Un microscopio confocale a scansione laser con un design ottico e un sistema di rilevamento unici che consente di ottenere sezioni ottiche con la massima efficienza. Puoi lavorare con la fluorescenza multicanale con un massimo di dieci coloranti e utilizzare il rilevamento spettrale continuo su tutta la gamma di lunghezze d'onda visibili.

LSM710 su un supporto per microscopio invertito Axio Osserva Z1è il microscopio confocale definitivo per la biologia cellulare e dello sviluppo. Insieme ad un treppiede dritto AxioImager O AxioEmainer - LSM710 si trasforma in uno strumento per il lavoro in neurobiologia, fisiologia e studio delle biointerazioni nella più ampia gamma di esperimenti.

Il design ottico include fino a otto porte laser e qualsiasi combinazione di linee laser dal vicino UV all'IR. Modulo di rilevamento a 34 canali QUASAR consente una strategia di cattura ottimale per diversi spettri di emissione, senza essere vincolati a filtri e specchi dicroici. Puoi sempre dirigere qualsiasi parte dello spettro del segnale verso qualsiasi rilevatore tu scelga.

La scansione spettrale prevede esperimenti ad alta risoluzione e rilevamento simultaneo di un massimo di 10 canali.

Nel modulo di scansione LSM710 viene utilizzata una soluzione tecnica avanzata: uno Spectral Recycling Loop, che fornisce l'amplificazione del segnale facendo passare ripetutamente tutte le parti non separate del segnale fluorescente attraverso il reticolo spettrale. La correzione del piano di polarizzazione di una parte della fluorescenza aumenta il segnale totale di emissione in media del 15 -17%!

Modifica LSM710NLOè un microscopio a scansione laser dotato di un laser multifotone a femtosecondi che genera radiazione ad alta densità nella regione dell'infrarosso di 680-1080 nm. Grazie alle proprietà di un tale laser, possiamo penetrare fino a una profondità di 500 µm, mentre l'eccitazione avviene solo all'interno del microvolume focale, inferiore a 0,1 µm 3 , che consente di agire delicatamente sui tessuti viventi.

Specifiche:

• Modulo di scansione con due, tre rilevatori ad alta sensibilità a canale singolo o con rilevatore spettrale a 34 canali per una rapida acquisizione parallela dell'intero profilo di emissione;
• Scelta arbitraria dell'intervallo spettrale di registrazione del segnale con una risoluzione fino a 3 nm (scansione sequenziale) e 10 nm (scansione parallela);
• Rivelatore di luce trasmessa;
• Specchi di scansione galvanometrica indipendenti Due;
• Risoluzione di scansione da 4 x 1 a 6144 x 6144 pixel;
• Velocità di scansione: velocità di scansione 14 x 2; 5 fotogrammi/sec a 512 x 512 pixel; 0,38 ms/linea di 512 pixel (2619 linee/sec);
• Zoom scansione ZOOM da 0,6x a 40x con incrementi di 0,1x;
• Rotazione libera di 360° del telaio di scansione;
• Foro stenopeico confocale: foro stenopeico confocale motorizzato con regolazione fluida del diametro e delle coordinate;
• Capacità dati: 8, 12 o 16 bit;
• Linee laser: 355, 405, 458, 488, 514, 543, 561, 594, 633; sintonizzabile 488-640;
• Opzioni treppiede: invertite AxioObserver; Dritto AxioImager; dritto con tavolo fisso AxioExaminer.

Lo sviluppo dell'ingegneria genetica, della proteomica, della biotecnologia, dei prodotti farmaceutici moderni e della biomedicina ha contribuito alla rapida introduzione di nuovi metodi di microscopia confocale, che sono ora ampiamente utilizzati nella biologia cellulare.

La microscopia confocale a fluorescenza può essere considerata una variante della tradizionale microscopia a fluorescenza, che consente di studiare la microstruttura interna delle cellule, non solo fisse, ma anche viventi, di identificare microrganismi, strutture cellulari e singole molecole e di osservare processi dinamici in cellule. La microscopia confocale a fluorescenza, inoltre, ha fornito la possibilità di una risoluzione tridimensionale dell'oggetto submicronica e ha ampliato significativamente la possibilità di analisi non distruttive di campioni trasparenti. Un aumento della risoluzione si ottiene utilizzando i laser come sorgenti luminose nei microscopi confocali e un diaframma confocale per filtrare la fluorescenza fuori fuoco. Il vantaggio dei laser rispetto alle lampade al mercurio o allo xeno è la monocromaticità e l'elevato parallelismo del fascio luminoso emesso. Queste proprietà della radiazione laser forniscono un funzionamento più efficiente del sistema ottico del microscopio, riducono il numero di abbagliamenti e migliorano la precisione della messa a fuoco del raggio luminoso. Sul campione, il laser non illumina l'intero campo visivo, come in un microscopio a lampada fluorescente, ma è focalizzato su un punto. Naturalmente, in questo caso, il raggio laser eccita la fluorescenza sia nel punto focale che in tutti gli strati del campione attraverso i quali passa. E se questa fluorescenza fuori fuoco emessa dagli strati situati sopra e sotto il piano focale viene registrata insieme al segnale principale proveniente dal fuoco dell'obiettivo, ciò degrada la risoluzione del sistema ottico. Il diaframma confocale consente di eliminare la fluorescenza sfocata. Modificando il diametro del diaframma confocale, è possibile determinare lo spessore dello strato ottico vicino al fuoco del raggio laser, in modo che la fluorescenza emessa sopra e sotto il fuoco venga sfocata sul diaframma confocale e non venga rilevata. Di conseguenza, la microscopia confocale fornisce una migliore risoluzione, principalmente lungo l’asse Z.

La moderna microscopia confocale consente di risolvere tre compiti principali: lo studio della struttura fine della cellula, lo studio della bellizzazione (disposizione reciproca spaziale) di due o più sostanze nella cellula, nonché lo studio dei processi dinamici che si verificano nelle cellule viventi.

Con una risoluzione migliorata, in particolare la maggiore risoluzione dell'asse Z, e la capacità di creare una serie di sezioni "ottiche", il microscopio confocale consente di esplorare la struttura fine di un oggetto nello spazio tridimensionale. Programmi speciali consentono di creare un'immagine tridimensionale di un oggetto (3D) da una serie di sezioni ottiche e, per così dire, di visualizzarlo da diversi angoli di vista, che possono fornire preziose informazioni sulla forma delle cellule, del citoscheletro, del struttura del nucleo, dei cromosomi e persino della localizzazione dei singoli geni in essi, nonché della posizione di questi elementi.

L'uso di una modalità di funzionamento multispettrale (con diversi fluorocromi) di un microscopio confocale a scansione laser consente di studiare la colizzazione (disposizione spaziale) di due o più sostanze diverse in una cellula, ad esempio proteine ​​marcate con diversi coloranti fluorescenti. Esaminando tali preparati in un microscopio a fluorescenza convenzionale, è impossibile dire con certezza se queste sostanze si trovano una accanto all'altra o una sotto l'altra. Utilizzando il metodo delle sezioni ottiche e l'ulteriore ricostruzione 3D dell'oggetto, è possibile ricreare la distribuzione volumetrica delle sostanze. La modalità multispettrale consente inoltre di condurre studi FISH su un microscopio confocale.

La possibilità di ottenere serie temporali di immagini ad elevata risoluzione spaziale consente di esplorare i cambiamenti che avvengono nelle cellule e nelle loro strutture nel tempo (ricostruzione 4D). Inoltre, grazie alla presenza di laser e di un sistema di scansione, è possibile non solo registrare i cambiamenti temporali, ma anche influenzare le strutture cellulari con la radiazione laser osservando contemporaneamente i processi in corso.

Nuovi metodi di microscopia confocale a scansione laser si sono diffusi nelle scienze fondamentali e sono sempre più utilizzati anche nella ricerca pratica e nella medicina diagnostica.

I metodi di microscopia confocale consentono di rivelare la capacità delle sostanze di accumularsi nel citoplasma, nel nucleo o in altre strutture cellulari, di registrare la formazione di metaboliti, di misurare la cinetica di accumulo e metabolismo delle sostanze nella cellula, la velocità di escrezione di sostanze dalla cellula, per confrontare l'intensità del metabolismo in diverse linee cellulari e in diverse condizioni. Questi metodi sono sempre più utilizzati negli studi sui meccanismi d'azione sia degli agenti cancerogeni che dei farmaci e dei composti antitumorali e consentono di calcolarne le concentrazioni efficaci.

L'analisi dell'intensità e della forma degli spettri di fluorescenza intrinseca permette di riconoscere le cellule normali e quelle infiammate e questo metodo, in particolare, è stato proposto come un nuovo metodo per la diagnosi precoce della cervice.

Scegliendo una combinazione di filtri per diversi tipi di fluorescenza intrinseca, è possibile distinguere tra strutture tissutali maligne e normali in campioni bioptici di linfonodi di pazienti con linfoadenopatia di varia origine senza colorazione istochimica e laborioso ottenimento e studio di molte sezioni.

I metodi di microscopia confocale sono ampiamente utilizzati in embriologia e idrobiologia, botanica e zoologia nello studio della struttura dei gameti, dello sviluppo e della formazione degli organismi.

La microscopia confocale è in continua evoluzione e vengono introdotti nella pratica nuovi metodi di ricerca per studiare i meccanismi di funzionamento degli organismi a livello cellulare, subcellulare e molecolare, che stanno diventando ogni giorno sempre più richiesti nella ricerca applicata e nella diagnostica. L'avvento del microscopio confocale personale a scansione laser FV10i consente di espandere i confini dell'applicazione delle tecniche confocali. Microscopio FV10i svolge le stesse funzioni dei sistemi di scansione confocale di ricerca ad alta tecnologia FV1000. Tutti i componenti principali sono integrati in un corpo compatto: 4 laser a diodi, un rilevatore di scansione spettrale, un software intuitivo, un'incubatrice, un tavolino motorizzato, una piattaforma antivibrante e persino una "camera oscura". Questo microscopio è ideale per chi si avvicina alle tecniche confocali, per chi vuole liberare i microscopi confocali da ricerca da compiti di routine, per laboratori diagnostici, laboratori con budget limitato, per compiti didattici e per esami in condizioni di limitato comfort , ad esempio, nelle stazioni biologiche.

Il microscopio multiparametrico Leitz di nuova concezione consente l'analisi simultanea dell'assorbimento dell'emoglobina negli eritrociti e della fluorescenza delle cellule marcate con FITC contenenti emoglobina S e si possono analizzare milioni di cellule. Il sistema (LEYTAS), collegato a un computer per l'analisi delle immagini, prima mette a fuoco e conta tutti i globuli rossi lungo una fila di campi visivi utilizzando l'illuminazione inferiore con luce viola (415 nm). Dopo la scansione lungo una singola linea lunga 8 cm, l'illuminazione viene cambiata da trasmessa a incidente su comando del computer e tutti i campi visivi lungo la linea di scansione vengono rianalizzati, con la scansione per determinare gli oggetti fluorescenti eseguita in conformità con curva delle posizioni di messa a fuoco precedentemente determinate. Per ciascun oggetto definito, la sua immagine fluorescente e assorbente viene archiviata in memoria come livelli di grigio. Dalla memoria, l'immagine viene visualizzata su uno schermo televisivo, che consente di valutare visivamente gli oggetti selezionati (Fig. 6.9). Per ogni segnale sospetto vengono memorizzate un'immagine fluorescente e due immagini assorbenti. Un confronto visivo delle immagini fluorescenti e assorbenti ad alto ingrandimento consente di determinare la natura di questo segnale. Pertanto, gli artefatti possono essere distinti dalle celle degne di nota. Il fatto che il segnale corrisponda effettivamente alla cellula mutante viene confermato utilizzando un microscopio. Poiché tutte le coordinate vengono archiviate in memoria, le celle vengono posizionate automaticamente. La maggior parte dei segnali sono artefatti. Nella fig. 6.9 solo il fotogramma n°79 si riferisce probabilmente ad una cellula mutante, cosa che potrebbe essere confermata al microscopio.

Riso. 6.9. Rilevazione mediante il sistema LEYTAS di immagini sospette in un preparato colorato con siero marcato FITC contro emoglobina S. Queste immagini vengono visualizzate sul monitor. Da sinistra a destra: numero del fotogramma, la sua immagine fluorescente e l'immagine dello stesso fotogramma formata dall'assorbimento a maggiore ingrandimento

Altri anticorpi contro eritrociti mutanti sono stati utilizzati da Langlois et al. , che ha determinato le cellule mutanti utilizzando la citometria a flusso. Si può presumere che la frequenza dei mutanti identificati in questo lavoro fosse significativamente superiore alla frequenza delle cellule con HbS.

Oltre a identificare mutanti rari, l’analisi delle immagini può essere utilizzata anche per rilevare cellule tumorali rare in remissione, nonché cellule infettate da virus in una fase iniziale di una malattia infettiva.

7. Microscopia laser a scansione

Solitamente, in microscopia, le immagini di strutture molto piccole si ottengono illuminando l'intera preparazione e ingrandendo l'immagine con un obiettivo. Quando si utilizza una telecamera insieme a un microscopio, il principio per ottenere un'immagine non cambia: anche l'immagine viene creata dall'oggetto e solo successivamente viene scansionata dalla telecamera. In effetti, tutti i metodi di scansione sono stati utilizzati principalmente in un'area molto limitata della microfotometria, per determinare i valori di assorbimento, fluorescenza o riflessione. Recentemente, la tecnica di scansione è stata applicata per creare immagini di alta qualità utilizzando raggi laser potenti e ben collimati. Nella microscopia ottica a scansione laser, l'oggetto non viene illuminato nel suo insieme, ma viene scansionato passo dopo passo. In ogni punto illuminato viene misurata la luce trasmessa, riflessa o emessa. L'immagine viene creata accumulando i risultati di queste misurazioni per ciascun punto dopo la loro elaborazione analogica o digitale, come una matrice nella memoria del computer.

Nel dispositivo disponibile nel nostro laboratorio (Zeiss, Germania), la scansione viene eseguita utilizzando galvanometri servoassistiti. Il tempo di scansione è relativamente breve (2 s per un campo di 512x512 pixel). Il processo di scansione è controllato da un microprocessore. Un PMT viene utilizzato come fotorivelatore. Il suo segnale passa attraverso un'unità di elaborazione analogica che controlla luminosità e contrasto.

Dopo la digitalizzazione, questo segnale entra nella memoria buffer, dove viene registrato alla frequenza video. Di conseguenza, si ottiene un'immagine fissa sul monitor a condizione che la tabella sia ferma durante la lettura. È possibile ottenere un ingrandimento variabile utilizzando un'unità di ingrandimento variabile. Il microscopio laser a scansione può essere utilizzato sia con sorgenti luminose convenzionali che laser. Con un laser si può ottenere sia l'illuminazione incidente (per riflessione e fluorescenza) che l'illuminazione trasmessa (per assorbimento, contrasto di fase o interferenza differenziale). Come normale sorgente luminosa è possibile utilizzare solo una lampada a incandescenza dotata di guida luminosa. Per fornire una migliore messa a fuoco e capacità di ricerca sul vetrino, nonché per studiare campioni con doppia colorazione, abbiamo aggiunto allo scanner laser un'unità di epiilluminazione convenzionale. I principali vantaggi della scansione laser sono:

1) basso livello di autofluorescenza nel percorso ottico, ottenuto grazie all'illuminazione spot;

2) elevata sensibilità del microscopio, derivante dall'utilizzo di una potente luce laser focalizzata in un punto. Anche debolmente fluorescente sonde del DNA;

3) utilizzo di ottiche a basso ingrandimento. L'intensità della fluorescenza è piuttosto elevata, il che rende possibile lavorare con l'obiettivo X2.5. Questo è un vantaggio importante quando si fa ricerca sul cervello;

4) basso tasso di sbiadimento, poiché il tempo di illuminazione di ciascun punto è molto breve;

5) la possibilità di condurre analisi multivariate;

6) scansione sequenziale a diversi livelli con microscopia a scansione confocale. Questo metodo viene utilizzato in quegli studi in cui è necessario lavorare con fluorescenze molto deboli,

ad esempio, quando si esegue una reazione di ibridazione. Anche la microscopia a scansione laser ha contribuito notevolmente alla ricerca sul cervello, poiché consente l’uso dell’ottica a basso ingrandimento necessaria per studiare le connessioni nelle reti nervose. Nella fig. 6.10 mostra le cellule nervose dell'ippocampo del ratto. Queste cellule sono state etichettate per identificare molecole specifiche. Rispetto alla normale microscopia a fluorescenza, il contrasto tra immagine e sfondo ottenuto con la scansione laser è molto più elevato, lasciando solo un livello molto basso di luce di sfondo indesiderata. Le reazioni possono anche essere quantificate con la scansione laser, poiché questa tecnica consente di stabilire una soglia tra le cellule e lo sfondo per migliorare il contrasto dell'immagine da preparazioni di prodotti a reazione molto bassa.

Inoltre, la scansione laser apre nuove possibilità per l'esame al microscopio ottico senza ulteriore colorazione delle sezioni ultrasottili realizzate per la microscopia elettronica.

Riso. 6.10. Immagine fluorescente dell'ippocampo di ratto ottenuta utilizzando un microscopio a scansione laser. Le sezioni sono state trattate con anticorpi marcati in modo fluorescente contro la guanina monofosfato. Ingrandimento: lente X40; oculare HYU. Scala 100 µm.

8. Letteratura

1. Yong, MR (1961) Quart. J. Microsc. Sc., 102, 419.

2. Price, ZH (1965) Am. J.Med. Tecnol., 31, 45.

3. Rost, FW (1972) In istochimica, teorica e applicata. Everson Pearse, AG (a cura di), Churchill Livingstone, Edimburgo, vol. 2, pag. 1171,

4. Siegel, JI (1982) Int. Lab., 12, 46.

5. Ploem, J. S. e Tanke, H. (1987) Introduzione alla microscopia a fluorescenza. Royal Microscopical Society, University Press, Oxford.

6. Lansing Taylor, D., Wagoner, A. S., Murphy, R. F., Lanni, F. e Birge, R. R. (1986) Applicazioni della fluorescenza nelle scienze biomediche. Alan Liss, New York.

7 Patzett, W. (1972) Lietz-Mitt. Saggio. und Techn., Bd V, Nr 7, 226.

8 Giloh, H. e Sedat, JW (1982) Science, 217, 1252.

9 Johnson, G. D. e de C. Nogueira Araujo, G. M. (1981) J. Immunol. Metodi, 43, 349.

10 Ploem, JS (1967) Zeitschrift Wiss. Microscopia, 68, 129.

11 Nairn R. C (1976) Tracciamento delle proteine ​​fluorescenti. Livingstone, Edimburgo.

12. Kraft, W. (1973) Leitz Techn. Informa., 2, 97.

Anthony van Leeuwenhoek viene spesso definito l'inventore del microscopio. Da un punto di vista storico, questo non è del tutto vero: molto prima di lui, il famoso Galileo, padre e figlio di Jansen, e Cornelius Drebbel presentarono al pubblico i loro strumenti ottici. Tuttavia, la fama di Leeuwenhoek non è affatto infondata: è stato lui il primo a riuscire a considerare gli organismi unicellulari, le cellule del sangue, la struttura degli occhi degli insetti, cioè a raggiungere davvero il livello micro.

Far pendere la goccia e non farla cadere è il compito più difficile. Per questo, è adatta una matita o un astuccio di una penna a sfera. Vale la pena sperimentare gli angoli di inclinazione e la quantità di acqua.

Contrariamente alla credenza popolare, il microscopio di Leeuwenhoek non assomigliava a quello moderno. Era una lente singola, fissata su un treppiede speciale. Una persona ignorante preferirebbe chiamare questo dispositivo una lente d'ingrandimento.

Mettere un laser in una goccia d'acqua non è così facile. La capacità di fissare saldamente il puntatore è molto importante. Abbiamo utilizzato le staffe di saldatura del negozio di radio.

Una goccia d'acqua è la stessa lente. Date un'occhiata alla definizione: una lente è un pezzo di materiale omogeneo trasparente delimitato da due superfici rifrangenti lucide di rivoluzione (superfici sferiche). Una goccia ha la forma di una sfera, l'acqua è omogenea, la tensione superficiale agisce su di essa meglio di qualsiasi lucidatura e, infine, l'indice di rifrazione dell'acqua non è uguale a quello dell'aria. Quindi, una goccia è una lente, anche se non molto buona.

L'area dell'immagine sullo schermo è molte volte maggiore della sezione trasversale del raggio laser. Pertanto, affinché l'immagine sia luminosa, vale la pena procurarsi un potente puntatore laser con un raggio verde.

Se indirizziamo un raggio puntatore laser verso la goccia e lo proiettiamo su un foglio di carta bianco, vedremo cosa succede all'interno della goccia. Il laser produce una radiazione coerente (in senso figurato, parallela), quindi possiamo dire che il suo raggio inizialmente è perfettamente focalizzato. In teoria si potrebbe utilizzare una normale lampada, ma per focalizzare con precisione la luce in una goccia sarebbe necessario un sistema ottico molto più complesso. Non illuderti: questa è una bella esperienza in ottica, ma non in biologia. Il fattore di ingrandimento della goccia è piccolo, quindi gli oggetti che vedi sullo schermo non sono affatto microrganismi, ma semplicemente particelle di polvere o piccoli peli. L'effetto di movimento è creato mescolando l'acqua all'interno della goccia. Eppure non si può negare che l'esperienza sia spettacolare.

Il microscopio confocale ottico e confocale laser multifunzionale ad alte prestazioni OPTELICS HYBRID presenta numerosi vantaggi: 2 tipi di ottica confocale in un microscopio, un interferometro a sfasamento, la possibilità di osservare in contrasto di interferenza differenziale, misurare lo spessore di pellicole sottili mediante spettroscopia rifrazione.
Scarica l'opuscolo.

Peculiarità

• Sorveglianza a colori ad alta definizione a 24 bit
• Osservazioni e misurazioni a largo campo
• Determinazione dello spessore dei lucidi
• elevato ingrandimento
• Un'alta risoluzione
• Alto contrasto
• Visualizzazione di difetti nanometrici, crepe, particelle su una superficie piana

Funzioni analitiche

Profilo/misure di confronto Misura la forma di una superficie lungo una linea definita dall'utente.
Dimensione di confronto per misurare la differenza tra più righe.
Criteri di misurazione: larghezza, altezza, angolo, raggio raffinato, deviazione

Misure di larghezza e passo
Ideale per misurare la larghezza dei modelli di semiconduttori. Precisione e ripetibilità leader del settore sono ottenute grazie a ottiche e rilevatori esclusivi.

• Precisione:
  ± µm
  (Es. ± 0,025 µm per larghezza linea 5 µm)
• Ripetibilità:
  3σ = 0,01 µm

Misura della rugosità superficiale
Misurazione della rugosità superficiale secondo parametri JIS e ISO. Le misurazioni della rugosità ad alta risoluzione sono possibili per qualsiasi tipo di campione grazie al metodo di misurazione senza contatto.

• Rugosità bidimensionale
  Rugosità superficiale: Ra, Rp, Rv, Rc, Rt, Rq, Rsm, Rk, Rpk, Rvk, ecc.
  JIS B 0671: Rk, Rpk, Rvk, Mr1, Mr2, A1, A2, ecc.
  Rmr
• Rugosità 3D
  Parametri di rugosità: Sa, Sp, Sv, Sz, pl, ecc.
  Opzioni volume: Sk, SPK, SVK, SMR1, VVK, VVV, ecc.

Analisi delle proprietà geometriche
HYBRID analizza oltre 20 proprietà, tra cui area, volume, centro di gravità e altro ancora. L'output dei risultati dell'analisi è disponibile in formato foglio di calcolo.

Misurazioni 2D
Misurazione di funzioni bidimensionali come lunghezza, angolo, raggio, ecc.

Misurazione dell'elevazione
Misurazione delle differenze di elevazione in un'area specificata dall'utente

Misurazione dello spessore del film (misure trasversali XZ)
Lo spessore del film si ottiene calcolando otticamente la distanza tra la superficie del film e la superficie del substrato utilizzando la luce riflessa. Esempio: pellicole PI su un substrato.

Gestione dei dati sperimentali

Alta velocità ed elevata precisione di misurazione

• Velocità di misurazione leader del settore. L'HYBRID raggiunge un frame rate di 15 Hz, circa 4 volte più veloce di un tipico CLSM (microscopio confocale a scansione laser), rendendolo un potente strumento per misurazioni automatiche ad alta velocità, patchwork e osservazioni ad alta velocità.
• Patchwork ad alta velocità. Questa funzione consente di unire un oggetto di grandi dimensioni, come mostrato in figura, da tante piccole porzioni di immagini. Ciò crea senza problemi un'immagine FOV ampia. Il tempo di processo è circa 1/6 di quello richiesto per un tipico CLSM. (Numero di schermi: 1/1,5, misurazione del tempo di visualizzazione: 1/4)
• Ottimizzazione automatica ad alta velocità del campo di misura. Nel patchwork, l'altezza dello spazio all'interno di ciascun FOV viene determinata automaticamente per eseguire la misurazione automatica. Ciò previene errori di input dell'immagine e riduce significativamente i tempi di scansione.
• Mappatura delle aree di visualizzazione dell'immagine. La posizione attuale delle misurazioni effettuate può essere visualizzata nel FOV più ampio dell'immagine. Questa funzione consente inoltre di raggiungere il punto di misurazione con un clic, eseguire il patchwork automatico nell'area specificata sulla mappa e coordinare la gestione delle informazioni nella posizione specificata.
• Precisione e ripetibilità di misura leader del settore. Per gli strumenti di misura è necessaria un'elevata precisione. Alta precisione:
  Larghezza linea: ± µm
  Misurazione dell'altezza: ±(0,11 + L/100) µm
• Elevato livello di ripetibilità. Larghezza di misurazione della linea 3σ: 10 nm
  Misurazione dell'altezza: 10 nm
  HYBRID raggiunge una riproducibilità leader del settore e rileva il picco reale situato nell'intervallo di misurazione in base alla curva IZ calcolata da uno speciale algoritmo.

Misure di interferenza ottica

Misurazione dell'altezza nanometrica in un ampio campo visivo. Sono possibili misurazioni precise dell'altezza del FOV su scala millimetrica.
Peculiarità
La risoluzione per la misurazione dell'altezza utilizzando l'interferenza ottica è indipendente dall'obiettivo NA. Pertanto è possibile ottenere un'elevata risoluzione anche in un campo visivo ampio. È adatto per misurare concavità/convessità ultrafine, rugosità superficiale e irregolarità mantenendo una visione grandangolare su scala millimetrica. È possibile espandere notevolmente la gamma di applicazioni di misurazione integrando questo metodo con la confocalità, che è più adatta per misurare pendenze e superfici ruvide.

Principio base delle misure di interferenza ottica
i profili superficiali vengono misurati con risoluzione nanometrica dall'analisi dei modelli di interferenza creati dall'interferenza della lente. La luce viene divisa in due array utilizzando un divisore di raggio all'interno dell'obiettivo. Uno degli array viene riflesso dalla superficie del campione, mentre l'altro array va allo specchio di riferimento e viene riflesso. Entrambi i raggi riflessi si sovrappongono alla lente dell'obiettivo per formare schemi di interferenza causati dalle differenze del percorso ottico. Poiché lo strumento è regolato in modo che non vi sia alcuna differenza nel percorso ottico nella posizione di messa a fuoco, le frange di interferenza indicano depressioni e rigonfiamenti sulla superficie del campione.

Interferometria a luce bianca a scansione verticale
Le frange di interferenza hanno un forte contrasto sul piano a fuoco. Il picco di luminosità nella frangia di interferenza viene determinato per misurazioni di altezza con l'affidabilità della microscopia confocale.

Interferometria a sfasamento
La misurazione dell'altezza in scala Angstrom è il grado di precisione della misurazione dall'analisi di fase delle frange di interferenza in una lunghezza d'onda della luce (546 nm) ottenuta quando la fase cambia in diversi passaggi. L'intervallo di misurazione è limitato a mezza lunghezza d'onda, ma il tempo di misurazione è di pochi secondi.

Misurazione dello spessore del film mediante riflettometria spettrale

Misurare lo spessore di una pellicola trasparente. È possibile misurare lo spessore dei lucidi scegliendo tra 6 lunghezze d'onda a luce bianca. L'area di misurazione è configurata dall'utente. Questa caratteristica è applicabile sia alle pellicole con rivestimento superficiale che alle pellicole con motivi. È disponibile la riflettometria spettroscopica per misurare lo spessore del film trasparente su scala nanometrica. Ciò compensa lo svantaggio dell'ottica confocale, che non può rilevare la posizione di messa a fuoco di una pellicola con uno spessore vicino alla lunghezza d'onda della luce, quindi non adatta alla misurazione dello spessore.

Principio della riflettometria spettroscopica
Lo spessore del film può essere misurato utilizzando uno spettro di riflettanza ottenuto mediante riflettometria spettroscopica dopo aver messo a punto i parametri con un modello di simulazione ottica. Lo spettro riflesso mostra la relazione tra riflettività assoluta e lunghezza d'onda. Varia a seconda dello spessore del film e delle costanti ottiche. La riflettanza assoluta è determinata dall'interferenza del film sottile causata dalle molteplici riflessioni della luce tra la superficie del film e il substrato.

Sei lunghezze d'onda vengono selezionate dalla luce bianca per produrre un'immagine riflessa per ciascuna e calcolare la riflettività. Le costanti ottiche (indice di rifrazione e coefficiente di estinzione) per film sottili e substrati vengono utilizzate nel modello ottico per calcolare la riflettanza assoluta dal coefficiente di Fresnel e misurare lo spessore del film dopo la regolazione dei parametri.

Osservazioni confocali ad ampio campo in luce bianca

Ampio FOV per una sorveglianza efficace
Il FOV è 1,6 volte più ampio di un tipico CLSM (microscopio confocale a scansione laser).

Elevata precisione di misurazione a basso ingrandimento
Con l'aiuto dei nostri obiettivi speciali è possibile effettuare misurazioni estremamente precise a basso ingrandimento, cosa difficile da ottenere con il CLSM standard. L'obiettivo è appositamente progettato per un ampio campo visivo e un'elevata precisione di misurazione, obiettivo High-NA (alto valore di apertura digitale) con ingrandimento 5x, 10x, 20x.

Ampio FOV e alta precisione

La microscopia confocale è uno dei metodi della microscopia ottica che presenta un contrasto significativo rispetto ai microscopi classici convenzionali. Una caratteristica distintiva di questo metodo è l'utilizzo di un diaframma in grado di interrompere il flusso di luce diffusa sullo sfondo.

In un microscopio confocale, in ogni momento viene registrata l'immagine di una corrente dell'oggetto. Un'immagine completa si ottiene scansionando il movimento del campione o ricostruendo il sistema ottico. Dopo la lente dell'obiettivo è posto un piccolo diaframma in modo che la luce emessa dal punto studiato lo attraversi e venga registrata, mentre la luce proveniente da altri punti viene trattenuta dal diaframma.

Il metodo di ricerca descritto consente di studiare la struttura interna di varie cellule. Può essere utilizzato per identificare singole molecole e strutture cellulari, microrganismi, nonché processi dinamici che si verificano nelle cellule.

Descrizione del metodo di microscopia confocale

Grazie alla microscopia confocale a fluorescenza, è stato possibile ottenere un'espansione tridimensionale degli oggetti submicronica e anche la possibilità di analisi non distruttive di campioni trasparenti è stata notevolmente ampliata. Grazie all'utilizzo dei laser come sorgenti luminose in questi microscopi si ottiene un aumento della loro risoluzione.

Rispetto alle lampade allo xeno o al mercurio, i laser presentano notevoli vantaggi, in quanto hanno la capacità di essere monocromatici, oltre ad un elevato parallelismo del fascio luminoso emesso. Tali proprietà della radiazione laser forniscono al sistema ottico un funzionamento più efficiente, oltre a ridurre la quantità di abbagliamento e aumentare la precisione della focalizzazione del raggio luminoso.

Sul campione in studio il laser non illumina l'intero campo visivo, ma viene focalizzato in un certo punto. L'apertura confocale elimina la fluorescenza fuori fuoco, mentre modificando il diametro dell'apertura è possibile determinare con precisione lo spessore dello strato ottico vicino al fuoco del raggio laser. Grazie alla proprietà descritta, la microscopia confocale consente di ottenere una migliore risoluzione lungo l'asse Z.

Programmi speciali, dotati di microscopi confocali, consentono di creare immagini tridimensionali di oggetti da una serie di sezioni ottiche, nonché di visualizzarli da diversi angoli di vista.

L'utilizzo di un microscopio confocale a scansione laser multispettrale consente di studiare la colizzazione di varie sostanze nella cellula. La modalità multispettrale consente di condurre studi FISH su un microscopio confocale.

Esempi di esami effettuati al microscopio confocale

La microscopia confocale aiuta a studiare la capacità di varie sostanze di accumularsi nel nucleo, nel citoplasma o in altre strutture cellulari. Queste capacità vengono spesso utilizzate nel processo di studio dei meccanismi d'azione di agenti cancerogeni, composti antitumorali, farmaci e consentono anche di calcolare le loro concentrazioni efficaci.

Lo studio letale dell'intensità e della forma degli spettri di fluorescenza intrinseca consente di riconoscere le cellule infiammate e normali. Questo metodo viene utilizzato nelle prime fasi della diagnosi del cancro cervicale.

È possibile ottenere una combinazione ben scelta di diversi filtri progettati per diversi tipi di fluorescenza intrinseca senza il laborioso esame di sezioni multiple. Pertanto, è possibile rilevare in modo rapido e accurato le strutture tissutali maligne e distinguerle da quelle normali.

I metodi della microscopia confocale sono ampiamente utilizzati in idrobiologia ed embriologia, in botanica e zoologia nel processo di studio della struttura dei gameti, nonché dello sviluppo e della formazione degli organismi.

I microscopi laser confocali nel mondo moderno sono ampiamente utilizzati in biologia, biofisica, medicina, biologia cellulare e molecolare. La microscopia confocale è una tecnica senza contatto unica attualmente utilizzata per studiare la cornea dell'occhio. Consente di valutare con precisione il grado esistente di cambiamenti cellulari e strutture extracellulari, nonché di trarre conclusioni su possibili danni alla cornea nel suo insieme.

I microscopi confocali laser hanno un'alta risoluzione, che consente di studiare la struttura delle cellule marcate in modo fluorescente e persino dei singoli geni. L'uso di varie tecnologie di colorazione fluorescente multicolore specifica per molecole biologicamente attive, nonché complessi supramolecolari, consente di studiare i complessi meccanismi di funzionamento non solo delle singole cellule, ma anche di interi sistemi. Questa tecnologia è ampiamente utilizzata nella biologia sperimentale, così come in medicina.

Attrezzatura: microscopi confocali

I moderni microscopi confocali ultra precisi, come il Leica TCS SP8, consentono di ottenere dati più chiari e affidabili durante lo svolgimento di vari studi. Un ampio interesse per tali dispositivi è sorto negli anni ottanta del secolo scorso, a causa del rapido sviluppo della tecnologia informatica e della tecnologia laser.

La microscopia confocale a scansione laser è un tipo di microscopia ottica. La sua caratteristica è che il raggio laser viene focalizzato su una determinata area lungo gli assi X e Y e forma così un'immagine. La luce riflessa viene visualizzata sullo schermo come raster. Le dimensioni dell'immagine dipendono direttamente dalla risoluzione dell'elettronica moderna, nonché dalla dimensione del raster scansionato.

I dispositivi di misurazione, creati utilizzando il moderno metodo della microscopia confocale a scansione laser, sono ora ampiamente utilizzati in vari campi. Rispetto alla microscopia ottica convenzionale, la microscopia confocale presenta i seguenti vantaggi:

• risoluzione migliorata;
• elevato contrasto dell'immagine;
• la capacità di condurre studi multispettrali con un alto grado di separazione del segnale;
• la possibilità di ottenere “sezioni ottiche” con ricostruzione tridimensionale;
• la possibilità di utilizzare metodi di elaborazione digitale delle immagini ottenute;

Tra le carenze dell'attrezzatura descritta ci sono:

• la complessità della configurazione del dispositivo;
• mancanza di immagine ottica;
• l'alto costo dei dispositivi, nonché l'alto costo della loro manutenzione.

Un microscopio confocale utilizza un computer speciale per controllare l'intero sistema. Ti consente di salvare le immagini e studiare in dettaglio i dati ricevuti. Per l'elaborazione di alta qualità delle immagini ottenute, è spesso necessaria una potenza di calcolo piuttosto elevata, quindi il computer deve avere una RAM sufficientemente grande. Per l'ulteriore memorizzazione delle informazioni è necessaria anche una grande memoria su disco. Per trasferire le immagini, un computer di questo tipo deve disporre di una porta USB o di un CD/DVDRW. Inoltre, il computer ha la capacità di connettersi a Internet globale o alla rete locale.

Il software installato su tali computer potrebbe essere di base. Viene fornito in dotazione e permette di gestire l'intero sistema e di controllarne le principali funzioni. Inoltre, per questi computer vengono sviluppati pacchetti di attività applicate, che possono essere ordinati in aggiunta. Molti modelli di microscopi confocali dispongono di uno speciale pannello di controllo che consente di regolarne il funzionamento da remoto.

Impostare gli strumenti descritti nelle visite di laboratorio di routine. La procedura più importante nel funzionamento dei microscopi confocali è il controllo delle vibrazioni. A tal fine, viene utilizzato un dispositivo speciale per misurare il livello di vibrazione. La procedura di controllo è simile alla procedura per misurare la risoluzione assiale dell'LSCM utilizzando uno specchio.

La microscopia confocale si sta sviluppando rapidamente. Famose aziende manifatturiere presentano sul mercato gli ultimi modelli di microscopi confocali, che consentono di separare efficacemente il raggio di eccitazione laser e la luminescenza. In tali dispositivi il divisore di raggio è controllato da un computer. Le sue proprietà spettrali, se necessario, possono essere rapidamente adattate a diverse linee laser.

Microscopi confocali in microbiologia

Il microscopio confocale è indispensabile anche in biologia per uno studio dettagliato della cellula. Oggi su questo argomento viene pubblicato un numero enorme di vari articoli scientifici. Molto spesso, utilizzando i microscopi confocali, studiano la struttura delle cellule e i loro organelli. Viene studiata anche la colocalizzazione nella cellula per capire se esiste una relazione causale tra le sostanze della cellula.

Nel processo di studio delle proteine ​​con microscopi confocali, queste vengono pre-etichettate con anticorpi con diversi fluorocromi. Utilizzando un microscopio classico convenzionale, è abbastanza difficile distinguere se si trovano uno accanto all'altro o uno sotto l'altro, ma un microscopio confocale consente di farlo senza problemi. I dati su una serie di sezioni ottiche vengono registrati nella memoria del computer e, quindi, viene eseguita una ricostruzione tridimensionale dell'oggetto e si ottiene la sua immagine tridimensionale.

Inoltre, con l'aiuto dei microscopi confocali, vengono studiati i processi dinamici che si verificano nelle cellule viventi, ad esempio il movimento degli ioni calcio o di altre sostanze attraverso le membrane cellulari. I microscopi confocali vengono anche utilizzati per studiare la mobilità delle molecole bioorganiche ionizzando la decomposizione fotochimica del fluorocromo nella zona di irradiazione, nonché la sua successiva separazione dalle molecole. Tali molecole sono marcate con due fluorocromi che hanno lo spettro di emissione del donatore, che si sovrappone allo spettro di assorbimento dell'accettore. Pertanto, l'energia viene trasferita dal donatore all'accettore su brevi distanze e come risultato della risonanza tra i livelli energetici. Successivamente, l'accettore nella regione visibile dello spettro emette energia, che viene successivamente registrata utilizzando un microscopio confocale.

Lo sviluppo della microscopia confocale continua. I produttori di queste apparecchiature ogni anno presentano sul mercato microscopi sempre più moderni, funzionali e migliorati, consentendo agli scienziati di fare nuove utili scoperte in vari campi. Anche il software per computer dotati di microscopi confocali verrà migliorato. Ti consente di implementare i compiti più complessi che consentono di condurre ricerche a livello molecolare e cellulare. Oggi possiamo affermare con sicurezza che il futuro appartiene ai microscopi confocali, poiché hanno notevolmente superato i microscopi convenzionali in termini di caratteristiche funzionali e capacità tecniche. Tra una gamma abbastanza ampia di apparecchiature ottiche confocali, ogni utente potrà scegliere per sé una torta al microscopio, che gli consentirà di sviluppare attivamente la sua ricerca.