critico. Ag p24 = cfr. valore OD a- (Ag p24)+0,04

dove 0,15 e 0,04 sono coefficienti stabiliti con il metodo di elaborazione statistica presso il produttore. Nel processo di sviluppo del sistema di test sono stati utilizzati:

1. Campioni di siero sanguigno da donatori sani (n=610).

2. Campioni di siero sanguigno di pazienti con varie malattie infettive non associate all'HIV (ARI, polmonite, tonsillite, infezioni erpetiche e da citomegalovirus, sifilide, clamidia, epatite virale A, B e C (n=224)).

3. Campioni di siero sanguigno di pazienti con varie malattie non trasmissibili - lesioni, malattie del sistema cardiovascolare, oncologia (n=35).

4. Campioni di siero sanguigno di donne in gravidanza (n=40).

5. Campioni di siero sanguigno, sieropositivi in ​​ELISA e confermati in immunoblot (n=428).

6. Campioni di siero con risultato positivo ottenuti con sistemi di test immunoenzimatici per la determinazione simultanea degli anticorpi HIV 1,2 e dell'antigene p24 e risultato indeterminato dell'immunoblot (n=123).

7. Pannello interno di sieri contenenti e non contenenti anticorpi anti-HIV 1.2, testati con test immunoenzimatici registrati dal Ministero della Salute della Federazione Russa e immunoblot (n=21).

8. Standard "HIV 1 ANTIGEN STANDARD", "BIO RAD", Francia, cat. N. 72217, che è un antigene ottenuto da un lisato virale.

9. Lo standard interno dell'impresa. Un campione contenente l'antigene p 24 ad una concentrazione di 200 pg/ml, ottenuto da un lisato virale e titolato secondo lo standard "HIV 1 ANTIGEN STANDARD" della società "BIO RAD", Francia, cat. N. 72217.

10. Pannello standard di sieri contenente anticorpi contro il virus dell'immunodeficienza umana del primo tipo (HIV 1) - OSO 42-28-212-93-02P, Unione Medico-Biologica, Novosibirsk.

11. Pannello standard di sieri contenente anticorpi contro il virus dell'immunodeficienza umana del secondo tipo (HIV 2) - OSO-42-28-216-02P, Unione Medico-Biologica, Novosibirsk.

12. Pannello standard di sieri che non contengono anticorpi contro il virus dell'immunodeficienza umana del primo tipo e del secondo (HIV 1, 2) - OSO-42-28-214-94-02P, Unione Medico-Biologica, Novosibirsk.

La valutazione della sensibilità del sistema di test per la rilevazione dell'antigene p24 è stata effettuata utilizzando lo Standard "HIV I ANTIGEN STANDARD", "BIO RAD", lo Standard Interno dell'azienda. Utilizzando lo standard interno, sono state preparate 4 diluizioni doppie consecutive da 40 pg/mL a 5 pg/mL con plasma di donatore normale privo di anticorpi anti-HIV 1, 2 come diluente. Come criterio di sensibilità è stata presa la quantità minima di antigene rilevabile. I dati ottenuti sono presentati nella tabella 1.

Per valutare la sensibilità del sistema di test per la rilevazione di anticorpi specifici, sono stati utilizzati pannelli standard di campioni contenenti anticorpi contro il virus dell'immunodeficienza umana (HIV 1, 2) (OSO 42-28-212-93-02P p.012, OSO 42-28-216-02P (HIV 2) p.003).

I dati ottenuti sono presentati nelle tabelle 3, 4.

L'efficacia diagnostica del sistema di test "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" è stata confrontata con i sistemi di test "Jenscrin-HIV-Ag/Am" (Bio-Rad), "DIA-HIV 1 /2" (Diaprof-Med), "Vironostica dell'HIV Uniforme II Ag/Am" (Biomerioux), "HIV-1.2 DSM ricombinante" (MBS), "Amercard Anti-HIV-1.2 K" (Amercard) , " HIV-1, HIV-2-ELISA-Avicenna" (Avicenna). A questo scopo, i campioni di siero del pannello interno sono stati testati in tutti i test indicati. I risultati presentati nella Tabella 5 indicano l'elevata efficienza diagnostica del "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1".

Sono stati effettuati anche studi di sensibilità del sistema di test "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" con i sieri di sangue di pazienti confermati positivi all'HIV nell'immunoblot. Sono stati analizzati un totale di 428 campioni di questi sieri. Sono state ottenute diverse opzioni per rilevare anticorpi contro varie proteine ​​dell'HIV e l'antigene p24. I risultati sono presentati nella tabella 6.

Tabella 6 I risultati del rilevamento degli anticorpi contro varie proteine ​​dell'HIV 1 e contro l'antigene p24 durante l'analisi di sieri positivi all'HIV 1 (n=428)
% di rilevamento	Profilo proteico
	anti-gr41	anti-gr120	anti-r24	anti-r31	p24
51,1%	+	+	+	+	-
35,3%	+	-	+	+	-
4%	+	-	+	-	-
3,3%	+	-	-	+	-
1,4%	+	-	-	+	+
1,2%	+	+	+	+	+
1,2%	+	+	-	+	+
0,9%	+	-	+	+	+
0,7%	+	-	+	-	+
0,5%	+	-	-	-	+
0,2%	+	+	-	-	+
0,2%	+	+	-	-	-
Rilevazione % di anticorpi contro singole proteine ​​o Ag p24	100%	53,9%	93,2%	94,4%	6,1%

Durante l'analisi di campioni positivi all'HIV 1, il 3% dei sieri ha mostrato una reazione positiva con gp36 (env HIV 2). MP/OPcrit in questi campioni non ha superato 2,0. I nostri dati sulla reattività crociata delle proteine ​​dell'involucro esterno dell'HIV 1 (gp41) e dell'HIV 2 (gp36) sono coerenti con i dati della letteratura.

Interpretazione dei risultati

L'analisi dei test sui sieri HIV positivi e sui campioni dei pannelli standard e interni in "DS-IFA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" ha permesso di sviluppare criteri per interpretare i risultati di questo test. I criteri raccomandati sono mostrati nella Tabella 7.

Sulla base di questi criteri, tutti i campioni di sieri positivi all'HIV (n=428) sono stati identificati come positivi in ​​"DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV1". Dei 16 campioni del pannello standard contenenti anticorpi anti-HIV 1, 14 sono stati determinati come positivi e 2 come indeterminati. Tutti gli 8 campioni del pannello standard contenenti anticorpi anti-HIV 2 sono risultati positivi. Dei 10 campioni del pannello interno contenenti anticorpi anti-HIV 1, 7 sono stati identificati come positivi e 3 come indeterminati.

Sono stati effettuati anche studi di sensibilità del sistema di test "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" con sieri di sangue di pazienti con risultato positivo in sistemi di test immunoenzimatici che rilevano contemporaneamente anticorpi e antigene p24, e indeterminato nell'immunoblot. Sono stati testati un totale di 123 campioni di questo tipo. I dati sono presentati nella tabella 8.

Analizzando i sieri con un risultato immunoblot indeterminato (n=123) in "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" 72 campioni (58,5%) hanno mostrato un risultato positivo. Di questi, 26 sieri (21,1%) sono positivi solo per p24, 20 (16,3%) - solo per anticorpi, 16 (13%) - per p24 con anticorpi contro una delle proteine, 10 (8,1%) - su p24 con anticorpi contro due o più proteine. Pertanto, il test per i soli anticorpi (nessuna rilevazione di p24) risulterebbe positivo in 30 campioni (24,4%). La rilevazione dell'antigene p24 nel test ha permesso di determinare come positivi altri 42 campioni (34,1%).

Per valutare la specificità del sistema di test, è stato utilizzato un pannello standard di sieri non contenente anticorpi anti-HIV 1, 2 (n=20); campioni di siero sanguigno di donatori sani (n=610), campioni di siero sanguigno di pazienti con varie malattie infettive (n=224) non associate all'HIV; campioni di siero sanguigno di pazienti con varie malattie non trasmissibili - lesioni, malattie del sistema cardiovascolare, oncologia (n=35); campioni di siero sanguigno di donne in gravidanza (n=40). Sono stati testati un totale di 929 campioni. Un campione dei sieri di sangue di donatori sani ha mostrato un risultato falso positivo: sono stati rilevati anticorpi contro gp41 e p24. 7 campioni di sieri di sangue di donatori sani e 2 campioni di sieri di sangue di pazienti con malattie infettive non associate all'HIV hanno mostrato un risultato falso positivo per p24.

Per valutare la specificità del sistema di test, è stato utilizzato un pannello standard di campioni negativi (OSO 42-28-214-94-02p, p. 009). La specificità era del 100%.

Pertanto, gli studi condotti hanno dimostrato che la specificità del sistema di test "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" è del 99% nello studio di campioni di siero sanguigno di donatori normali e pazienti con varie infezioni e malattie somatiche.

I dati ottenuti mostrano l'elevata efficienza diagnostica del sistema di test sviluppato "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1". Il sistema di test può essere utilizzato per rilevare anticorpi contro singole proteine ​​dell'HIV di tipo 1 e 2 e l'antigene HIV1 p24 per confermare un risultato di screening positivo con sistemi di test che rilevano anticorpi o sistemi di test che rilevano contemporaneamente anticorpi e antigene HIV1 p24. Il sistema di test può essere utilizzato come test immunoblot alternativo per confermare risultati positivi, nonché per studiare la dinamica degli anticorpi contro l'HIV e l'antigene p24 nei diversi stadi dell'infezione.

VANTAGGI DEL TEST

1. Formato della piastra del test immunoenzimatico di conferma

2. Test di conferma che combina lo spettro anticorpale dell'HIV 1, 2 e l'antigene p24 dell'HIV 1

3. Rilevazione di anticorpi di tutte le classi Ig

4. La sensibilità per il rilevamento di p24 non è inferiore a 5 pg/ml

5. Riduce i risultati indeterminati rispetto all'immunoblot

6. Tempo di analisi - 1 ora e 25 minuti (immunoblot - da 3 a 20 ore)

7. Valutazione visiva dell'introduzione di tutti i componenti e campioni.

1. Sistema di test ELISA per l'identificazione dello spettro di anticorpi contro il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) del primo e del secondo tipo, il primo tipo del gruppo O e il rilevamento dell'antigene p24 del virus dell'immunodeficienza umana del primo tipo p24, caratterizzato dal fatto di includere un immunoassorbente a base di antigeni del virus dell'immunodeficienza gp41 (env HIV-1 e HIV-2 gruppo O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), anticorpi all'antigene p24 dell'HIV 1 e ai reagenti di rilevamento, mentre i suddetti antigeni dell'HIV e anticorpi dell'HIV vengono adsorbiti in diversi pozzetti delle piastre per il test immunoenzimatico.

2. Sistema di test ELISA secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che per l'assorbimento vengono utilizzate piastre di polistirene pieghevoli o non pieghevoli da 96 pozzetti per test immunoenzimatici.

L'infezione da HIV è classificata come una malattia incontrollata a causa della mancanza di metodi per la sua prevenzione specifica e dell'insufficiente efficacia della terapia. Pertanto, per controllare la situazione epidemiologica dell'infezione da HIV, attualmente vengono utilizzati principalmente studi diagnostici di screening. Il posto principale tra i metodi di diagnosi dell'infezione da HIV è occupato dal test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), che consente di identificare i marcatori sierologici dell'agente eziologico di questa malattia negli individui esaminati.

Questo rapporto presenta i risultati della determinazione degli anticorpi anti-HIV nel siero di 40.823 persone, compresi pazienti di cliniche prenatali, policlinici, ospedali cittadini, nonché centri medici specializzati nell'esame e nel trattamento di pazienti a rischio (tossicodipendenti, pazienti con epatite virale B, C e malattie veneree). Gli studi sono stati condotti nel 2005 nel laboratorio di immunologia dell'Istituto di ricerca di ostetricia e ginecologia da cui prende il nome. PRIMA. Ott dell'Accademia Russa delle Scienze Mediche, che ha più di 15 anni di esperienza nell'uso dei metodi ELISA per la diagnosi di varie malattie infettive.

Per l'esame iniziale dei campioni di siero sanguigno è stato utilizzato il sistema di test anti-HIV-1 + 2 CombiBest (ZAO Vector-Best, Novosibirsk), che rileva gli anticorpi specifici totali contro l'HIV-1 e l'HIV-1 nei campioni esaminati di esseri umani siero o plasma sanguigno 2 (immunoglobuline classi A, G e M). In questo kit diagnostico, le proteine ​​ricombinanti dell'HIV vengono utilizzate sia per l'immobilizzazione nei pozzetti delle compresse, sia come coniugato con la perossidasi di rafano. I risultati dell'analisi dei sieri sono stati valutati secondo le istruzioni del sistema di test: negativi (non contenenti anticorpi anti-HIV-1 e HIV-2) sono stati considerati campioni di test, la cui densità ottica (OD) in ELISA non superava il valore ODcrit.

Dopo lo screening in laboratorio, 40.222 (98,5%) dei 40.823 campioni di siero sono risultati negativi per il test ELISA e 601 (1,5%) dei campioni testati sono stati considerati inizialmente positivi. Come risultato della rianalisi effettuata il giorno successivo di ciascuno dei 601 sieri in duplicato (due pozzetti della compressa), 440 (73,2%) campioni sono stati identificati come positivi e 161 (26,8%) come negativi. In conformità con le raccomandazioni del Ministero della Salute e dello Sviluppo Sociale, 440 sieri positivi allo screening sono stati congelati e trasferiti per ulteriori studi di conferma nella sala di consultazione e diagnostica del laboratorio di riferimento dell'Ospedale n. S.P. Botkina. Questi studi sono stati condotti utilizzando i sistemi di test ELISA “ECOlab-Vironostics HIV 1.2 Ag/Ab” (“ECOlab”, Elektrogorsk), “Genscreen Plus HIV Ag-Ab” (BioRad, USA), nonché kit immunoblot. I risultati dell'analisi di 440 sieri nei test di conferma hanno portato alla conclusione che 323 (73,4%) campioni sono positivi e 102 (23,2%) negativi. Per 15 campioni esaminati (3,4%) è stato ottenuto un risultato analitico indeterminato.

Va notato che i valori OD ottenuti nel nostro laboratorio durante i test iniziali utilizzando il sistema di test anti-HIV-1+2 CombiBest per 314 (97,2%) di questi 323 sieri positivi variavano da 0,900 a 1,780, e per 9 (2,8%) campioni: 0,500–0,900. I valori di OD ottenuti dallo screening di 102 sieri negativi per 52 campioni (51%) variavano da 0,195 a 0,400; per 40 campioni (39,2%) - 0,401–0,800; 10 (9,8%) campioni - più di 0,800.

Pertanto, come risultato del lavoro svolto, è stato dimostrato che l'esame primario dei sieri del sangue per la presenza di marcatori sierologici dell'infezione da HIV utilizzando il sistema di test anti-HIV-1+2 CombiBest è altamente efficace. I risultati positivi dello screening sono stati confermati da ulteriori studi nel laboratorio di riferimento nel 73% dei casi, mentre i risultati falsi positivi sono stati registrati solo per lo 0,25% dei 40.823 sieri analizzati.

Informazioni generali sullo studio

L'HIV (virus dell'immunodeficienza umana) è un virus della famiglia dei retrovirus che infetta le cellule del sistema immunitario umano (CD4, T-helper). Causa l'AIDS.

L'HIV-1 è il tipo di virus più comune, riscontrato più spesso in Russia, Stati Uniti, Europa, Giappone e Australia (solitamente sottotipo B).

L’HIV-2 è un tipo raro, comune nell’Africa occidentale.

Per la diagnosi del virus dell'immunodeficienza umana viene utilizzato un sistema di test combinato di quarta generazione, che è in grado di rilevare l'infezione da HIV già 2 settimane dopo che il virus è entrato nel sangue, mentre i sistemi di test di prima generazione lo fanno solo 6-12 settimane dopo l'infezione.

Il vantaggio di questo test HIV combinato è la rilevazione, grazie all'uso di anticorpi anti-HIV-1 p24 come reagenti, dell'antigene specifico p24 (proteina del capside virale), che può essere rilevato da questo test già 1-4 settimane dopo l'infezione, cioè anche prima della sieroconversione, il che riduce notevolmente il "periodo finestra".

Inoltre, tale test HIV rileva gli anticorpi anti-HIV-1 e HIV-2 nel sangue (usando la reazione antigene-anticorpo), che vengono prodotti in quantità sufficienti per essere determinati dal sistema di test dopo 2-8 settimane dal momento di infezione.

Dopo la sieroconversione, gli anticorpi iniziano a legarsi all'antigene p24, risultando in un test degli anticorpi HIV positivo e in un test p24 negativo. Tuttavia, dopo un po’ di tempo, nel sangue verranno rilevati contemporaneamente sia gli anticorpi che l’antigene. Nella fase terminale, un test per l'AIDS per gli anticorpi contro l'HIV può dare un risultato negativo, poiché il meccanismo per la produzione degli anticorpi viene interrotto.

Fasi dell'infezione da HIV

1. Il periodo di incubazione, o “periodo finestra sieronegativo”, è il tempo che intercorre dal momento dell’infezione fino alla produzione di anticorpi protettivi contro il virus nel sangue, quando i test per gli anticorpi anti-HIV sono negativi, ma la persona può già trasmettere il virus al virus. altre persone. La durata di questo periodo va da 2 settimane a 6 mesi.
2. Il periodo di infezione acuta da HIV si verifica in media 2-4 settimane dopo l'infezione e dura circa 2-3 settimane. In questa fase, alcune persone possono sviluppare sintomi simil-influenzali aspecifici dovuti alla replicazione attiva del virus.
3. Lo stadio latente è asintomatico, ma durante esso si verifica una graduale diminuzione dell'immunità e un aumento della quantità di virus nel sangue.
4. L'AIDS (sindrome da immunodeficienza acquisita) è lo stadio finale dell'infezione da HIV, caratterizzato da una grave soppressione del sistema immunitario, nonché da malattie concomitanti, encefalopatia o cancro.

Nonostante il fatto che l'infezione da HIV sia incurabile, oggi esiste una terapia antiretrovirale (ART) altamente attiva, che può prolungare significativamente la vita di una persona infetta da HIV e migliorarne la qualità.

Questo test ha un valore diagnostico particolarmente elevato se l'infezione da HIV si è verificata poco prima del momento del test (2-4 settimane).

A cosa serve la ricerca?

L'analisi viene utilizzata per la diagnosi precoce dell'HIV, che aiuta a prevenire l'ulteriore trasmissione del virus ad altre persone, nonché per l'avvio tempestivo della terapia antiretrovirale e del trattamento delle malattie che contribuiscono alla progressione dell'infezione da HIV.

Quando è programmato lo studio?

• Con sintomi persistenti (per 2-3 settimane) di eziologia poco chiara: febbre subfebbrile, diarrea, sudorazione notturna, perdita di peso improvvisa, linfonodi ingrossati.
• Con infezione ricorrente da herpes, epatite virale, polmonite, tubercolosi, toxoplasmosi.
• Se il paziente soffre di malattie sessualmente trasmissibili (sifilide, clamidia, gonorrea, herpes genitale, vaginosi batterica).
• Se il paziente ha avuto rapporti sessuali vaginali, anali o orali non protetti con più partner sessuali, con un nuovo partner o con un partner di cui il paziente non è sicuro dello status di HIV.
• Quando il paziente è stato sottoposto a una procedura di trasfusione di sangue (anche se i casi di infezione in questo modo sono praticamente esclusi, poiché il sangue viene attentamente testato per la presenza di particelle virali e sottoposto a uno speciale trattamento termico).
• Se il paziente ha iniettato farmaci utilizzando strumenti non sterili.
• Durante la gravidanza/pianificazione della gravidanza (AZT durante la gravidanza, il taglio cesareo per evitare la trasmissione del virus al bambino al momento del passaggio nel canale del parto e il mancato allattamento al seno riducono il rischio di trasmissione dell'HIV da madre a figlio del 30% all'1%).
• Iniezione accidentale con una siringa o un altro oggetto (come uno strumento medico) contenente sangue infetto (in questi casi, la probabilità di infezione è estremamente bassa).

La diagnosi tempestiva dell'infezione da HIV diventa una misura estremamente importante, poiché un trattamento precoce può in gran parte determinare l'ulteriore sviluppo della malattia e prolungare la vita del paziente. Negli ultimi anni sono stati compiuti progressi significativi nel campo dell’individuazione di questa terribile malattia: i vecchi sistemi di test vengono sostituiti da altri più avanzati, i metodi di esame stanno diventando più accessibili e la loro precisione è notevolmente aumentata.

In questo articolo parleremo dei metodi moderni per diagnosticare l'infezione da HIV, che è utile conoscere per trattare tempestivamente questo problema e mantenere la normale qualità della vita del paziente.

Metodi per diagnosticare l'HIV

In Russia, per la diagnosi dell'infezione da HIV viene eseguita una procedura standard che comprende due livelli:

• Sistema di test ELISA (analisi di screening);
• immunoblotting (IB).

Possono essere utilizzati anche altri metodi diagnostici:

• prove espresse.

Sistemi di test ELISA

Nella prima fase della diagnosi, per rilevare l’infezione da HIV viene utilizzato un test di screening (ELISA), basato sulle proteine ​​dell’HIV create in laboratorio che catturano anticorpi specifici prodotti nell’organismo in risposta all’infezione. Dopo la loro interazione con i reagenti (enzimi) del sistema di test, il colore dell'indicatore cambia. Inoltre, questi cambiamenti di colore vengono elaborati su apparecchiature speciali, che determinano il risultato dell'analisi eseguita.

Tali test ELISA sono in grado di mostrare risultati entro poche settimane dall'introduzione dell'infezione da HIV. Questa analisi non determina la presenza del virus, ma rileva la produzione di anticorpi contro di esso. A volte, nel corpo umano, la produzione di anticorpi contro l'HIV inizia dopo 2 settimane dall'infezione, ma nella maggior parte delle persone vengono prodotti in un secondo momento, dopo 3-6 settimane.

Esistono quattro generazioni di test ELISA con sensibilità diverse. Negli ultimi anni sono stati utilizzati con maggiore frequenza sistemi di test di III e IV generazione, basati su peptidi sintetici o proteine ​​ricombinanti e dotati di maggiore specificità e accuratezza. Possono essere utilizzati per diagnosticare l’infezione da HIV, monitorare la prevalenza dell’HIV e garantire la sicurezza durante i test sul sangue donato. L'accuratezza dei sistemi di test ELISA di III e IV generazione è del 93-99% (più sensibili sono i test prodotti nell'Europa occidentale - 99%).

Per eseguire un test ELISA, vengono prelevati 5 ml di sangue dalla vena del paziente. Tra l'ultimo pasto e l'analisi dovrebbero trascorrere almeno 8 ore (di norma viene eseguita al mattino a stomaco vuoto). Si consiglia di eseguire tale test non prima di 3 settimane dopo la presunta infezione (ad esempio, dopo un rapporto non protetto con un nuovo partner sessuale).

I risultati del test ELISA si ottengono dopo 2-10 giorni:

• risultato negativo: indica l'assenza di infezione da HIV e non richiede il rinvio a uno specialista;
• risultato falso negativo: può essere osservato nelle prime fasi dell'infezione (fino a 3 settimane), nelle fasi successive dell'AIDS con grave soppressione immunitaria e con preparazione del sangue inadeguata;
• risultato falso positivo: può essere osservato in alcune malattie e in caso di preparazione del sangue impropria;
• risultato positivo: indica un'infezione da HIV, richiede un IB e il rinvio del paziente a uno specialista in un centro per l'AIDS.

Perché un test ELISA può dare risultati falsi positivi?

Risultati falsi positivi di un test ELISA per l'HIV possono essere osservati con un trattamento improprio del sangue o in pazienti con tali condizioni e malattie:

• mieloma multiplo;
• malattie infettive provocate dal virus Epstein-Barr;
• stato dopo;
• Malattie autoimmuni;
• sullo sfondo della gravidanza;
• condizione dopo la vaccinazione.

Per i motivi sopra descritti nel sangue possono essere presenti anticorpi cross-reattivi non specifici, la cui produzione non è stata provocata dall'infezione da HIV.

Negli ultimi anni, la frequenza dei risultati falsi positivi è diminuita significativamente grazie all'uso di sistemi di test di III e IV generazione, che contengono peptidi più sensibili e proteine ​​ricombinanti (sono sintetizzati utilizzando l'ingegneria genetica in vitro). Dopo l'uso di tali test ELISA, la frequenza dei risultati falsi positivi è diminuita significativamente ed è pari a circa lo 0,02-0,5%.

Un risultato falso positivo non significa che una persona sia infettata dall’HIV. In questi casi, l’OMS raccomanda un altro test ELISA (IV generazione obbligatoria).

Il sangue del paziente viene inviato a un laboratorio di riferimento o di arbitrato contrassegnato con "ripetizione" e testato su un sistema di test ELISA di IV generazione. Se il risultato della nuova analisi è negativo, il primo risultato viene riconosciuto come errato (falso positivo) e l'IB non viene eseguito. Se il risultato è positivo o dubbio durante il secondo test, il paziente deve sottoporsi a IB entro 4-6 settimane per confermare o confutare l'infezione da HIV.

macchiatura immunitaria

Una diagnosi definitiva di infezione da HIV può essere fatta solo dopo aver ottenuto un risultato positivo dell’immunoblotting (IB). Per la sua implementazione viene utilizzata una striscia di nitrocellulosa su cui vengono applicate le proteine ​​​​virali.

Il prelievo di sangue per IB viene eseguito da una vena. Successivamente viene sottoposto ad un trattamento speciale e le proteine ​​contenute nel suo siero vengono separate in un gel speciale in base alla loro carica e peso molecolare (la manipolazione viene effettuata su attrezzature speciali sotto l'influenza di un campo elettrico). Una striscia di nitrocellulosa viene applicata al gel di siero sanguigno e l'assorbimento ("blotting") viene eseguito in una camera speciale. La striscia viene lavorata e se i materiali utilizzati contengono anticorpi contro l'HIV, si legano alle bande antigeniche sull'IB e appaiono come linee.

L'IB è considerato positivo se:

• secondo i criteri americani del CDC - sulla striscia sono presenti due o tre righe gp41, p24, gp120/gp160;
• secondo i criteri della FDA americana - sulla striscia sono presenti due righe p24, p31 e una riga gp41 o gp120/gp160.

Nel 99,9% dei casi, un risultato IB positivo indica un'infezione da HIV.

In assenza di linee - IB è negativo.

Nell'identificare le linee con gp160, gp120 e gp41, IB è dubbioso. Tale risultato può essere rilevato quando:

• malattie oncologiche;
• gravidanza;
• frequenti trasfusioni di sangue.

In questi casi, si consiglia di eseguire un secondo studio utilizzando un kit di un'altra azienda. Se, dopo un ulteriore IB, il risultato rimane dubbio, è necessario un follow-up per sei mesi (l'IB viene eseguito ogni 3 mesi).

reazione a catena della polimerasi

Il test PCR può rilevare l’RNA del virus. La sua sensibilità è piuttosto elevata e consente di rilevare l'infezione da HIV già 10 giorni dopo l'infezione. In alcuni casi, la PCR può dare risultati falsi positivi, perché la sua elevata sensibilità può anche reagire agli anticorpi di altre infezioni.

Questa tecnica diagnostica è costosa, richiede attrezzature speciali e specialisti altamente qualificati. Questi motivi non ne consentono l'esecuzione durante i test di massa sulla popolazione.

La PCR viene utilizzata in questi casi:

• rilevare l'HIV nei neonati nati da madri affette da HIV;
• per rilevare l'HIV nel "periodo finestra" o in caso di IB dubbio;
• controllare la concentrazione dell'HIV nel sangue;
• per lo studio del sangue dei donatori.

Solo con il test PCR non viene fatta la diagnosi di HIV, ma viene effettuata come metodo diagnostico aggiuntivo per risolvere le controversie.

Metodi espressi

Una delle innovazioni nella diagnostica dell'HIV sono diventati i test rapidi, i cui risultati possono essere valutati in 10-15 minuti. I risultati più efficienti e accurati si ottengono con test immunocromatografici basati sul principio del flusso capillare. Sono strisce speciali su cui viene applicato sangue o altri fluidi di prova (saliva, urina). In presenza di anticorpi contro l'HIV, dopo 10-15 minuti, sul test appare una striscia colorata e di controllo: un risultato positivo. Se il risultato è negativo, appare solo la linea di controllo.

Come per i test ELISA, i risultati dei test rapidi devono essere confermati dall'analisi IB. Solo allora è possibile effettuare la diagnosi di infezione da HIV.

Esistono kit rapidi per i test a casa. Il test OraSure Technologies1 (USA) è approvato dalla FDA, disponibile senza prescrizione medica e può essere utilizzato per rilevare l'HIV. Dopo il test, in caso di risultato positivo, si consiglia al paziente di sottoporsi ad un esame in un centro specializzato per confermare la diagnosi.

I restanti test per uso domestico non sono ancora stati approvati dalla FDA e i loro risultati possono essere molto discutibili.

Nonostante il fatto che i test rapidi abbiano una precisione inferiore ai test ELISA di IV generazione, sono ampiamente utilizzati per ulteriori test sulla popolazione.

Puoi fare il test per l'infezione da HIV in qualsiasi policlinico, nell'Ospedale Regionale Centrale o nei centri specializzati contro l'AIDS. Sul territorio della Russia sono tenuti in modo assolutamente confidenziale o anonimo. Ogni paziente può aspettarsi di ricevere una consulenza medica o psicologica prima o dopo l'analisi. Dovrai pagare per i test HIV solo nelle istituzioni mediche commerciali e nelle cliniche e negli ospedali pubblici vengono eseguiti gratuitamente.

Per informazioni su come è possibile contrarre l'infezione da HIV e quali miti esistono sulle possibilità di contrarre l'infezione, leggi

L'ELISA (saggio immunoassorbente legato all'enzima, ELISA - inglese) è entrato nella vita della medicina pratica altrove negli anni '60 del secolo scorso. Il suo compito iniziale era la ricerca istologica per scopi scientifici, che si limitava alla ricerca e all'identificazione della struttura antigenica delle cellule di un organismo vivente.

Il metodo ELISA si basa sull'interazione di antigeni specifici (AT) e correlati (AG) con la formazione di un complesso antigene-anticorpo, che viene rilevato utilizzando un enzima. Questo fatto ha portato gli scienziati all'idea che il metodo può essere utilizzato a fini diagnostici per identificare immunoglobuline specifiche di varie classi coinvolte nella risposta immunitaria a una particolare infezione. Ed è stata una svolta nella diagnostica clinica di laboratorio!

Il metodo iniziò ad essere utilizzato attivamente solo all'inizio degli anni '80, e quindi principalmente in istituzioni specializzate. I primi analizzatori ELISA furono forniti a centri e stazioni trasfusionali, ospedali infettivi e venerei, poiché il formidabile AIDS, nato nel continente africano, apparve con noi all'orizzonte e si unì subito alle “vecchie” infezioni, richiedeva misure immediate di diagnosi e alla ricerca di farmaci terapeutici che lo agiscano.

Campo di applicazione del metodo ELISA

Le possibilità dei test immunoenzimatici sono davvero ampie. Ora è difficile immaginare come si possa fare a meno di tali studi, che vengono utilizzati letteralmente in tutti i rami della medicina. Sembra che l'ELISA possa fare in oncologia? Si scopre che può. E molto. La capacità dell'analisi di individuare marcatori caratteristici di alcuni tipi di neoplasie maligne è alla base della diagnosi precoce di un tumore, quando non è ancora individuato in altro modo a causa delle sue piccole dimensioni.

La moderna diagnostica clinica di laboratorio (CDL), oltre ai marcatori tumorali, dispone di un significativo arsenale di pannelli ELISA e li utilizza per diagnosticare varie condizioni patologiche (processi infettivi, disturbi ormonali) e monitorare i farmaci per identificare il loro effetto sulla salute del paziente. corpo e, tra l'altro, non solo umano. Attualmente, il test immunoenzimatico è ampiamente utilizzato nel servizio veterinario, perché anche i "nostri fratelli minori" sono soggetti a molte malattie, di cui, a volte, soffrono molto.

Così, L'ELISA, grazie alla sua sensibilità e specificità, può determinare da un campione di sangue prelevato da una vena:

• Stato ormonale (ormoni tiroidei e surrenali, ormoni sessuali);
• La presenza di un'infezione virale e batterica (HIV, B e C, clamidia, sifilide e, così come molte altre malattie causate da microrganismi patogeni);
• Tracce dell'attività vitale dei microrganismi che hanno avviato il processo infettivo, che si è concluso con successo e è passato allo stadio di formazione di una risposta immunitaria a questo agente patogeno. Tali tracce, cioè gli anticorpi, in molti casi rimangono circolanti nel sangue per tutta la vita, proteggendo una persona dalla reinfezione.

Qual è l'essenza dell'IF?

Il metodo di dosaggio immunoenzimatico consente di determinare non solo la presenza dell'agente patogeno stesso (analisi qualitativa), ma anche il suo contenuto quantitativo nel siero del paziente.

Una dose virale o batterica influenza in modo significativo il decorso del processo infettivo e il suo esito, pertanto l'analisi quantitativa gioca un ruolo importante nella diagnosi e nel trattamento delle malattie in varie forme e stadi.

Tuttavia, conoscendo i test immunoassorbenti enzimatici come metodo ELISA, non pensiamo nemmeno a come riesca a coprire una gamma così ampia di microrganismi che popolano il nostro pianeta, molti dei quali rappresentano una minaccia diretta per la salute e la vita degli esseri umani e dei bambini. animali. Il fatto è che ELISA ha molte opzioni (non competitive e competitive - dirette e indirette), ognuna delle quali risolve il proprio problema e, quindi, consente una ricerca mirata.

Per rilevare le immunoglobuline dell'una o dell'altra classe, viene utilizzato un tradizionale pannello (compressa) di polistirene a 96 pozzetti, nei cui pozzetti sono concentrate le proteine ​​ricombinanti adsorbite in fase solida. Gli anticorpi o gli antigeni che sono entrati nel pozzetto con il siero del sangue trovano un oggetto “familiare” e formano con esso un complesso (AG - AT), che, fissato dall'enzima coniugato, si manifesterà come un cambiamento nel colore del pozzetto durante la lettura dei risultati.

Il dosaggio immunoenzimatico viene eseguito su sistemi di test di una certa specificità, realizzati in laboratori speciali e dotati di tutti i componenti reagenti necessari. Gli studi possono essere condotti utilizzando lavatrici ("lavatrici") e leggendo spettrofotometri, dove è coinvolta la maggior parte del lavoro manuale. Sulle macchine completamente automatiche, liberando l'assistente di laboratorio dalla monotona instillazione, lavaggio e altri compiti di routine, ovviamente, è più veloce e conveniente lavorare, ma non tutti i laboratori possono permettersi un tale lusso e continuare a lavorare alla vecchia maniera - su dispositivi semiautomatici.

L'interpretazione dei risultati dell'ELISA è di competenza del medico di diagnostica di laboratorio, mentre viene necessariamente presa in considerazione la proprietà inerente a quasi tutte le reazioni immunochimiche di fornire risposte false positive o false negative.

Video: moderno test immunoenzimatico

Risultati ELISA sull'esempio della sifilide

ELISA è adatto per il rilevamento di tutte le forme e, inoltre, viene utilizzato negli studi di screening. Per l'analisi viene utilizzato il sangue venoso del paziente prelevato a stomaco vuoto. Nel lavoro vengono utilizzate piastre con una certa specificità (classi AT A, M, G) o anticorpi totali.

Considerando che gli anticorpi nella sifilide sono prodotti in una sequenza specifica, l'ELISA può facilmente rispondere alla domanda su quando si è verificata l'infezione e in quale fase si trova il processo, e la decodifica dei risultati ottenuti può essere presentata nella seguente forma:

• Le IgM indicano la durata del processo infettivo (possono comparire durante l'esacerbazione di malattie infiammatorie croniche);
• Le IgA indicano che l'infezione è avvenuta più di un mese fa;
• Le IgG indicano che l'infezione è in pieno svolgimento o che il trattamento è recente, cosa che può essere facilmente rilevata raccogliendo l'anamnesi.

Durante il test per la sifilide, i pozzetti negativi (e il controllo negativo) rimarranno incolori, mentre quelli positivi (come il controllo positivo) mostreranno un colore giallo brillante a causa del cambiamento di colore del cromogeno aggiunto durante il test. Tuttavia, l'intensità del colore non sempre corrisponde al controllo, ovvero potrebbe essere leggermente più chiaro o leggermente giallastro. Si tratta di risultati dubbi che, di regola, sono soggetti a riesame tenendo conto obbligatoriamente degli indicatori quantitativi ottenuti sullo spettrofotometro, ma in generale il colore è direttamente proporzionale al numero di complessi immunitari (antigeni e anticorpi legati tra loro).

Il più entusiasmante dei test immunoenzimatici: ELISA per l'HIV

L'analisi, forse più di altre, interessa una fascia ampia della popolazione, perché non è ancora possibile affermare con certezza che molti problemi sociali (prostituzione, tossicodipendenza, ecc.) siano scomparsi. Sfortunatamente, l’HIV non colpisce solo questi settori della società umana, ma è possibile contrarre l’infezione in varie circostanze che non sono legate alla promiscuità sessuale o all’uso di droghe. Ma se è necessario un test HIV, non dovresti aver paura che tutti intorno scoprano come visitare un laboratorio del genere. Ora le persone infette da HIV sono protette dalla legge e chi ha dubbi può rivolgersi a uffici anonimi dove possono risolvere il problema senza timore di pubblicità e condanna.

Il test immunoenzimatico utilizzato per diagnosticare l'infezione da HIV è uno degli studi standard primari, che tuttavia richiede condizioni speciali, poiché l'argomento è molto delicato.

È opportuno eseguire l'ELISA per l'HIV dopo un rapporto sessuale, una trasfusione di sangue, altre procedure mediche che comportano un'infezione e alla fine del periodo di incubazione ("finestra sieronegativa"), ma va tenuto presente che questo periodo di tempo non è costante. Può terminare in 14-30 giorni o può durare fino a sei mesi, quindi il valore medio è considerato un intervallo compreso tra 45 e 90 giorni. Il sangue viene donato per l'HIV allo stesso modo delle altre infezioni: da una vena a stomaco vuoto. I risultati saranno pronti in base all'accumulo di materiale nel laboratorio e al suo carico di lavoro (da 2 a 10 giorni), sebbene la maggior parte dei laboratori fornisca una risposta lo stesso giorno o quello successivo.

Cosa ci si può aspettare dai risultati dell'HIV?

L’ELISA per l’infezione da HIV rileva gli anticorpi contro due tipi di virus: HIV-1 (più comune in Russia e altri paesi europei e asiatici) e HIV-2 (più comune nell’Africa occidentale).

Il compito dell'HIV ELISA è quello di cercare gli anticorpi di classe G rilevati su tutti i sistemi di test, ma in un periodo successivo, e gli anticorpi di classe A e M rilevati su kit di test ricombinanti di nuova generazione, che consentono di rilevare gli anticorpi il più presto possibile fasi (il periodo di incubazione è la finestra sieronegativa). Dall’ELISA ci si possono aspettare le seguenti risposte:

1. Risultato positivo primario: il sangue viene sottoposto a ricontrollo su un sistema di analisi dello stesso tipo, ma, se possibile, di una serie diversa e da un'altra persona (assistente di laboratorio);
2. Ripetuto (+) comporta un nuovo prelievo di sangue da un paziente con uno studio simile all'analisi primaria;
3. Il successivo risultato positivo è soggetto ad un'analisi di riferimento, che utilizza kit di test altamente specifici (2-3 pezzi);
4. Un risultato positivo in entrambi (o tre) sistemi viene inviato per l'immunoblotting (lo stesso ELISA, ma eseguito individualmente su kit di test con specificità particolarmente elevata).

La conclusione sull'infezione da HIV viene fatta solo sulla base dell'immunoblotting. La conversazione con la persona infetta si svolge in completa riservatezza. La divulgazione di segreti medici in Russia, così come in altri paesi, è soggetta a sanzioni penali.

Anche le analisi per la clamidia e il citomegalovirus mediante dosaggio immunoenzimatico hanno guadagnato particolare popolarità, poiché consentono di determinare il momento dell'infezione, lo stadio della malattia e l'efficacia delle misure terapeutiche.

Durante l'introduzione è anche possibile osservare la comparsa di anticorpi di varie classi. nelle diverse fasi di una condizione patologica causata da un agente infettivo:

• Le IgM possono essere rilevate già sette giorni dopo l'infezione;
• Le IgA indicano che l'infezione vive nel corpo da più di un mese;
• Le IgG confermano la diagnosi di clamidia, aiutano a monitorare il trattamento e determinarne l'efficacia. È opportuno precisare che gli anticorpi di classe G permangono e circolano nell’organismo indipendentemente dalla durata della malattia, pertanto, per la corretta interpretazione dell’analisi, occorre tenere conto dei valori di riferimento​​(norme) che, per in ogni caso, sono diversi per ogni CDL: tenendo conto della marca del sistema di test e della specificità dei reagenti inclusi nel set. I valori normali vengono inseriti nel modulo accanto al risultato ELISA.

Per quanto riguarda, qui è un po' diverso: gli anticorpi di classe M compaiono in circa un mese e mezzo, cioè un risultato positivo (IgM+) diventa nella fase di infezione primaria o durante la riattivazione di un'infezione latente e rimane tale da 4 mesi a sei mesi.

La presenza di anticorpi di classe G è caratteristica dell'insorgenza di un'infezione acuta primaria o di una reinfezione. L'analisi afferma che il virus è presente, ma non fornisce informazioni sullo stadio del processo infettivo. Nel frattempo, anche la determinazione della norma del titolo IgG causa difficoltà, poiché dipende interamente dallo stato immunitario di una determinata persona, che, tuttavia, è stabilito dal rilevamento delle immunoglobuline di classe G. Dato questo comportamento degli anticorpi, nella diagnosi di CMVI, diventa necessario valutare la capacità degli anticorpi di classe G di interagire con il CMV, per poterlo successivamente “neutralizzare” (avidità AT). Nella fase iniziale della malattia, le IgG si legano molto male agli antigeni del virus (bassa avidità) e solo allora iniziano a mostrare attività, quindi si può parlare di un aumento dell'avidità degli anticorpi.

Possiamo parlare a lungo dei vantaggi del test immunoenzimatico, perché questo metodo è riuscito a risolvere molti problemi diagnostici utilizzando solo sangue venoso. Non sono necessarie lunghe attese, preoccupazioni e problemi per il prelievo del materiale per la ricerca. Inoltre, i sistemi di test ELISA continuano a migliorare e il giorno in cui il test fornirà un'affidabilità del risultato del 100% non è lontano.

Video: film educativo dell'Università medica statale di Mosca. Sechenov sulle basi dell'ELISA