Titolari del brevetto RU 2534617:

L'invenzione riguarda il campo della microbiologia, della biotecnologia e della farmaceutica, vale a dire piccole molecole regolatrici in grado di modificare in modo mirato la comunicazione dipendente dalla densità e il comportamento collettivo da essa regolato (“quorum sensing”) nei batteri. In particolare, l'invenzione riguarda l'uso di un derivato tiazolico di formula 1 come regolatore (attivatore o inibitore) del comportamento collettivo (“quorum sensing”) nei batteri. Il risultato tecnico è un derivato tiazolico destinato alla regolazione del “quorum sensing” mediato dal lattone omoserina nei batteri biotecnologicamente utili, putrefattivi e patogeni che producono violaceina. 2 illustrati, 1 tab., 2 ex.

L'invenzione riguarda la microbiologia, la biotecnologia e la farmaceutica e riguarda piccole molecole regolatrici in grado di cambiare direzione (indebolire o rafforzare) la comunicazione dipendente dalla densità e il comportamento collettivo da essa regolato (“quorum sensing”) nei batteri. L'invenzione può trovare applicazione nel controllo dei processi biotecnologici, nella produzione di mezzi per prevenire il deterioramento dei prodotti agricoli, nonché nella creazione di nuovi farmaci destinati al controllo e alla gestione delle infezioni batteriche di piante, animali e esseri umani.

La scoperta della comunicazione dipendente dalla densità nei batteri con la caratterizzazione dei meccanismi genetici molecolari sottostanti è diventata una delle scoperte più sorprendenti della microbiologia della fine del XX secolo. Allo stesso tempo, questo fenomeno del comportamento collettivo dei batteri, designato dal concetto di “quorum sensing”, ha permesso una valutazione fondamentalmente nuova di una serie di esempi di differenziazione funzionale e morfologica dei procarioti, compreso lo sviluppo della bioluminescenza, la sintesi di pigmenti e antibiotici, formazione di esoenzimi e fattori di virulenza, formazione di biofilm, coniugazione e sporulazione.

La prima variante descritta e più comune del "quorum sensing" tra i microrganismi sono i sistemi simili a luxI/luxR, in cui una molecola segnale-autoinduttore sintetizzata sotto il controllo del gene luxI si diffonde nell'ambiente esterno e quando viene raggiunta una densità di popolazione critica raggiunta e determinata da questa la propria concentrazione soglia, compie un movimento inverso nella cellula batterica, dove, legandosi alla proteina regolatrice LuxR, innesca la trascrizione dei geni bersaglio. Allo stesso tempo, l'analisi della natura chimica di tali autoinduttori ha permesso di caratterizzarli come varie varianti di omoserina lattoni acilati (HSL).

La decifrazione dei meccanismi genetici molecolari del comportamento collettivo, nonché l'identificazione dell'importante ruolo biologico dei sistemi di comunicazione dipendenti dalla densità, hanno determinato l'importanza della ricerca di approcci al controllo del rilevamento del quorum. Le soluzioni proposte erano: 1) soppressione della sintesi dell'autoinduttore; 2) la sua degradazione da parte di enzimi specifici (lattonasi o acilasi); 3) l'uso di agonisti e antagonisti del GSL che possono interferire direttamente con il segnale naturale per il legame alle proteine ​​luxR-like. È quest'ultimo approccio, che viene sviluppato più intensamente in molti laboratori in tutto il mondo e che finora ha portato alla creazione di diverse centinaia di composti attivi, che costituisce la base teorica per la presente invenzione.

Un'analisi delle fonti brevettuali aperte ci consente di affermare che l'analogo più vicino dell'invenzione rivendicata è un brevetto, la cui formula e descrizione contengono informazioni su un numero di composti, a seconda dell'oggetto dell'influenza, in grado di provocare l'attivazione (agonista ) o effetti inibitori (antagonisti) in relazione al "quorum sensing" mediato dall'omoserina lattone in alcuni tipi di batteri. Allo stesso tempo, i richiedenti hanno basato tali sostanze su un anello lattonico simile ai GSL naturali, per conferire ulteriori attività modulanti alle quali è stata effettuata una modifica covalente con gruppi acilici di varia struttura e composizione. Tuttavia, la significativa somiglianza strutturale del gruppo di molecole proposto con segnali naturali non solo fornisce la possibilità di interferenza tra loro indicata dai richiedenti, ma mantiene potenzialmente la possibilità di sviluppare effetti non contabilizzati in relazione ad altri microrganismi, comunicazione dipendente dalla densità tra i quali è mediato da GSL strutturalmente simili.

A sua volta, per quanto riguarda la struttura chimica del composto rivendicato, la soluzione tecnica conosciuta più vicina è un brevetto, la cui formula e descrizione contengono informazioni su un numero di composti basati su un anello tiazolico a cinque membri, legato covalentemente a cicloalchile sostituito o non sostituito , arile e altri gruppi. Tuttavia, questo brevetto non indica la possibilità di utilizzare questi composti per regolare il comportamento collettivo (“quorum sensing”) nei batteri, e lo scopo principale dei composti rivendicati è il loro utilizzo come antagonisti dei recettori dell'adenosina.

Pertanto, l'invenzione rivendicata non è nota dallo stato della tecnica, il che ne determina la rispondenza al requisito di novità.

L'obiettivo di questa invenzione è quello di sviluppare un composto che sia strutturalmente diverso dai lattati di omoserina e abbia una capacità selettiva e pronunciata di regolare (sia potenziare che indebolire) il comportamento collettivo mediato da GSL ("quorum sensing") in un certo intervallo di attività biotecnologicamente utili , batteri putrefattivi e patogeni.

Nella presente invenzione, questo problema viene risolto utilizzando un composto a base di tiazolo, completamente descritto dalla formula 1:

La presente invenzione descrive la formula strutturale del composto di formula 1 e i metodi del suo uso pratico per la regolazione del comportamento collettivo (“quorum sensing”) nei batteri.

Secondo la presente invenzione, una preparazione (composizione) regolatoria a base di un derivato tiazolico contiene in peso dallo 0,0001 al 100% di composti di formula 1, il resto sono componenti neutri o sostanze che modificano positivamente (aumenta la biodisponibilità, aumenta la durata d'azione , ecc.) le proprietà di queste composizioni.

Rispetto ai composti che costituiscono l'essenza dei brevetti noti, il composto rivendicato di formula 1 presenta una serie di differenze significative, vale a dire:

in primo luogo, a differenza dei composti noti creati sulla base di un anello lattonico e, a questo proposito, essendo stretti analoghi strutturali delle molecole autoregolatrici naturali - lattoni omoserina, il composto rivendicato è un ligando sintetico strutturalmente diverso. Nessun regolatore “quorum sensing” a base di tiazolo è noto dalla letteratura scientifica e brevettuale disponibile;

in secondo luogo, contrariamente ai noti derivati ​​tiazolici della formula generale 2

il composto rivendicato ha solo una variante di un radicale attaccato covalentemente, corrispondente nella sua posizione a R 4 e completamente descritto da un residuo di acido esanoico simile a quello trovato nella molecola segnale naturale (esanoil-omoserina lattone), in assenza di altri cambiamenti nei radicali R 1 , R 2 e R 3 =H . Inoltre, contrariamente al noto brevetto che prevede l'uso di composti di formula generale 2 come antagonisti dei recettori dell'adenosina, il composto di formula 1 rivendicato è destinato a regolare il comportamento collettivo mediato da GSL ("quorum sensing") nei batteri;

in terzo luogo, a causa delle differenze strutturali rispetto alle molecole autoregolatrici naturali che mostrano attività in molti sistemi simili a luxI/luxR, il composto rivendicato di formula 1 ha un'attività regolatoria selettiva realizzata in relazione al sistema di biosintesi della violaceina regolato da cviI/cviR di Chromobacterium violaceum, e così come altri batteri produttori di violaceina biotecnologicamente utili, putrefattivi e patogeni (vedi esempio 1). In questo caso, la probabile ragione dell'effetto selettivo del composto di formula 1 nei cosiddetti sistemi “quorum sensing” è l'interazione selettiva con la proteina regolatrice CviR e i suoi omologhi stretti, ma non con altre proteine ​​LuxR-simili. A sua volta, la diversità naturale delle proteine ​​simili a CviR determina la possibilità della loro regolazione sia positiva che negativa da parte del composto rivendicato, che in una diversa gamma di batteri produttori di violaceina biotecnologicamente utili, putrefattivi e patogeni si manifesterà sia come aumento ( vedi esempio 1) o come indebolimento (vedi esempio 2) del comportamento collettivo.

Per comprendere l'essenza dell'invenzione, è anche necessario sottolineare che la regolazione del “quorum sensing” ottenuta utilizzando un composto di formula 1 include, ma non è limitata a, solo l'effetto sulla produzione di violaceina, poiché sotto il controllo della proteina regolatrice CviR e dei suoi omologhi si trovano numerosi geni bersaglio (operoni), compresi quelli responsabili della produzione di esoenzimi e della formazione di biofilm. L'uso di un test per l'induzione o l'inibizione della biosintesi della violaceina nella presente invenzione è determinato dalla semplicità e dal contenuto informativo della manifestazione registrata dell'attività regolatoria del composto di formula 1.

Pertanto, il risultato dell'azione del composto di formula 1 è la regolazione specifica di un certo sistema di "quorum sensing", la cui direzione (rafforzamento o indebolimento) è determinata dalle caratteristiche recettoriali delle proteine ​​CviR-simili che lo percepiscono . Pertanto, utilizzando lo stesso composto, è possibile avere un effetto multidirezionale sul comportamento collettivo di vari microrganismi, anche isolati o nella loro coltura mista.

L'uso protetto di un composto di formula 1 implica, tra l'altro, il suo utilizzo per il controllo di processi biotecnologici attuati con l'aiuto di microrganismi produttori di violaceina (riferimento: la violaceina è un derivato indolico formato durante l'ossidazione del triptofano, un pigmento blu-violetto con attività antibatterica, protistocida, antivirale ed altre attività biotecnologicamente e farmacologicamente utili). In questo caso il composto di formula 1 può essere introdotto in mezzi nutritivi solidi o liquidi sotto forma di soluzioni, ed anche utilizzato sotto forma di sostanza pura o immobilizzato su vari supporti.

L'invenzione brevettata prevede anche l'uso di un composto di formula 1 per regolare l'attività di altri geni bersaglio (operoni), compresi quelli coinvolti nei processi di deterioramento dei prodotti agricoli, nonché nello sviluppo di malattie infettive di piante, animali e umani. A questo scopo, questo composto può essere introdotto nell'organismo per fornire un effetto sistemico, e anche applicato localmente per influenzare determinate aree (ad esempio come parte di medicazioni per ferite, quando si tratta il campo chirurgico, ecc.). Il composto può essere utilizzato sotto forma di solidi, soluzioni o sospensioni in acqua o altri solventi, oppure applicato a vari veicoli. È anche possibile utilizzare un composto di formula 1 in composizioni con altre sostanze, comprese quelle che ne modificano positivamente (aumenta la biodisponibilità, durata d'azione) la sua attività biologica.

L'invenzione rivendicata è illustrata, ma non limitata in alcun modo, dai seguenti esempi.

Esempio 1. Stimolazione del comportamento collettivo (“quorum sensing”) nei batteri.

La determinazione della capacità del composto di formula 1 di regolare il “quorum sensing” è stata effettuata utilizzando due sistemi di test batterici, in presenza di esanoil-omoserina lattone (C 6 -GSL)? rispondendo alla sintesi del pigmento violaceina (Chromobacterium violaceum NCTC 13274) o allo sviluppo della bioluminescenza (Escherichia coli pAL103). In questo caso, una caratteristica del primo è stata l'inserimento del trasposone Tn5 nel gene cvil, responsabile della sintesi del proprio C 6 -GSL, con la conservazione del gene cviR funzionalmente attivo e della proteina regolatrice da esso codificata, responsabile della percezione dell'autoinduttore.

Quomm sensing e Chrornobacteriurn violaceum: sfruttamento della produzione di violaceina e inibizione per il rilevamento dei lattoni N-acil omoserina. Microbiologia, 1997, V.143, P.3703-3711]. A sua volta, una caratteristica del secondo ceppo era la presenza del costrutto genetico luxR+luxI_luxCDABE, che codifica per la proteina recettore LuxR di Vibrio fischeri e la presenza di C 6 -GSL o C 6 -oxo-GSL introdotti esogenamente, corrispondenti al sviluppo della luminescenza (bioluminescenza).

Durante il test, C. violaceum NCTC13274 ed Escherichia coli pAL103 sono stati coltivati ​​su terreni nutritivi liquidi in assenza (controllo) e in presenza di C 6 -GSL o composto di formula 1 (esperimento), utilizzato nell'intervallo di concentrazione da 2 a 1000 μM. La caratteristica dell'effetto regolatore era il valore EC50 - la concentrazione dei composti confrontati che provoca l'induzione della formazione del pigmento violaceina o della bioluminescenza del 50% dell'effetto massimo pronunciato in presenza di un segnale naturale. I risultati di tali test sono illustrati nella Figura 1 e riepilogati nella Tabella 1.

Tabella 1. Valutazione dell'effetto del composto di formula 1 sul comportamento collettivo (“quorum sensing”) nei batteri nei test per C. violaceum NCTC13274 ed E. coli pAL103.

Dai dati presentati risulta chiaro che entrambi i microrganismi utilizzati reagiscono intensamente con la sintesi quorum-dipendente della violaceina (C. violaceum NCTC) o con lo sviluppo della bioluminescenza (E. coli pAL103) in presenza dell'autoregolatore naturale C 6 -GSL. A sua volta, il composto di prova di formula 1 agisce in modo meno attivo, ma più specifico, provocando l'induzione della sintesi della violaceina, ma non lo sviluppo della bioluminescenza. Inoltre, tali differenze sono presumibilmente basate sull'affinità selettiva del composto 1 per la proteina CviR che percepisce il segnale regolatorio, in assenza di esso per LuxR.

Un risultato positivo di tale utilizzo dell'invenzione rivendicata è la possibilità di induzione selettiva del “quorum sensing” di alcuni tipi di batteri che fanno parte di associazioni polimicrobiche.

Esempio 2. Soppressione del comportamento collettivo (“quorum sensing”) nei batteri.

La determinazione della capacità del composto di formula 1 di regolare il "quorum sensing" è stata effettuata utilizzando il ceppo Jantinobacterium lividum depositato nella Collezione tutta russa di microrganismi industriali (VKPM) con il numero B-10136. Questo ceppo è un isolato naturale caratterizzato dalla capacità di sintetizzare il pigmento violaceina sotto il controllo di un autoinduttore di natura non identificata.

Durante il test, J. lividum B-10136 è stato coltivato su terreni nutritivi liquidi in assenza (controllo) e in presenza del composto di formula 1 (esperimento), utilizzato nell'intervallo di concentrazione da 2 a 1000 μM. La caratteristica dell'effetto regolatore era il valore EC50 - la concentrazione del composto di formula 1, che causa la soppressione della produzione di violaceina del 50% dell'effetto massimo pronunciato nel controllo.

I risultati di tali test sono illustrati nella Figura 2. Dai dati presentati risulta che il composto testato di formula 1 sopprime la produzione di violaceina (EC50 = 87,5 μM), che lo caratterizza come un inibitore del comportamento collettivo (“quorum sensing”) di J. lividum B-10136.

Un risultato positivo di tale utilizzo dell'invenzione rivendicata è la possibilità di sopprimere il “quorum sensing” di alcuni tipi di batteri, in particolare J. lividum, per prevenire i danni che causano ai prodotti agricoli. La stessa attività può essere utilizzata nel trattamento e nella prevenzione delle malattie infettive delle piante, degli animali e dell'uomo causate da J. lividum e altri microrganismi produttori di violaceina.

L'uso di un derivato tiazolico di formula 1 come regolatore (attivatore o inibitore) del comportamento collettivo ("quorum sensing") nei batteri:

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L'invenzione riguarda un nuovo agente, che sono derivati ​​della rodanina di formula (I), per il trattamento di malattie tumorali di varie localizzazioni. Il risultato tecnico è un agente antiproliferativo e antimetastatico per il trattamento delle malattie tumorali.

Uso proposto di (R)-5--2-(-propylimino)-3-orto-toliltiazolidin-4-one (Composto 1) o di un suo sale per la preparazione di un medicinale per la prevenzione e/o il trattamento di un malattia o disturbo associato al sistema di attivazione immunitaria, in cui il farmaco è una serie di dosi del Composto 1, in cui durante la fase iniziale del trattamento la dose induce desensibilizzazione cardiaca ed è inferiore alla dose finale, e durante la fase iniziale specificata del trattamento la la dose viene somministrata ad una frequenza che garantisce il mantenimento della desensibilizzazione cardiaca fino a quando non si verifica un'altra diminuzione acuta della frequenza cardiaca, e quindi la dose verrà titolata fino alla dose finale del Composto 1; metodo di trattamento e serie di dosi appropriati.

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Comunicazione chimica nei batteri (regolamento Quorum Sensing)

I.A. Khmel, IMG RAS

Negli ultimi anni, l’attenzione di numerosi ricercatori che lavorano con i microrganismi in vari campi della biologia e della medicina è stata attirata da un fenomeno chiamato Quorum Sensing (QS). Il Quorum Sensing (QS) è un tipo speciale di regolazione dell'espressione genica dei batteri, a seconda della densità della loro popolazione. I sistemi QS includono piccole molecole di segnalazione chiamate autoinduttori, che si diffondono facilmente attraverso la parete cellulare, e proteine ​​regolatrici a cui si legano gli autoinduttori (AI). Man mano che la popolazione batterica aumenta e raggiunge un livello critico, gli IA si accumulano fino al valore soglia richiesto e interagiscono con le corrispondenti proteine ​​regolatrici, il che porta ad una forte attivazione (induzione) dell'espressione di alcuni geni nei batteri. Con l'aiuto dell'intelligenza artificiale, viene effettuata la comunicazione batterica: trasferimento intercellulare di informazioni tra individui batterici appartenenti alla stessa o diversa specie, genere e persino famiglia; Pertanto, le molecole segnale sono considerate “parole” in questo peculiare “linguaggio” dei batteri. Grazie alla regolazione QS, i batteri sono in grado di controllare in modo coordinato l’espressione genica in tutta la comunità. Questo comportamento dei batteri mostra somiglianze con gli organismi multicellulari; i batteri sfruttano il comportamento “sociale” che non era loro disponibile come cellule individuali. Il trasferimento di informazioni da cellula a cellula utilizzando i sistemi QS, che porta all'induzione di set di geni specializzati, contribuisce al rapido adattamento delle popolazioni batteriche alle mutevoli condizioni ambientali e alla loro sopravvivenza in condizioni naturali.

La regolazione QS è stata scoperta e descritta per la prima volta all'inizio degli anni '70 in un batterio marino luminoso Vibrione fischeri. In questo batterio è codificata la capacità di bioluminescenza dovuta alla sintesi della luciferasi lux operone ( luxCDABE) e la bioluminescenza si verifica solo ad elevate densità di popolazione batterica (fino a 10¹¹ cellule/ml). V. fischeri vive in simbiosi con alcuni animali marini, nell’organo luminoso specializzato dell’animale. In questa associazione simbiotica, l'animale ospite fornisce al batterio un ricco mezzo nutritivo e il batterio ospite fornisce luce. Ogni organismo eucariotico utilizza la luce per i propri scopi specifici. Ad esempio, una lumaca Euprymna scolope illuminarti con V. fischeri, non proietta ombre alla luce della luna e delle stelle, il che la aiuta a fuggire dai nemici. Pescare Monocentrico japonicus usa la luce per attirare un partner [3].

Per molto tempo si è creduto che la regolamentazione QS fosse un caso molto raro, tuttavia negli ultimi anni è diventato chiaro che questo tipo di regolamentazione è diffusa nei batteri di vari gruppi tassonomici. Attualmente, la regolazione del QS è stata riscontrata in più di 50 specie batteriche. Un'ampia varietà di composti viene utilizzata dai batteri come autoinduttori dei sistemi QS; il numero di IA recentemente scoperte è in aumento. Inoltre, una specie di batteri può utilizzare e riconoscere più di un tipo di molecole di segnalazione.

È stato ora dimostrato che i sistemi regolatori di tipo QS svolgono un ruolo chiave in un gran numero di processi cellulari batterici. Sono coinvolti nell'interazione di molti batteri con organismi superiori, animali e piante, nella regolazione della virulenza batterica, nella formazione di biofilm, nella regolazione dell'espressione genica associata alla sintesi di vari esoenzimi, tossine, antibiotici e altri metaboliti secondari, coniugazione, ecc. L'uso di metodi trascrittomici negli ultimi anni e l'analisi proteomica hanno dimostrato che i sistemi QS funzionano come fattori regolatori globali. Lo studio dei sistemi regolatori del QS, il loro ruolo nel metabolismo e nell'interazione dei batteri definisce un approccio completamente nuovo allo studio del comportamento dei batteri in condizioni naturali; questi studi possono essere di grande importanza pratica.

Il ruolo dei sistemi QS è particolarmente importante nel regolare i processi di interazione dei batteri patogeni con l'organismo eucariotico, l'ospite. Il processo infettivo avviene quando vengono raggiunte popolazioni sufficientemente numerose di batteri patogeni; allo stesso tempo, un aumento della concentrazione di molecole di segnalazione nell'ambiente porta alla sintesi sincrona di fattori di virulenza che contribuiscono alla distruzione dei tessuti corporei. Questa strategia aiuta i batteri a superare con successo la risposta immunitaria dell’organismo ospite.

La capacità dei batteri di formare biofilm è un fattore significativo nella loro patogenicità. I biofilm sono strutture fisiche con caratteristiche uniche formate da comunità microbiche associate alla superficie. La formazione di biofilm è una delle principali strategie che aumentano la sopravvivenza dei batteri nell’ambiente, compreso l’ospite. La capacità dei batteri di esistere come parte dei biofilm crea grandi difficoltà per la pratica medica, poiché ciò aumenta significativamente la resistenza dei batteri all'azione dei farmaci antibatterici, nonché agli effetti dei disinfettanti, fattori ambientali sfavorevoli, come bassi o alti Livelli di pH, elevata forza osmotica, ecc. E l'effetto della difesa immunitaria dell'ospite. La formazione di biofilm batterici su apparecchiature impiantabili (ad esempio cateteri, valvole cardiache artificiali, lenti, ecc.) è la causa di una serie di malattie croniche gravi ed estremamente difficili da trattare. È stato dimostrato che la regolazione QS svolge un ruolo fondamentale nella formazione del biofilm

Il fatto che il QS possa essere un fattore importante nella regolazione della virulenza batterica ha portato a una nuova direzione di ricerca che prevede l’uso del regolamento QS come potenziale bersaglio per la lotta contro le malattie infettive. Si ipotizza che l’inibizione del funzionamento dei sistemi QS possa fornire nuovi trattamenti, portando all’effettiva trasformazione dei batteri patogeni in batteri non patogeni senza l’uso di antibiotici e altri farmaci comunemente usati. Attualmente, questo approccio è considerato una nuova strategia promettente per la terapia antimicrobica. Un gran numero di laboratori ricercano e studiano sostanze che sopprimono il QS. Di seguito considereremo i sistemi QS conosciuti nei batteri e le prospettive per la creazione di una nuova generazione di farmaci volti direttamente a sopprimere la patogenicità dei batteri.

QuorumRilevamento sistemi nei batteri loromeccanismi molecolari

le loro azioni

QSsistemi batterici gram-negativiLuxI- LuxRtipo.

Nei batteri Gram-negativi, i sistemi QS meglio studiati sono quelli che funzionano con la partecipazione degli autoinduttori N-acil-omoserina lattone (AHL o AI-1). Gli AHL includono un anello lattone omoserina e gruppi acilici laterali. Sono stati descritti più di 40 AHL, che differiscono per la lunghezza delle catene aciliche nella molecola. La specificità dell'azione dell'AHL è determinata dal numero di gruppi acilici (da C4 a C16) e dalla presenza di alcuni gruppi aggiuntivi. Gli AHL contenenti corte catene aciliche si diffondono liberamente attraverso le membrane cellulari; Gli AHL con lunghe catene aciliche richiedono un trasporto attivo per uscire dalle cellule. AHL interagisce con proteine ​​regolatrici omologhe alla proteina LuxR Vibrione fischeri, che costituiscono la famiglia delle proteine ​​LuxR-simili. Le molecole di queste proteine ​​contengono due domini che determinano il legame della proteina all'AHL e al DNA. Quando l'AHL si attacca, la configurazione della proteina simile a LuxR cambia, permettendole di legarsi al DNA e funzionare come attivatore di trascrizione.

La biosintesi dell'AHL in diversi batteri studiati a questo proposito coinvolge la S-adenosil metionina (SAM) (formazione dell'anello lattone omoserina) e la proteina trasportatrice del gruppo acilico ACP.

Sistemi QS funzionanti con la partecipazione di AHL sono stati trovati in un gran numero di batteri gram-negativi, compresi i generi Agrobatterio, Aeromonas, Burkholderia, Cromobatterio, Citrobacter, Enterobatteri, Erwinia, Hafnia, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Rodobatteri, Rizobio, Serratia, Vibrione, Yersinia ecc. Tra questi ci sono batteri patogeni e fitopatogeni.

La regolamentazione QS è stata studiata in modo più dettagliato lux operone Vibrione fischeri. Coinvolge due principali componenti regolatori: 1) proteina LuxI (sintasi

autoinduttore) è responsabile della produzione di N-(3-ossoesanoil)-omoserina lattone (3OC12-HSL); 2) La proteina LuxR lega l'autoinduttore e quindi il complesso LuxR-3OC12-HSL, legandosi al promotore lux operone, ne attiva la trascrizione, che porta alla sintesi della luciferasi e all'emissione di luce. Quando la cultura Vibrione fischeri cresce, 3OC12-HSL si accumula fino a un livello soglia, sufficiente per attivare LuxR e legarlo alla regione del promotore lux operone e induzione di questo operone. Perché il gene autoinduttore della sintasi LuxI fa parte di questo operone, la quantità di AI in queste condizioni aumenta notevolmente, il che porta a un'ulteriore induzione lux sintesi dell'operone e della luciferasi.

Tra i batteri patogeni, i sistemi QS sono i meglio studiati Pseudomonas aeruginosa. Nelle celle Pseudomonas aeruginosa, un patogeno umano opportunistico che causa gravi infezioni del tratto respiratorio, un gran numero di geni, compresi i geni responsabili della sintesi dei fattori di virulenza, vengono attivati ​​da due sistemi QS del tipo LuxI-LuxR: LasI-LasR e RhlI-RhlR. La proteina LasI è responsabile della produzione dell'autoinduttore N-3 (ossododecanoil) omoserina lattone (3OC12-HSL), la proteina RhlI è una N-butanoil omoserina lattone (C4-HSL) sintasi ed è coinvolta nella regolazione della formazione del biofilm. Il sistema LasI-LasR regola la sintesi dei fattori di virulenza secreti responsabili della distruzione dei tessuti dell'ospite all'avvio di un processo infettivo: l'elastasi, codificato dal gene lasB, una proteasi codificata da lasA, un'esotossina codificata toxA, fosfatasi alcalina codificata dal gene aprA. Il sistema LasR-LasI QS attiva anche l'espressione dei geni del secondo sistema QS P. aeruginosa, RhlI-RhlR, portando alla sua induzione. Il complesso della proteina RhlR con il corrispondente autoinduttore C4-HSL induce l'espressione di due geni regolati dal sistema QS del primo tipo, lasB E aprA, E. molti altri geni importanti per la virulenza dei batteri e la loro sopravvivenza in condizioni naturali. È stato dimostrato che l'espressione di più di 600 geni P. aeruginosa controllato da QS.

È stato dimostrato che 3OC12-HSL può avere un effetto diretto sull'organismo: le molecole 3OC12-HSL interagiscono con componenti del sistema immunitario, come le interleuchine, modulando la risposta immunitaria dell'organismo alle infezioni P. aeruginosa; inibire la proliferazione dei linfociti, la differenziazione delle cellule T, la produzione di citochine, ridurre la produzione di fattori di necrosi tumorale; le iniezioni di questo composto hanno indotto un processo infiammatorio nei topi.

U P. aeruginosa è stato scoperto un autoinduttore di natura diversa: 2-eptil-3-idrossi-4-chinolone (denominato PQS). PQS regola parzialmente l'espressione del gene dell'elastasi lasB insieme ai due sistemi QS sopra descritti. L'espressione di PQS richiede la proteina LasR e PQS, a sua volta, attiva la trascrizione genica rhI.

Pertanto, i sistemi QS sono coinvolti nel controllo della virulenza P. aeruginosa in una rete normativa complessa e gerarchica.

Lo ha rivelato l’esame microscopico dei polmoni di pazienti affetti da fibrosi cistica (FC). P. aeruginosa vive lì principalmente come parte di biofilm. È stato dimostrato che le cellule P. aeruginosa, portando lasI mutazione, non formano biofilm maturi, la formazione dei biofilm si ferma allo stadio di microcolonie. Queste mutazioni potrebbero essere integrate dall'aggiunta esogena dell'autoinduttore 3OC12-HSL. Ricerca condotta con P. aeruginosa, hanno dimostrato che la formazione di biofilm può essere un fattore critico nella colonizzazione polmonare da parte di questo patogeno.

Un altro batterio patogeno in cui viene studiato attivamente il ruolo del QS nella regolazione della virulenza è Burkholderia cepacia, contiene il sistema CepI-CepR QS coinvolto nella regolazione dei fattori di patogenicità (esoproteasi, siderofori). La sintesi degli autoinduttori che regolano il QS N-ottanoil-omoserina lattone (C8-HSL) e N-esanoil-omoserina lattone (C6-HSL) in questo batterio è molto debole. E 'stato mostrato. che nella maggior parte dei pazienti affetti da fibrosi cistica i polmoni erano stati infettati contemporaneamente B. cepacia E P. aeruginosa. Allo stesso tempo, la comunicazione interspecie tra questi batteri potrebbe aumentare la patogenicità B. cepacia. Quindi, aggiungendo fluido di coltura P. aeruginosa alle culture B. cepacia ha portato ad un aumento significativo dell'attività dell'esoproteasi e della produzione di siderofori. Questo è stato il primo esempio in cui un batterio poteva regolare la produzione dei suoi fattori di patogenicità attraverso la sintesi dell'IA da parte di un altro batterio. Lo studio di tali caratteristiche del comportamento dei batteri in condizioni naturali apre nuovi aspetti importanti per l'epidemiologia. In effetti, l'epidemiologia non tiene conto di situazioni del tutto possibili in cui l'interazione di batteri non patogeni - produttori di AHL e batteri debolmente patogeni (o praticamente non patogeni in determinate condizioni) può portare allo sviluppo di un'infezione. I dati attualmente disponibili sollevano urgentemente la questione della necessità di una ricerca seria sulla comunicazione di vari batteri in condizioni naturali e sui meccanismi molecolari di tale comunicazione.

QSnei batteri gram-positivi

Nei batteri gram-positivi, diversi sistemi coinvolti nel controllo della virulenza in Stafilococco aureola, nella regolazione della competenza (cioè la capacità di accettare DNA esogeno durante la trasformazione) in Streptococco polmonite, regolazione della competenza e della sporulazione in Bacillo subtilis. I peptidi secreti, AIP, sono utilizzati come autoinduttori dei sistemi QS nei batteri gram-positivi. Tra questi ci sono peptidi lineari e peptidi contenenti un anello tiolattone. Sono riconosciuti da recettori specifici: istidina chinasi sensoriale bicomponente legata alla membrana. Le molecole di segnalazione peptidica non si diffondono attraverso la membrana cellulare; Apparentemente, gli esportatori di peptidi sono responsabili del loro rilascio dalla cellula nell’ambiente. Nella maggior parte dei casi si verifica l'elaborazione e la modifica dei peptidi. Diversi batteri gram-positivi sintetizzano diverse molecole di segnalazione peptidica. Il meccanismo di segnalazione opera attraverso una cascata di fosforilazione/defosforilazione. La chinasi del sensore viene fosforilata, dopo di che il gruppo fosforilico viene trasferito alla proteina corrispondente, il regolatore della risposta. Il regolatore della risposta fosforilata si lega al DNA e attiva la trascrizione del gene bersaglio.

Il sistema meglio studiato è QS. Stafilococco aureola. S. aureola utilizza una strategia bifasica per l'infezione di un macroorganismo. A basse densità di popolazione batterica (il primo stadio dell'infezione), le cellule producono fattori proteici che ne promuovono l'attaccamento e la colonizzazione; ad alta densità di popolazione (secondo stadio), i batteri reprimono la sintesi di questi fattori e in essi inizia la secrezione di tossine e proteasi; questa fase è regolata dal sistema Agr QS. Il sistema include il peptide autoinduttore AIP e agrBDCA-operone. Gene agrD codifica i geni AIP agrC E agrA- due proteine ​​bicomponenti, chinasi sensore, AgrC e AgrA. Gene agrB codifica per una proteina che esporta e modifica l'AIP (aggiunge un anello tiolattone). Il legame di AIP ad AgrC provoca la fosforilazione di AgrA. AgrA fosforilato induce l'espressione dell'RNA regolatore (RNAIII), che sopprime l'espressione dei fattori di adesione cellulare durante la seconda fase dell'infezione. AgrA attivato induce anche l'espressione aggr operone, che provoca l'induzione della sintesi AIP.

Si conoscono quattro gruppi S. aureola, sintetizzando AIP con sequenze diverse. È interessante notare che ciascun tipo di AIP attiva il proprio recettore AgrC, ma inibisce l'attivazione delle proteine ​​​​recettrici negli altri tre gruppi a causa del legame competitivo con queste proteine; di conseguenza, l’AIP di ciascun gruppo di stafilococchi sopprime l’attivazione della cascata di virulenza degli altri tre gruppi S. aureola. In accordo con questa strategia, il peptide AIP purificato degli stafilococchi del gruppo II sopprime la virulenza S. aureola gruppo I durante l'infezione dei topi.

Il secondo meccanismo QS operativo in S. aureola, include la proteina RAP (nota anche come proteina ribosomiale L2) e la proteina TRAP; quest'ultimo è un fattore di trascrizione citoplasmatica. La TRAP nel suo stato fosforilato attiva l'RNA III; la sua fosforilazione è stimolata dalla proteina RAP. Virulenza S. aureola può essere inibito dal peptide RIP (peptide inibitore dell'RNA III). Il peptide RIP inibisce la fosforilazione della proteina TRAP, portando all'inibizione della sintesi dell'RNA III, che porta alla soppressione della sintesi delle tossine e alla ridotta virulenza cellulare. La fosforilazione della TRAP può anche essere inibita in presenza di AIP; ciò dimostra che una complessa rete di trasduzione del segnale è coinvolta nella regolazione della patogenesi S. aureola.

In altri batteri gram-positivi, gli streptomiceti, tra i quali sono i principali produttori di sostanze antibiotiche utilizzate in medicina, composti di diversa natura - γ-butirrolattoni - vengono utilizzati come autoinduttori dei sistemi QS. Il QS in questi batteri è coinvolto nella regolazione della loro differenziazione morfologica e nella produzione di metaboliti secondari. È interessante notare che le molecole di segnalazione degli streptomiceti sono strutturalmente simili ai lattoni N-acil0-omoserina dei batteri Gram-negativi. Non è noto, tuttavia, se esista in natura una comunicazione tra questi gruppi di batteri tassonomicamente distanti che utilizzano queste molecole di segnalazione.

QSsistema che utilizza l'autoinduttoreA.I.-2

L'autoinduttore AI-2 è stato scoperto per la prima volta nelle cellule Vibrione Harveyi; È un composto dalla struttura insolita, un diestere di furanosil borato. L'AI-2 si accumula nella seconda metà della fase di crescita esponenziale, ma il suo contenuto diminuisce drasticamente quando la coltura entra nella fase stazionaria.

AI-2 sintasi è la proteina LuxS codificata dal gene luxS; geni luxS altamente omologhi in diversi batteri. In effetti, il gene luxS presente nella metà di tutti i genomi batterici sequenziati.

L'AI-2 viene prodotto dalla S-adenosilmetionina attraverso tre fasi; Il substrato della LuxS sintasi è la S-adenosil-omocisteina, che viene ulteriormente convertita in adenina, omocisteina e 4,5-diidrossi-2,3-pentanedione (DPD). Il DPD, un prodotto altamente reattivo che si riorganizza facilmente ed entra in ulteriori reazioni, può formare molecole di segnalazione che vari tipi di batteri riconoscono come AI-2. Recentemente è stata determinata la struttura di un'altra molecola di segnalazione, AI-2. Salmonella typhimurium; questa sostanza di natura furanica è diversa da AI-2 V. Harveyi, Compreso, non contiene un atomo di boro. È stato dimostrato che questi due AI-2 e i loro precursori formati da DPD possono essere in equilibrio in condizioni naturali e facilmente interconvertirsi. Si ritiene che la comparsa del boro nella molecola AI-2 V. Harveyi potrebbe essere dovuto all'elevata concentrazione di questo elemento nell'acqua di mare dove vive questo batterio; allo stesso tempo, la sua concentrazione nelle condizioni di vita S. typhimurium molto inferiore. La presenza di boro nella molecola AI-2 V. Harveyi e la sua assenza in AI-2 S. typhimurium, Apparentemente sono essenziali per l'azione di questi autoinduttori nelle cellule degli organismi che li producono.

Pertanto, questi ancora pochi studi sui sistemi QS comprendenti autoinduttori del tipo AI-2 hanno dimostrato che, utilizzando una via biosintetica conservativa utilizzando l'enzima LuxS, i batteri sintetizzano intermedi di molecole di segnalazione, il cui ulteriore destino può essere determinato dalle caratteristiche di l'ambiente.

U Vibrione Harveyi la proteina del sensore del recettore è LuxP, che lega direttamente l'AI-2. Il complesso LuxP-AI-2 interagisce con l'istidina chinasi legata alla membrana LuxQ. A basse densità di popolazione batterica, LuxQ viene fosforilato e il fosfato viene trasferito alla proteina citoplasmatica LuxU, e quindi da questa proteina alla proteina regolatrice legante il DNA LuxO. Successivamente, si verifica una complessa catena di eventi, inclusa l'attivazione di geni che codificano cinque piccoli RNA regolatori da parte della proteina fosfo-LuxO e della subunità sigma 54 della RNA polimerasi; questi RNA interagiscono con la proteina chaperone dell'RNA Hfq, che porta al legame e alla destabilizzazione dell'mRNA che codifica per l'attivatore della trascrizione LuxR. LuxR è richiesto per l'attivazione trascrizionale lux operone Vibrione Harveyi; a basse densità di popolazione batterica mRNA luxR degrada e di conseguenza non c'è bioluminescenza. Ad elevate densità di popolazione batterica, la quantità di AI-2 aumenta notevolmente, il che porta alla defosforilazione della proteina LuxO. LuxO non fosforilato non può indurre l'espressione di piccoli RNA regolatori. Di conseguenza, la traduzione dell'mRNA diventa possibile luxR, Sintesi proteica LuxR e bioluminescenza. Pertanto, l’eventuale accumulo di AI-2 provoca l’attivazione dell’espressione genica lux operone. Di grande interesse è il fatto che nel regolamento lux operone V. Harveyi Tre tipi di autoinduttori dei sistemi QS interagiscono tra loro: AI-2, AHL (tab.) e CAI-1.

Al momento, la questione del ruolo dell’AI-2 come molecola di segnalazione e regolatore dell’espressione genica in vari batteri rimane insufficientemente studiata e richiede ulteriori ricerche.

Per quanto riguarda i batteri patogeni basati sullo studio di mutanti con un gene inattivato lux S, questo gene, considerato il gene AI-2 sintasi, ha dimostrato di essere coinvolto nella regolazione dell'espressione di geni associati alla virulenza di ceppi enteropatogeni E. coli, Vibrione colera, Streptococco piogene. I sistemi QS di questo tipo sono regolatori globali dell'espressione genica batterica; quindi, è stato dimostrato lux S è coinvolto nella regolazione della trascrizione di 242 geni E. coli, costituendo il 5,6% del genoma di questo batterio.

Tra i batteri della famiglia Enterobatteriacee I sistemi QS di Tipo II sono i più studiati E. coli E S. typhimurium. U S. typhimurium sono stati trovati geni che codificano per un tipo di recettore AI-2 diverso dal recettore AI-2 LuxP V. Harveyi. Questo è un trasportatore dipendente dall'ATP chiamato LsrB (regolato da LuxS). Lo stesso recettore AI-2 è stato trovato in altri membri della famiglia Enterobatteriacee. Una volta all'interno della cellula, l'AI-2 viene fosforilato e si lega alla proteina LsrR. In assenza di AI-2, la proteina LsrR reprime lsr operone. L'AI-2 si accumula nella seconda metà della fase di crescita esponenziale; il suo contenuto nel mezzo diminuisce drasticamente quando la coltura entra nella fase stazionaria. Celle E. coli E S. typhimurium importare AI-2 entrando in fase stazionaria tramite il trasportatore Lsr.

Basato su uno studio sull'effetto delle mutazioni che inattivano il gene lux S, si è concluso che LuxS sintasi è coinvolta nella regolazione dell'espressione genica correlata alla virulenza nei ceppi patogeni E. coli EHEC ed EPEC - controllano l'espressione del sistema di secrezione di tipo III, che è codificato dai geni del locus LEE, è coinvolto nella regolazione della migrazione cellulare, nella formazione di biofilm, nella sintesi delle tossine, ecc. L'analisi trascrittomica ha mostrato che LuxS è un regolatore globale di EHEC, che controlla l'espressione di oltre 400 geni. È stata pubblicata una grande quantità di dati che dimostrano che le mutazioni nel gene lux S portano all'assenza della sintesi AI-2 e hanno un effetto significativo sui processi cellulari di vari batteri della famiglia Enterobatteriacee: S. marcescens, Serratia sp. , Erwinia carotovora E amylovora.

Tuttavia, negli esperimenti sulla complementazione delle mutazioni nel gene lux S utilizzando AI-2 isolato e sintetizzato chimicamente, si è scoperto che non tutti i fenotipi dipendono da lux S , controllato direttamente da AI-2. Il ruolo regolatore dell'AI-2 è dimostrato proprio per la bioluminescenza del ceppo V. Harveyi BB170 ed espressione lsr- operone S. typhimurium. Questi risultati hanno mostrato che i dati sull’influenza dell’AI-2 su alcune proprietà delle cellule precedentemente considerate dipendenti dal sistema QS di tipo II dovrebbero essere riconsiderati tenendo conto del fatto che la sintesi dell’AI-2 non è l’unica funzione di LuxS sintasi. Nelle cellule batteriche con geni inattivati lux La S-ribosil-omocisteina si accumula, poiché non avviene la sua ulteriore scissione in omocisteina e DPD. In questo caso, il livello di omocisteina nella cellula, necessario per la sintesi della metionina, diminuisce drasticamente e la cellula utilizzerà altri percorsi per la sua formazione, in particolare attraverso l'ossalacetato. Di conseguenza, i cambiamenti nell’espressione di vari geni in lux I mutanti S possono essere determinati non (o non solo) dalla regolazione del QS, ma anche da gravi disturbi nel metabolismo batterico che causano effetti pleiotropici.

Per rispondere alla domanda se l'influenza è correlata lux S-mutanti per vari fenotipi batterici con un mancato funzionamento dei sistemi QS basati su AI-2, o è il risultato di effetti pleiotropici nei disordini metabolici, è stata effettuata un'analisi dei database genomici per la presenza di geni per noti AI- 2 recettori (recettore LuxP Vibrio Harveyi e il recettore Lsr S. typhimurium) È stato suggerito che la dipendenza dei fenotipi dalla regolazione del QS di tipo II sia limitata principalmente agli organismi portatori dei geni del recettore AI-2 e il cambiamento dei fenotipi nei lux S i mutanti che non contengono questi geni possono essere spiegati da disturbi nel metabolismo cellulare. L'analisi genomica ha permesso di stabilire la presenza di recettori AI-2 simili a Lsr nei rappresentanti della famiglia Enterobatteriacee, ad esempio E. coli, Photorhabdus luminescens, Klebsiella pneumoniae,Yersinia spp., Shigella dissenterie E Shigella flexneri, Salmonella spp.

Omologhi dei recettori AI-2 noti non sono stati trovati nelle banche pubblicate di sequenze geniche e proteiche di generi batterici Serratia E Erwinia. Sebbene non fosse inaspettata la mancanza del sensore chinasi a due componenti LuxPQ (questo recettore è stato finora trovato solo nei membri della famiglia Vibrionaceae), l'assenza del complesso del recettore Lsr nel genoma di questi batteri è stata una sorpresa. Questo fatto solleva seri dubbi sull’esistenza di sistemi QS funzionanti con la partecipazione di AI-2 e suggerisce un ruolo prevalentemente metabolico per LuxS in questi batteri. Anche se, ovviamente, non possiamo escludere la possibilità che debbano ancora essere studiati i recettori AI-2.

Pertanto, le funzioni delle sostanze del tipo AI-2 possono differire nei diversi batteri. Tuttavia, anche nei casi in cui queste sostanze come parte dei sistemi QS non sono regolatori dell'espressione genica della cellula ospite, possono, una volta rilasciate nell'ambiente, partecipare alla regolazione dei processi cellulari di altri batteri nella popolazione, eseguendo la loro comunicazione. Relazioni simili sono state dimostrate per popolazioni miste artificiali di batteri costituite da cellule E. coli E V. Harveyi, E V. colera, con cui può coesistere E. coli nel corpo umano.

Sistemi QS che utilizzano un autoinduttoreA.I.-3 e ormoni

L'AI-3 è stato descritto per la prima volta come un componente del terreno di coltura utilizzato di un ceppo dell'agente patogeno EHEC, che attivava l'espressione dei geni responsabili dell'adesione batterica alle cellule eucariotiche. Gli esperimenti per studiare la struttura dell'AI-3 hanno dimostrato che si tratta di un composto di natura aromatica ed è stato suggerito che l'AI-3 abbia una natura aminoacidica. Tuttavia, la struttura e il meccanismo di sintesi di questa molecola di segnalazione non sono stati ancora completamente determinati. Si presume che, come nel caso dell'AHL, esista un'intera famiglia di composti simili all'AI-3. È stato dimostrato che la sintesi dell'AI-3 è indipendente dal gene lux S V E. coli, a differenza della sintesi AI-2. È stato scoperto che l'AI-3 attiva la trascrizione dei geni di virulenza del locus LEE nei ceppi EHEC E. coli. Per determinare l'AI-3, sono stati ottenuti biosensori: ceppi E. coli K-12, contenente costrutti nel cromosoma basati sui geni del locus LEE e sul gene reporter lac Z. Utilizzando biosensori, si è scoperto che vari batteri della microflora intestinale, ceppi non patogeni E. coli E Enterobatteri cloache e specie patogene Shigella, Salmonella E Klebsiella, sintetizzare

Perché l'AI-3 funzioni E. coliè richiesto un sistema a due componenti, incluso il sensore chinasi QseC e il regolatore di risposta QseB. In presenza di AI-3 nello spazio periplasmatico, QseC viene prima fosforilato, quindi trasferisce il fosfato a QseB, che si lega ai promotori corrispondenti e provoca l'attivazione dell'espressione del proprio gene e dei geni flhDC-operone responsabile della sintesi dei flagelli. L'AI-3 è anche coinvolto nella regolazione dei geni del locus LEE. Responsabile della regolazione di questi geni è stato scoperto un sistema a due componenti, chiamato QseEF.

I sistemi QseCB e QseEF, oltre ad AI-3, rispondono ad un'altra classe di molecole di segnalazione: gli ormoni catecolaminici, in particolare epinefrina/norepinefrina (o adrenalina/norepinefrina), sintetizzati dall'organismo ospite. L'analisi dei genomi batterici ha dimostrato che le cascate di segnalazione AI-3/epinefrina/norepinefrina sono presenti in un gran numero di specie batteriche.

QSe l'apoptosi nei batteri.

Oltre ai sistemi QS sopra descritti, E. coli È stato scoperto un sistema QS che funziona con la partecipazione di peptidi come molecole di segnalazione, coinvolte nella regolazione dell'apoptosi batterica. L'apoptosi o morte cellulare programmata (PCD) è un programma geneticamente determinato di morte cellulare negli organismi eucarioti multicellulari. La PCS contribuisce al normale funzionamento del sistema biologico, liberandolo dalle cellule danneggiate che hanno completato il loro ciclo vitale o da cellule potenzialmente pericolose che compaiono a causa di mutazioni. Sistemi con una funzione simile sono stati trovati nei procarioti. Un analogo procariotico dell'apoptosi può essere considerato la morte di parte della popolazione cellulare batteri in condizioni di arresto della crescita della popolazione, ad esempio nella fase stazionaria della crescita quando il substrato nutritivo è esaurito o sotto l'influenza di fattori di stress. Come risultato della morte e dell'autolisi di alcune cellule, le restanti cellule viventi possono utilizzare i prodotti dell'autolisi come substrato nutritivo e continuare a crescere, sintetizzando i componenti cellulari necessari, utili per la sopravvivenza delle popolazioni batteriche. La PKC può facilitare lo scambio di informazioni genetiche all'interno di una popolazione batterica quando il DNA viene rilasciato attraverso la lisi cellulare. Inoltre, la distruzione delle cellule con danni all’apparato genetico è benefica anche per la popolazione batterica.

I meccanismi genetici della PCD nei sistemi procariotici non sono stati completamente chiariti. Molta attenzione è stata prestata allo studio dei sistemi tossina-antitossina (sistemi TA) presenti in Escherichia coli e altri batteri. I moduli TA sono costituiti da una coppia di geni nei genomi batterici: un gene che codifica per una tossina stabile che causa la morte cellulare e un gene che codifica per un'antitossina labile che inibisce l'attività delle tossine; i geni della tossina sono co-trascritti con i corrispondenti geni dell'antitossina come parte di un operone.

Sistema E. coli maz E.F. è uno dei sistemi AT più studiati. Gene maz F codifica per una proteina citotossica stabile e maz E è un'antitossina instabile che viene degradata dalla serina proteasi ATP-dipendente ClpAP. La tossina MazF è un'endoribonucleasi che taglia preferenzialmente gli mRNA a filamento singolo nella sequenza ACA e agisce anche sull'RNA 16S nel centro di decodificazione della subunità ribosomiale 30S, con conseguente inibizione della sintesi proteica. Finché MazE e MazF sono espressi insieme, MazE interagisce con MazF per neutralizzare i suoi effetti tossici. Nelle cellule che crescono normalmente, la tossina e l'antitossina formano un complesso stabile, che impedisce alla tossina di esercitare un effetto tossico. In condizioni di stress che interferiscono con l'espressione maz EF, le proteasi indotte dallo stress distruggono MazE e, di conseguenza, la tossina stabile MazF può agire sugli RNA cellulari, portando alla morte cellulare e all'autolisi della maggior parte della popolazione.

maz L'apoptosi mediata da EF dipende dalla densità di popolazione ed è regolata dal fattore QS EDF (fattore di morte extracellulare). EDF è un pentapeptide lineare Asn-Asn-Trp-Asn-Asn. È stato scoperto che EDF aumenta l'attività di MazF In vitro. Allo stesso tempo, l’attivazione di MazF ha portato ad un aumento della sintesi di EDF, che a sua volta ha causato un aumento della morte cellulare in condizioni di stress. È stato rilevato il legame sito-specifico diretto di EDF e MazF. I risultati degli studi mostrano che il sistema QS coinvolto nella regolazione dell’apoptosi in E. coli, radicalmente diversi dai sistemi QS sopra descritti Enterobatteriacee: 1) EDF è l'unica molecola segnale di natura peptidica presente in E. coli; 2) la maggior parte delle molecole conosciute coinvolte nel funzionamento di QS controllano l'espressione genica a livello trascrizionale e EDF a livello posttrascrizionale.

Recentemente sono stati scoperti diversi piccoli peptidi QS che differiscono nella sequenza aminoacidica dell'EDF, sintetizzato da un batterio gram-negativo Pseudomonas aeruginosa e Gram-positivi Bacillo subtilis, che potrebbe essere coinvolto nella regolazione della morte cellulare controllata maz E.F. . Ciascuno di questi peptidi, nonostante le differenze nella struttura, ha attivato l'attività endoribonucleolitica di MazF E. coli, apparentemente interagendo con vari siti di questa proteina. Pertanto, è stata scoperta una famiglia di peptidi QS EDF, che in futuro potrebbe diventare la base per ottenere un nuovo tipo di regolatori che attivano PKC.

I suddetti sistemi QS e gli autoinduttori coinvolti nel loro funzionamento non esauriscono tutti quelli attualmente conosciuti; il numero di quelli di nuova apertura è in costante aumento.

InibizioneQSsistemi batterici: un nuovo approccio alla creazione di farmaci contro la patogenicità

Uno dei problemi più importanti della medicina moderna è la crescente diffusione di batteri patogeni resistenti ai farmaci tradizionali. Questo problema è particolarmente evidente nella diffusa prevalenza delle infezioni ospedaliere, che oggi si registrano in oltre il 20% dei pazienti ricoverati nei reparti di terapia intensiva. La diffusione di forme di batteri patogeni resistenti ai farmaci, che riduce l’efficacia e deprezza un numero crescente di farmaci tradizionali comunemente usati, e la necessità di sviluppare modi per sopprimere la formazione di biofilm da parte dei batteri solleva la questione di nuove strategie per combattere le malattie infettive , la creazione di una nuova generazione di farmaci che influenzano specifici sistemi biochimici di microrganismi.

Attualmente è generalmente accettato che uno degli “obiettivi” più promettenti di questo tipo sia la regolamentazione del Quorum Sensing. I sistemi QS, come notato sopra, sono coinvolti nella regolazione della virulenza batterica e nella formazione di biofilm.

Si propone di chiamare i farmaci volti a sopprimere i sistemi QS “veleni patogenici”, perché essi, a differenza dei classici farmaci antimicrobici (antibiotici principalmente), non hanno un effetto battericida o batteriostatico sui batteri patogeni e quindi non creano una pressione selettiva che porta alla formazione di forme di batteri patogeni resistenti alle sostanze antibatteriche. Recentemente si sono formate all'estero aziende biotecnologiche che mirano a sviluppare agenti che inibiscono la regolazione del QS e, di conseguenza, riducono la patogenicità dei batteri e prevengono la formazione di biofilm.

La soppressione del funzionamento dei sistemi QS può essere ottenuta in diversi modi.

1. Soppressione della sintesi di autoinduttori QS sistemi

Come accennato in precedenza, la S-adenosilmetionina (SAM) è un substrato per la sintesi di due tipi di sistemi autoinduttori AHL e AI-2 QS. È stato dimostrato che vari analoghi della SAM, ad esempio la S-adenosilomocisteina, la S-adenosilcisteina, agivano come forti inibitori della sintesi di AHL in Pseudomonas aeruginosa. Va notato che l'interazione dell'AHL sintasi con la SAM sembra essere molto specifica, nonostante il fatto che la SAM sia un precursore comune in molte vie biochimiche procariotiche ed eucariotiche. Ciò ci consente di sperare che gli analoghi della SAM possano essere utilizzati come inibitori specifici della sintesi di autoinduttori dei sistemi regolatori del QS batterico senza influenzare gli enzimi eucariotici.

È stato dimostrato che alcuni antibiotici - macrolidi, inibitori della sintesi proteica a livello ribosomiale, sopprimono la sintesi di AHL e alcuni fattori di virulenza a concentrazioni che non inibiscono la crescita batterica. Ad esempio, concentrazioni subinibitorie di eritromicina hanno soppresso la sintesi di AHL e dei fattori di virulenza emolisina, proteasi ed emoagglutinine nell’organismo. Pseudomonas aeruginosa. I batteri esposti all’antibiotico erano meno virulenti per i topi. Questi dati erano coerenti con i risultati delle osservazioni cliniche che mostrano l'efficacia dell'uso di basse dosi di eritromicina e altri macrolidi per le infezioni causate da ceppi P. aeruginosa, resistenti a questi antibiotici. Azitromicina ad una concentrazione di 2 μg/ml, che non inibisce la crescita P. aeruginosa, ha soppresso la sintesi di AHL, così come la produzione di fattori di virulenza elastasi e ramnolipidi. Inoltre, l’aggiunta di AHL in modo esogeno alla coltura ha portato al ripristino della produzione di questi fattori di virulenza, indicando che era la sintesi di AHL il bersaglio primario dell’antibiotico. Il meccanismo d’azione degli antibiotici macrolidi sulla sintesi dell’AHL rimane attualmente poco chiaro.

2. Inibizione del legame degli autoinduttori al corrispondente

proteine ​​regolatrici .

La soppressione del funzionamento dei sistemi regolatori del QS può essere ottenuta utilizzando molecole antagoniste autoinduttrici che interferiscono con il legame dell'AI alle molecole proteiche del recettore. È stato dimostrato che tali inibitori possono essere competitivi con l’AHL; in questo caso sono strutturalmente vicini alla molecola segnale dell’autoinduttore e si legano al sito di legame dell’AHL con la proteina recettore, ma non attivano questa proteina. Gli inibitori non competitivi possono avere poca o nessuna somiglianza con l'AHL; questi composti si legano a diversi siti sulla proteina recettore. Attualmente tali inibitori vengono studiati attivamente; La ricerca degli inibitori competitivi viene effettuata utilizzando la progettazione assistita da computer.

Sono stati ottenuti dati sull'inibizione della regolazione del QS da parte degli analoghi dell'AHL che apportano modifiche in varie parti delle molecole dell'AHL - nelle catene aciliche e nell'anello lattone omoserina. È stato dimostrato che la lunghezza della catena acilica è essenziale per l'attività dell'AHL. Gli analoghi dell'AHL con catene aciliche più lunghe dell'AHL nativo potrebbero essere inibitori dell'attività dei sistemi QS. La sostituzione dei gruppi 3-osso nelle molecole AHL con gruppi 3-idrossile o metilici e l'introduzione di legami insaturi nelle catene aciliche porta ad una significativa diminuzione dell'attività AHL.

Le modifiche nell'anello lattone omoserina delle molecole AHL influenzano significativamente la loro attività. Gli AHL naturali sono l-isomeri; gli isomeri d generalmente non mostrano attività biologica. La presenza di una catena acilica sembra essere necessaria per l'attività biologica dell'AHL. La sostituzione dell'anello lattone omoserina con un anello lattone omocisteina ha ridotto l'attività dell'AI di un ordine di grandezza e la sostituzione con un anello lattamico omoserina ha comportato l'assenza di proprietà attivanti o antagoniste in questa molecola. Tuttavia, le molecole in cui l'omoserina lattone è sostituita dall'omoserina tiolattone possono rimanere attive nel funzionamento di alcuni sistemi QS.

Quando si studia l'effetto degli analoghi del sistema AHL Las P. aeruginosa con sostituzioni nell'anello lattone omoserina, è stato dimostrato che l'atteggiamento verso queste sostituzioni era diverso nel caso dell'interazione di questi analoghi con le proteine ​​RhlR e LasR. Questo fatto potrebbe indicare che le due proteine ​​recettore P. aeruginosa differiscono in modo significativo in

i loro siti di legame per AHL.

Recentemente è stata prestata molta attenzione agli antagonisti naturali degli autoinduttori QS, ai derivati ​​​​del furanone, compresi quelli alogenati. Si è scoperto che le alghe rosse australiane Delisea pulchra sintetizza vari tipi di furanoni alogenati; i loro prodotti impediscono la colonizzazione di queste alghe da parte di batteri marini, in cui il sistema QS è coinvolto nella regolazione dei processi metabolici, e quindi protegge le piante dall'azione dei batteri. Furanoni D. pulchra contengono un anello furanico con una catena acilica sostituita nella posizione C-3 e atomi di bromo nella posizione C-4. Le sostituzioni nella posizione C-5 possono variare. I furanoni provenienti da fonti naturali sono alogenati in varie posizioni con atomi di bromo, iodio o cloro.

Dopo aver scoperto l'effetto dei furanoni si formarono D. pulchra, in vari laboratori è stato effettuato un ampio screening di sostanze di origine naturale e la produzione di sostanze chimicamente sintetizzate, derivati ​​furanonici e inibitori QS. Tra questi c'erano derivati ​​furanonici con catene aciliche di varia lunghezza. È stato dimostrato che anche un derivato furanonico senza catena acilica con due atomi di bromo era un inibitore del sistema QS P. aeruginosa. Si è scoperto che i derivati ​​del furanone sono prodotti da vari organismi: alghe marine verdi, rosse e brune, funghi, ascidie, attinomiceti, ecc.

Uno studio del meccanismo d'azione di queste sostanze sul sistema QS ha dimostrato che i composti di natura furanonica competono con AHL per il sito di legame con le proteine ​​​​recettrici di tipo LuxR. Il legame dei furanoni alla proteina recettore influenza la stabilità del complesso proteina-ligando, portando ad una rapida scissione della proteina recettore.

L'azione dei furanoni ha comportato l'inibizione dei processi cellulari regolati dal QS: bioluminescenza Vibrione fischeri; produzione di fattori di virulenza, inclusa la formazione di biofilm, e patogenesi P. aeruginosa; virulenza Erwinia carotovora. Molti furanoni sintetizzati chimicamente erano significativamente più efficaci di quelli naturali. È di grande interesse il fatto che i furanoni sintetici siano attivi contro i batteri nei biofilm alle stesse concentrazioni rispetto alla regolazione del QS dei batteri planctonici, in contrasto con l’azione degli antibiotici classici usati per combattere le infezioni P. aeruginosa; in quest'ultimo caso la concentrazione dell'antibiotico durante la crescita batterica nei biofilm avrebbe dovuto essere 100-1000 volte superiore.

L'uso dell'analisi trascrittomica ha permesso di determinare che l'aggiunta di composti furanonici alle cellule influenza l'espressione di 93 geni P. aeruginosa PAO1; il funzionamento dell'80% di questi geni era regolato con la partecipazione di sistemi QS, ad esempio geni che codificano per elastasi, proteasi LasA, coinvolti nella sintesi di ramnolipidi, fenazine, cianuro, chitinasi.

Recentemente è stato dimostrato che un derivato furanonico è prodotto dalle alghe D. pulchra, (5Z)-4-bromo-5-(bromometilene)-3-butil-2(5H)-furanone, ha inibito il QS nelle cellule Escherichia coli con la partecipazione dell'autoinduttore AI-2; questo composto ha anche soppresso la formazione di biofilm e causato la repressione di 56 geni E. coli, il 79% dei quali sono stati indotti da AI-2. Quando esposta a questo composto, la concentrazione extracellulare di AI-2 veniva dimezzata; si presume che questo effetto sia avvenuto a livello post-trascrizionale.

I dati sopra riportati mostrano che i derivati ​​del furanone sono promettenti per ottenere agenti terapeutici basati su di essi contro la patogenicità dei batteri. Tuttavia, i composti attualmente testati con effetti inibitori della regolazione QS sono tossici per uso medico. Un compito urgente è la loro modifica e la ricerca di nuove sostanze non tossiche per uso pratico.

I batteri e gli organismi eucarioti producono sostanze di diversa natura che sopprimono la regolazione del QS nei batteri: dipeptidi ciclici (dichetopiperazine); sono stati menzionati sopra come collegamenti in grado di attivare il sistema QS. Si ritiene che interagiscano anche con i siti di legame AHL per le proteine ​​​​recettrici.

3. Degradazione AHL .

La degradazione degli autoinduttori dei sistemi QS è uno dei modi promettenti per combattere le infezioni batteriche regolate da questi sistemi. La degradazione dell'AHL può essere una conseguenza dell'azione di enzimi specifici di batteri e organismi superiori; inoltre, possono decomporsi a seguito dell'idrolisi alcalina, a pH elevato, a temperature elevate quando crescono i batteri. Attualmente viene effettuato uno screening attivo per gli enzimi che degradano l'AHL, principalmente le lattonasi che distruggono l'anello lattone dell'omoserina.

Lattonasi che idrolizzano l'AHL sono state trovate nei bacilli; la proteina corrispondente è stata denominata AiiA. È stato dimostrato che la presenza di questo enzima nelle cellule batteriche determina in gran parte la loro capacità di sopprimere i batteri fitopatogeni, la cui virulenza è regolata da sistemi QS che coinvolgono AHL. Trasferimento del gene ricombinante AHL-lattonasi nelle cellule Pseudomonas fluorescens ha aumentato la capacità del ceppo di biocontrollare le malattie delle piante causate da batteri fitopatogeni. Inoltre, è stato dimostrato che le piante transgeniche contengono il gene introdotto aiiA, espressi nella pianta erano significativamente meno suscettibili alle infezioni Erwinia carotovora. Introduzione del gene aiiA nelle cellule di questo fitopatogeno hanno ridotto la sintesi di AHL e, di conseguenza, hanno ridotto l'attività degli enzimi pectolitici e la manifestazione di altri sintomi di marciume vegetale. Si sta studiando anche il potenziale delle acilasi AHL prodotte dai batteri di degradare l'AHL.

Gli organismi superiori mostrano anche meccanismi per la degradazione specifica dell'AHL. Di grande interesse sono i dati secondo cui le cellule epiteliali respiratorie umane sono in grado di inattivare l'AHL P. aeruginosa– 3OC12HSL, ma non C4-HSL. Questa inattivazione sembra essere di natura enzimatica. Anche altri AHL, come C6-HSL, sono soggetti a degradazione. La capacità di degradare l'AHL è stata riscontrata in alcune cellule di mammiferi, ma non in tutte. Questa scoperta apre una nuova area di ricerca e fa sperare che il corpo umano abbia un’altra linea di difesa contro le infezioni batteriche, attraverso l’interazione con la regolazione QS della virulenza batterica.

La ricerca e lo studio degli enzimi che degradano gli autoinduttori dei sistemi QS rappresenta un nuovo modo promettente per ottenere agenti terapeutici mirati a combattere le infezioni batteriche.

4. Soppressione QS sistemi di batteri gram-positivi.

Virulenza Stafilococco aureola, controllati dai sistemi QS, possono essere inibiti dai peptidi RIP naturali, dai loro analoghi sintetizzati chimicamente e dai peptidi chimerici. Questi peptidi competono con il peptide RAP, inibendo la fosforilazione della proteina TRAP e di conseguenza sopprimono la sintesi di RNAIII, che porta all'inibizione della virulenza batterica. È stato notato che i peptidi RIP inibiscono la formazione di biofilm in vivo S. aureola E S. epidermide. L'efficacia dei peptidi è stata dimostrata utilizzando vari animali infettati S. aureola. L'uso simultaneo di peptidi RIP e antibiotici ha fornito un effetto sinergico, portando alla sopravvivenza del 100% dei topi infetti S. aureola. È anche possibile sfruttare l'effetto inibitorio dell'AIP sul QS S. aureola, come menzionato sopra.

I dati ottenuti supportano il potenziale utilizzo di peptidi che interagiscono con i sistemi QS degli stafilococchi per combattere le infezioni cliniche causate da questi batteri. Un altro approccio per la terapia antibatterica dei batteri gram-positivi è la vaccinazione del corpo con proteine, componenti del sistema QS. Ad esempio, è stato dimostrato che la vaccinazione dei topi con la proteina RAP li proteggeva dalle infezioni S. aureola.

Conclusione

Studi approfonditi sulla regolazione del Quorum Sensing condotti negli ultimi anni hanno dimostrato che i sistemi QS effettuano una regolazione globale di un gran numero di processi cellulari in batteri di vari gruppi tassonomici. Questo tipo di regolazione sembra essere diffusa nei batteri. È stata scoperta un'ampia gamma di regolatori a basso peso molecolare con diverse strutture coinvolte nei processi di regolazione del QS; il numero di composti identificati con attività simile è in aumento. La regolamentazione QS richiede certamente una ricerca dettagliata e approfondita. I meccanismi molecolari del funzionamento dei sistemi QS di vario tipo sono stati scarsamente studiati; in molti casi non è chiaro quali proprietà dei batteri siano controllate da questi regolatori; I sistemi QS e il loro ruolo nel metabolismo batterico sono stati studiati solo per un piccolo numero di batteri.

Recentemente è stato dimostrato che gli autoregolatori dei sistemi QS non funzionano solo nei batteri; la loro influenza sui processi cellulari è stata scoperta anche negli organismi eucarioti. L'influenza diretta di 3OC12-HSL (AHL, coinvolto nella regolazione della virulenza) è stata notata sopra P. aeruginosa) su alcune proprietà delle cellule di mammifero. Si scoprì che l'organismo vegetale ( Medicago truncatula) è in grado di rispondere agli AHL batterici (3OC12-HSL e 3OC16-HSL, prodotti rispettivamente dal patogeno P. aeruginosa e pianta simbionte Sinorhizobium meliloti). Utilizzando la proteomica, è stato determinato che questi AHL causano cambiamenti globali nella produzione di oltre 150 proteine ​​vegetali. Inoltre, hanno indotto la secrezione da parte delle piante di sostanze che potrebbero interagire con la regolazione del QS dei batteri, inibendo o stimolando il QS.

Apparentemente, gli organismi eucariotici, piante e animali, nel processo di evoluzione hanno acquisito la capacità di riconoscere i segnali QS e di rispondere ad essi, producendo sostanze che sono strutturalmente simili a queste molecole segnale e sono loro concorrenti, oltre a sintetizzare enzimi che distruggono questi segnali. molecole. Gli eucarioti possono utilizzare strategie terapeutiche naturali contro la colonizzazione e l'invasione di batteri patogeni come risultato dell'inibizione dei processi guidati dal QS.

Quanto sopra indica che lo studio dei sistemi di regolazione del QS rappresenta un nuovo vasto campo di attività per i ricercatori nei vari campi della biologia e della medicina; Questo fenomeno merita la massima attenzione dei ricercatori. L'identificazione e lo studio dei sistemi QS di vari microrganismi possono rivelare molte cose nuove nella regolazione dei processi cellulari.

Particolare attenzione è rivolta allo studio della partecipazione dei sistemi QS nella regolazione dei processi associati alla patogenicità dei batteri. Come mostrato sopra, il ruolo significativo del QS nella regolazione della sintesi dei fattori di virulenza nei batteri apre la possibilità di un approccio fondamentalmente nuovo alla creazione di farmaci per la terapia antibatterica - farmaci volti direttamente a sopprimere la regolazione del QS e, di conseguenza , sopprimendo la patogenicità dei batteri. Attualmente vengono condotte ricerche e screening intensivi sugli effetti di varie sostanze ottenute da fonti naturali e come risultato della sintesi chimica sulla regolazione del QS e sull'espressione dei geni correlati al QS. Sono state rilevate interazioni con QS di sostanze legate ai polifenoli; Perché I polifenoli sono diffusi nel regno vegetale e si ritiene siano importanti nella protezione delle piante dai batteri patogeni. È stato dimostrato che numerose sostanze prodotte dalle piante sono in grado di interagire con i sistemi QS; la natura di queste sostanze è allo studio.

Attualmente, ci sono tutte le ragioni per credere che i farmaci che inibiscono il QS possano rappresentare un’alternativa promettente ai farmaci tradizionali per la terapia antibatterica in medicina, agricoltura e tecnologia alimentare. O, almeno, potranno potenziare l’effetto antimicrobico dei farmaci utilizzati. Il lavoro in questa direzione viene svolto attivamente in molti laboratori e aziende in diversi paesi del mondo.

"Antibiotici e chemioterapia", 2003, 48(10): 32-39.

L'articolo è stato pubblicato con il gentile permesso di Olga Efremenkova
Vladimirovna, testa. settore della ricerca di composti naturali
Istituto di ricerca per la ricerca di nuovi antibiotici dal nome. G.F. Gause RAMS

Segnali di comunicazione dei batteri

V.D. georgiano

Istituto di ricerca per la ricerca di nuovi antibiotici dal nome. G. F. Gause RAMS, Mosca

V.D. Gruzina. Segnali comunicativi dei batteri

G.F. Istituto Gause di Nuovi Antibiotici, Accademia Russa delle Scienze Mediche, Mosca

Attualmente si assiste al passaggio dal concetto tradizionale di batteri come organismi strettamente unicellulari al concetto di comunità microbiche come strutture integrali che regolano le loro reazioni comportamentali in base ai cambiamenti delle condizioni di vita.

Colonie di quasi tutti i tipi di batteri dimostrano la capacità di differenziazione cellulare e di organizzazione multicellulare. Questa capacità si manifesta in modo più evidente durante la crescita dei batteri nei loro habitat naturali, dove formano varie strutture multicellulari: biofilm, tappeti batterici, corpi fruttiferi, ecc.

Il concetto di “quorum sensing” è stato proposto nel 1994. Significa la percezione da parte delle cellule dei cambiamenti nell'ambiente che si verificano quando una coltura batterica raggiunge un certo numero di soglia e una reazione a questi cambiamenti.

I processi descritti che si verificano solo con una densità di popolazione sufficientemente elevata includono i seguenti fenomeni:

• Bioluminescenza nei batteri marini Vibrio fisheri E V.harveyi;
• aggregazione di cellule mixobatteriche e successiva formazione di corpi fruttiferi con spore;
• sporulazione in bacilli e attinomiceti;
• stimolazione della crescita degli streptococchi e di numerosi altri microrganismi;
• coniugazione con trasferimento plasmidico Enterococcus faecalis e specie affini, nonché nei batteri del genere Agrobatterio;
• sintesi di esoenzimi e altri fattori di virulenza nei patogeni vegetali ( Erwinia carotovora, E.hyacinthii ecc.) e animali ( Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus);
• formazione di antibiotici nei rappresentanti del genere Streptomiceti e a E. carotovora;
• formazione di biofilm in P. aeruginosa e altri microrganismi.

Vengono rivelati i meccanismi di molti di questi processi e vengono identificati i fattori di comunicazione intercellulare responsabili dei processi che dipendono dalla densità di popolazione.

Un problema serio nella pratica clinica è l’ampia distribuzione di forme resistenti di microrganismi, che riduce l’efficacia dell’uso dei farmaci antibatterici. Una sfida particolare è l’aumento della resistenza ai farmaci dei batteri nei biofilm. I batteri spesso utilizzano reazioni di rilevamento del quorum per sintetizzare fattori di virulenza, antibiotici e formare biofilm. Pertanto, lo studio dei meccanismi di tali reazioni apre nuove opportunità per la prevenzione e il trattamento delle malattie causate da agenti microbici e consente anche di dare uno sguardo diverso al complesso complesso delle interazioni batteriche interspecie negli habitat naturali dei microrganismi.

I meccanismi delle reazioni di rilevamento del quorum differiscono nei batteri gram-positivi e gram-negativi, quindi è consigliabile considerarli separatamente.

Reazioni di rilevamento del quorum nei microrganismi gram-positivi

I batteri Gram-positivi comunicano tipicamente utilizzando molecole di segnalazione oligopeptidiche. La trasduzione del segnale nella maggior parte dei casi coinvolge un meccanismo di fosforilazione a due componenti. Di norma, lo stato di quorum viene raggiunto quando una popolazione di cellule batteriche entra nella fase stazionaria di crescita. È in questo momento che vengono rilevate le molecole di segnalazione, con l'aiuto delle quali le cellule entrano in contatto tra loro. Lo schema generale di comunicazione dei batteri gram-positivi può essere rappresentato come segue: in primo luogo, nella cellula viene sintetizzato un precursore che, una volta modificato, si trasforma in un oligopeptide maturo. Quest'ultimo viene escreto all'esterno della cellula dall'esportatore. Le molecole di oligopeptidi si accumulano nello spazio intercellulare man mano che aumenta la densità delle cellule batteriche. Una chinasi sensore bicomponente che attraversa la membrana riconosce il segnale e lo trasmette nella cellula attraverso una cascata di fosforilazione. Nella cellula, la molecola oligopeptidica interagisce con il gene(i) bersaglio.

Un classico sistema quorum-dipendente del peptide può essere considerato un sistema responsabile del trasferimento coniugativo di plasmidi in Enterococcus faecalis e specie batteriche affini. Questo sistema stimola la proliferazione di tratti nella popolazione microbica che sono importanti per l'interazione tra il microrganismo e l'animale ospite, nonché per l'eliminazione della competizione. Il plasmide pPDl, trasportato da un sistema peptidico quorum-dipendente, è responsabile della sintesi delle emolisine, il plasmide pCDl per la formazione della batteriocina, il plasmide pCFlO per la resistenza E.faecalis alla tetraciclina. Ciascun esa- o ottapepeptide induce l'adesione delle cellule batteriche e la loro coniugazione con trasferimento dal donatore al ricevente di uno specifico plasmide. Ad esempio, l'ottapeptide cPDl stimola il trasferimento coniugativo del plasmide pPDl. Il plasmide codifica per un recettore situato sulla proteina repressore dell'operone corrispondente. L'interazione dell'oligopeptide con il recettore provoca la dissociazione del repressore dal DNA, innescando così la sintesi del prodotto corrispondente. Il plasmide pPDl comprende anche il gene traC, il cui prodotto è una proteina che facilita la penetrazione del peptide attraverso la parete cellulare. I segnali oligopeptidici vengono sintetizzati intensamente da cellule che non portano i corrispondenti plasmidi (riceventi), mentre nelle cellule donatrici la sintesi di tali segnali è soppressa; inoltre, il plasmide codifica per un peptide inibitorio.

Il prodotto del plasmide pPDl è il peptide iPDl, HHaKTHBHpyiounmcPDl.

Un altro processo sensibile al quorum trovato in E.faecalis, è la produzione di due fattori di virulenza: gelatinasi (GelE) e serina proteasi (SprE).

Un esempio dell'uso di un segnale peptidico per le interazioni intercellulari è il sistema di rilevamento del quorum, che controlla la sintesi delle esotossine nella fase logaritmica tardiva della crescita in Staphylococcus aureus. In questo sistema, la proteina AgrD viene sintetizzata come un precursore costituito da 46 aminoacidi, che, durante l'esportazione da parte della proteina AgrB, viene convertito in un peptide maturo AIP (peptide autoinducente), costituito da 8 aminoacidi. L'AIP è riconosciuto dal sensore chinasi a due componenti AgrC, che trasmette un segnale nella cellula attraverso la fosforilazione del regolatore di risposta AgrA. AgrA~P attiva la trascrizione dei geni bersaglio, stimola la trascrizione dell'operone agrB, D, C, A (circuito autoregolatorio positivo) e “inibisce” anche la trascrizione dei geni che codificano per altre esotossine. Basato sulle differenze nell'AIP e nel suo recettore, i ceppi S. aureus possono essere classificati in quattro o più gruppi. Gli oligopeptidi sintetizzati da uno dei gruppi inducono patogenicità in questo gruppo e sopprimono specificamente i sistemi di virulenza Agr in altri gruppi.

L’emergere della competenza nella fase logaritmica tardiva della crescita Streptococco pneumoniae. Il gene comC codifica per un precursore costituito da 41 residui aminoacidici. Quest'ultimo viene convertito in un peptide maturo costituito da 17 residui di aminoacidi durante l'interazione con il sistema di esportazione del peptide (sistema ABC), formato dai prodotti dei geni comAB. Il peptide contatta il suo recettore sulla superficie cellulare: l'istidina chinasi, un prodotto del gene comD. L'istidina chinasi attivata fosforila il prodotto del gene comE. Man mano che le cellule si accumulano, il numero di segnali peptidici aumenta e raggiunge un livello critico nell'ambiente. Di conseguenza aumenta la quantità di proteina comE fosforilata che, a partire da una certa concentrazione, si lega al promotore dell'operone comCDE, stimolandone il lavoro (circuito autoregolatorio positivo), attiva il promotore dell'operone comAB (sistema di esportazione delle proteine ​​dalla cellula ), attiva l'operone comCX, che comprende l'intera catena dei geni della competenza tardiva; responsabile del legame e dell'assorbimento del DNA in trasformazione e di tutti gli altri stadi finali della trasformazione.

Oltre agli esempi sopra riportati di reazioni di rilevamento del quorum nei batteri gram-positivi, va notato che, oltre agli oligopeptidi, i batteri gram-positivi utilizzano anche sostanze di diversa natura chimica come molecole segnale. Quindi, tra i rappresentanti dell'ordine Actinomiceti Insieme alle molecole segnale peptidiche sono state scoperte sostanze a basso peso molecolare, la maggior parte delle quali contiene un gruppo lattone.

Negli streptomiceti, i sistemi di rilevamento del quorum coinvolgono i butirrolattoni e i loro corrispondenti recettori proteici, che regolano congiuntamente lo sviluppo morfologico e la formazione di antibiotici nei loro produttori. Il regolatore degli actinomiceti più studiato è il fattore A, che è il 2-iso-capriloil-3-idrossimetil-γ-butirrolattone.

L'influenza del fattore A sulla differenziazione morfologica e sulla formazione di antibiotici è soggetta allo schema generale di funzionamento dei regolatori degli streptomiceti contenenti un gruppo lattone. Durante le fasi iniziali della crescita, quando le concentrazioni del fattore A sono basse, il recettore del fattore A (AgrA) si lega e reprime l'espressione di un ipotetico attivatore comune della biosintesi e della sporulazione della streptomicina. Quando si isola AgrA dal lisato cellulare S.griseusÈ stato dimostrato che l'IFO 13350 è una proteina composta da 276 aminoacidi e un peso molecolare di 29,1 kDa.

Quando la densità della coltura aumenta, la concentrazione del fattore A raggiunge un livello critico al quale si lega ad AgrA, provocando la dissociazione di quest'ultimo dal DNA e, quindi, attivando la trascrizione del gene chiave adpA, che codifica per AdpA (una proteina costituita da 405 aminoacidi contenenti un sito di legame nella regione centrale con il DNA, simili ai regolatori della trascrizione della famiglia di proteine ​​AraC/XylS). AdpA, a sua volta, è un regolatore positivo dell'attivatore citoplasmatico rilevato del cluster genetico della biosintesi della streptomicina e degli attivatori del processo di sporulazione. L'attivatore citoplasmatico, legandosi al DNA nella regione del promotore del gene per la regolazione specifica del cluster di biosintesi della streptomicina strR, induce la trascrizione di questo gene, che si trova dopo di esso, il gene per la resistenza al proprio antibiotico - aphD, il gene adsA, che codifica per il fattore a extracitoplasmatico della RNA polimerasi, necessario per la formazione del micelio aereo, nonché gene sgmA, che codifica per una proteina peptidasi, che è coinvolta, insieme ad altri enzimi idrolitici, nella degradazione delle proteine ​​del micelio substrato come risultato della formazione del micelio aereo. Il prodotto regolatore del gene strR determina l'inizio della trascrizione dei geni della biosintesi strutturale come parte di un cluster di promotori dipendenti da StrR. L'inizio dell'espressione del promotore del gene strR sotto l'influenza di un attivatore citoplasmatico garantisce anche la produzione del prodotto del gene aphD - l'aminoglicoside fosfotransferasi, e quindi la creazione di un livello base di resistenza del ceppo al proprio antibiotico.

È stato dimostrato che in diverse specie di streptomiceti esiste omologia tra gli elementi strutturali dei regolatori. Sequenze nucleotidiche omologhe al gene agrA S.griseus, sono stati trovati anche in altri streptomiceti. Ad esempio, a S.coelicolor A3 (2), sono stati scoperti due geni srgA e srgB, che codificano per le proteine ​​simili ad AgrA srgA e srgB, che sono simili al 90,7% tra loro e al 35% simili ad AgrA.

Reazioni di rilevamento del quorum nei microrganismi gram-negativi

In più di 450 specie di batteri Gram-negativi sono stati trovati sistemi quorum-dipendenti in cui vari acil omoserina lattoni fungono da molecole di segnalazione. Lo schema generale di comunicazione dei batteri gram-negativi può essere rappresentato come segue: nel sistema di rilevamento del quorum dei batteri gram-negativi, le proteine ​​​​della famiglia Luxl sono sintasi autoinduttrici e catalizzano la formazione di specifiche molecole autoinduttrici di acil omoserina lattone. Gli autoinduttori si diffondono liberamente attraverso la membrana e si accumulano all’aumentare della densità cellulare. Le proteine ​​della famiglia LuxR si legano agli autoinduttori correlati quando viene raggiunta una concentrazione sufficientemente elevata di molecole di segnalazione. Il complesso LuxR, un autoinduttore, si lega al promotore dei geni bersaglio, innescandone la trascrizione.

Genere batteri Erwinia (E. carotovora, E.chrysanthemii) - agenti patogeni delle piante. Abbattono le pareti cellulari vegetali utilizzando pectinasi e cellulasi. La produzione di questi enzimi è un importante fattore di virulenza e dipende dalla densità di popolazione. U Erwinia il sistema genetico expI-expR funziona in modo simile al sistema luxI-luxR in V.fisheri. Le reazioni di quorum sensing coinvolgono anche un sistema regolatorio fornito dalla trascrizione dei geni rsmA-rsmB. Dalla densità di popolazione E. carotovora Dipende anche dalla sintesi dell'antibiotico carbapenemico. La produzione di questo antibiotico è sotto il controllo del cluster genetico carA-carH e potrebbe essere necessaria per eliminare i microrganismi concorrenti nel locus dell'infezione della pianta.

Viene mostrato un altro esempio dell'uso dei lattoni omoserina come molecole di segnalazione Pseudomonas aeruginosa- un agente patogeno per gli animali. Patogenicità dentro P. aeruginosa a causa di un’ampia gamma di fattori di virulenza. Alcuni di essi sono associati alla cellula (pili, adesine, lipopolisaccaridi), altri vengono secreti (proteasi, ramnolipidi, esoenzima S, esotossina A, antibiotico piocianina, ecc.). La formazione di molti dei fattori di virulenza extracellulare è controllata da sistemi di interazione intercellulare. I componenti centrali di tali interazioni sono i sistemi di rilevamento del quorum las e rhl, che attivano l'espressione genica a seconda della densità cellulare del microrganismo. Ciascun sistema è rappresentato da due geni: uno codifica per un enzima con l'aiuto del quale viene sintetizzato uno specifico autoinduttore: l'omoserina lattone acilato (lasl/rhll); l'altro codifica per un attivatore trascrizionale al quale si lega il corrispondente autoinduttore (lasR/rhIR). L'autoinduttore dei sistemi las e rhi è l'N-(3-ossododecanoil)-L-omoserina lattone (3-oxo-C12-HSL), per la cui esportazione dalla cellula viene utilizzato un sistema speciale, chiamato MexEF-OprN -pump e N-butirril-L-omoserina lattone (C4-HSL), rispettivamente.

Il sistema LAS controlla l'espressione dei geni che codificano per fattori di virulenza come l'elastasi A, B e la proteasi alcalina; sistema rhi - enzimi per la biosintesi dei ramnolipidi, piocianina. Recentemente è stata scoperta una terza molecola di segnalazione coinvolta nelle reazioni di rilevamento del quorum P. aeruginosa- 2-eptil-3-idrossi-4-chinolone (PQS). Questa molecola di segnalazione può controllare il livello di espressione di las B, che codifica l'elastasi Las B, nonché il livello di espressione di rhil, che codifica la sintasi C4-HSL.

Batterio Agrobacterium tumefaciens provoca la formazione di galle della corona in molte specie vegetali. Le galle sono un analogo vegetale di un tumore maligno e si formano a seguito del trasferimento di frammenti di DNA oncogenico dai batteri nel nucleo di una cellula vegetale tramite plasmidi Ti. Alcuni dei geni del plasmide Ti determinano la sintesi delle opine da parte delle cellule vegetali, che fungono da substrato nutritivo per A.tumefaciens. Il sistema genetico omologo luxI-luxR traI-traR stimola la diffusione dei plasmidi Ti nella popolazione batterica. Il DNA plasmidico tende a diffondersi in tutta la popolazione batterica e, una volta creato un “quorum” sufficiente, induce le cellule che trasportano il plasmide a coniugarsi con altre cellule batteriche. Allo stesso tempo, il trasferimento coniugativo dei plasmidi Ti dipende dalle opine. In particolare, la trascrizione di traR è stimolata dal fattore OccR attivato dall'octopina.

Rilevamento del quorum nelle formazioni multicellulari

La capacità dei batteri di formare biofilm è interessante perché i rappresentanti degli agenti patogeni per l'uomo e gli animali mostrano resistenza all'azione delle sostanze antimicrobiche quando crescono nei biofilm. I biofilm sono comunità batteriche altamente ordinate che consentono ai batteri di vivere in uno stato attaccato. I biofilm possono essere costituiti da uno o più tipi di batteri. Sono permeati da una rete di canali d'acqua che forniscono nutrienti ai membri della comunità e rimuovono i prodotti metabolici. All’interno di un singolo biofilm si possono osservare diversi modelli di espressione genetica, suggerendo che i singoli membri della comunità hanno “responsabilità specifiche” che, se combinate con altre, migliorano la vitalità dell’intero consorzio.

I biofilm si formano nei polmoni da un microrganismo patogeno P. aeruginosa. Lo spessore di un tale biofilm è di diverse centinaia di micrometri. Le microcolonie in un biofilm maturo si trovano in una matrice polisaccaridica extracellulare. All'interno del biofilm si riscontra eterogeneità: in esso è presente un gradiente di ossigeno - una diminuzione della concentrazione di ossigeno dalla periferia verso l'interno. Si prevede che si troveranno gradienti simili per pH e nutrienti. Questi gradienti forniscono variabilità fisiologica tra le singole cellule del biofilm: ad esempio, le cellule in profondità crescono molto più lentamente che in periferia. Il batterio in un biofilm così maturo è fenotipicamente resistente agli agenti battericidi. Pertanto, i biofilm causano vari tipi di infezioni batteriche croniche. Formazione di biofilm nel P. aeruginosaè sotto il controllo delle reazioni di rilevamento del quorum. Le mutazioni del gene lasI interrompono la maturazione del biofilm, poiché la proteina LasI non sintetizza 3-oxo-C12-HSL e la formazione del microfilm non continua dopo la fase di microcolonia. Il ruolo di C4-HSL nei processi di formazione rimane sconosciuto. I biofilm formati dai mutanti della proteina LasI sono sensibili ai detergenti, mentre i biofilm normali sono resistenti. Ciò dà motivo di pensare che la terapia mirasse a interrompere la regolazione del meccanismo di rilevamento del quorum P. aeruginosa, può portare all'arresto della formazione del biofilm, che aumenterà la sensibilità di questo batterio agli agenti antimicrobici.

Formazione di biofilm in un batterio patogeno Burkholderia cepacia determinato anche dal "quorum sensing". Quando cresce nei biofilm, questo microrganismo è simile P. aeruginosa mostra una significativa resistenza agli agenti antimicrobici.

Interazioni interspecifiche dei microrganismi

La comunicazione interspecifica nei batteri può servire a sincronizzare le funzioni specializzate delle specie in un gruppo. La diversità presente in una determinata popolazione può aumentare la sopravvivenza dell’intera comunità. Inoltre, le interazioni produttive basate sul quorum sensing possono contribuire allo sviluppo di organizzazioni batteriche multispecie, come i biofilm, nonché alla creazione di specifiche associazioni simbiotiche con ospiti eucariotici.

Le interazioni interspecifiche dei microrganismi sono state studiate in modo più approfondito utilizzando l'esempio della comunità microbica della cavità orale e della superficie dei denti umani. Sono state identificate circa 500 specie di batteri nei biofilm sulla superficie dei denti, che funzionano come una comunità coordinata con comunicazioni intra e interspecifiche. Gli streptococchi costituiscono dal 60 al 90% dei batteri che colonizzano la superficie dei denti entro le prime quattro ore dalla pulizia dal dentista. Tra le altre specie di "primi colonizzatori" ci sono rappresentanti Actinomiceti, Capnocitofagi, Eikenella, Emofilo, Prevotella, Propionibatterio E Veillonella.

È probabile che le modalità di comunicazione tra cellule geneticamente identiche differiscano da quelle della comunicazione interspecie. Non ci sono prove della presenza tra le molecole di segnalazione dei batteri orali di rappresentanti tipici della famiglia degli acilomoserina lattoni, che regolano l'espressione genica intraspecifica nei batteri Gram-negativi.

La principale molecola di segnalazione nelle comunicazioni interspecie è AI-2. Ciò è confermato dalla scoperta del gene luxS, che codifica l'enzima necessario per la sintesi della molecola AI-2, in diversi generi di batteri orali.

L'AI-2 è stato scoperto per la prima volta in un batterio luminescente marino Vibrio Harveyi, per cui è una molecola segnalatrice che regola il processo di bioluminescenza. Successivamente, la presenza di AI-2 è stata dimostrata in più di 30 specie di batteri, inclusi microrganismi gram-positivi e gram-negativi.

A volte può essere utile per un gruppo di batteri influenzare negativamente il ciclo di reazione di rilevamento del quorum di un gruppo di batteri concorrenti. La ricerca in questo settore rivela diversi esempi di strategie di rilevamento del quorum che sfruttano popolazioni di batteri coesistenti. COSÌ, Staphylococcus epidermidis utilizza un peptide per controllare il livello della sua virulenza agr e per sopprimere la virulenza Staphylococcus aureus.

Sottoporre a tensione Bacillo sp. 240B1 dimostra la capacità di inattivare enzimaticamente gli acil omoserina lattoni, segnalando molecole di batteri Gram-negativi. È stato dimostrato che in presenza dell’AIA, un’omoserina lattonasi costituita da 250 aminoacidi, le molecole di omoserina lattoni prodotte dal patogeno nelle piante vengono distrutte Erwinia sagotovora. Geni omologhi al gene aiiA sono stati trovati anche in 16 sottospecie Bacillus thuringiensis Pertanto, questi microrganismi sono anche in grado di degradare i lattoni dell'omoserina.

Batterio del suolo Paradosso di Variovorax può utilizzare acil omoserina lattoni come unica fonte di carbonio e azoto. Questo fatto indica che nei loro habitat naturali V.paradosso può crescere su acil omoserina lattoni, beneficiando del miglioramento competitivo nell’ambiente. In questo caso, l'enzima che distrugge i lattoni acilomoserina è diverso dall'AiiA-lattonasi: si tratta di un'amminoacilasi che scinde l'anello lattonico dal gruppo acilico.

Poiché i sistemi di rilevamento del quorum controllano la virulenza in molti agenti patogeni animali e vegetali, questi sistemi possono essere considerati potenziali bersagli per gli agenti antimicrobici. Innanzitutto, una strategia consiste nell'inibire la sintesi delle molecole precursori dell'acil omoserina lattone o degli stessi acil omoserina lattoni. In secondo luogo, i sistemi che controllano il rilascio e la diffusione degli acil-omoserina lattoni possono fungere da bersagli farmacologici. In terzo luogo, gli antagonisti simil-lattone dell'acilomoserina possono competere con gli lattoni dell'acilomoserina per il legame con gli omologhi LuxR. In quarto luogo, è possibile utilizzare enzimi che scompongono gli acil omoserina lattoni, nonché anticorpi contro queste molecole. Infine, come è stato recentemente dimostrato, i geni aiiA che codificano per lattonasi che degradano gli acil omoserina lattoni possono essere introdotti nel genoma della pianta, dove, quando espressi, potrebbero fornire protezione alla pianta ospite dai microrganismi patogeni. Pertanto, le piante di tabacco transgeniche con il gene aiiA incluso hanno resistito con successo all'infezione E. carotovora.

Citochine batteriche

È stato scoperto che i microrganismi procarioti sintetizzano sostanze simili agli ormoni dei vertebrati (compresi gli steroidi e gli ormoni polipeptidici, come l'insulina). Prove crescenti evidenziano l’importanza delle interazioni cellula-cellula mediate chimicamente nelle colture batteriche per eventi quali sporulazione, coniugazione, virulenza e bioluminescenza. Pertanto, attualmente, molti studi nel campo della microbiologia sono dedicati alle interazioni tra microrganismi basate sull'uso di citochine batteriche.

È noto che i microrganismi sono in grado di adattarsi in modo flessibile alle mutevoli condizioni ambientali (in particolare alla mancanza di componenti nutrizionali). Inoltre, alcuni di loro hanno un'organizzazione specifica del metabolismo geneticamente fissata, che consente loro di esistere a concentrazioni molto basse di nutrienti (oligotrofi). Le cellule di un'altra categoria (copiotrofi), quando il loro habitat è esaurito, sono in grado di attivare programmi speciali per sopravvivere a condizioni sfavorevoli. Alcuni di essi formano strutture specializzate (spore e cisti), estremamente resistenti a vari stress, mentre i batteri non sporulanti sono in grado di sopravvivere in condizioni sfavorevoli, rimanendo cellule vegetative con attività metabolica ridotta, cioè entrando in uno stato speciale VBNC (vitale ma non coltivabile - vitale, ma non coltivabile). Naturalmente, i batteri non coltivabili rimangono fuori dall'ambito dei metodi di ricerca generalmente accettati (la semina su terreni solidi o liquidi non ne consente il rilevamento). Ad esempio, gli agenti causali di malattie pericolose come il colera e la campilobatteriosi tendono a formare forme incoltivabili. L'esame microscopico di campioni isolati dall'ambiente (suolo, acque fluviali e marine, ecc.) ha rivelato molte cellule che, pur possedendo attività metabolica, non possono formare una coltura a tutti gli effetti (cioè non coltivabile). Attualmente sono noti solo pochi esempi di trasformazione di tali batteri in normali cellule in coltura. Il concetto di crescita dei microrganismi dipendente dalle citochine ci consente di dare un nuovo sguardo al problema della selezione dei terreni per il ripristino di forme non coltivabili.

Forme non coltivabili di batteri patogeni si trovano non solo nell'ambiente, ma anche nei tessuti, negli organi dell'uomo e degli animali. Molto spesso sono molto diversi morfologicamente e biochimicamente. Ad esempio, l'agente eziologico della tubercolosi forma forme coccoidi atipiche nei tessuti. Forse tali cellule sono forme sperimentali speciali capaci di attivazione e riproduzione. L'esistenza di tali forme dormienti può spiegare le ricadute periodiche della malattia in pazienti apparentemente guariti. È stato dimostrato che le cellule Mycobacterium tuberculosis può trasformarsi in uno stato coccoide non replicante in condizioni microaerofile in vitro che spesso si presentano in vivo(ad esempio, nei granulomi). Sono state trovate anche forme coccoidi Campylobacter jejuni E Helicobacter pylori. Si presume che si formino nei tessuti in risposta agli effetti dei farmaci e, possibilmente, siano cellule quiescenti resistenti agli antibiotici. Tuttavia, i dati sulla coltivazione di tali forme sono molto contraddittori. È possibile che tali batteri possano essere attivati ​​da alcuni specifici fattori di crescita, il cui ruolo è probabilmente svolto dalle citochine dell'ospite. Ad esempio, la crescita dei bacilli tubercolari all’interno dei monociti è stata significativamente stimolata dal fattore di crescita trasformante (TGF-1), mentre la crescita cellulare M. tubercolosi E M.avium all’interno dei macrofagi è stata significativamente accelerata in presenza del fattore di crescita epidermico. Ovviamente, i fattori delle citochine dell’ospite possono svolgere un ruolo importante sia nell’attivazione di batteri dormienti che nella proliferazione di agenti patogeni attivi. Una diminuzione dei livelli di insulina nel sangue dei pazienti con diabete porta ad una significativa proliferazione cellulare Pseudomonas pseudomallei, che sono agenti causali della melioidosi, e la transferrina è di grande importanza per la crescita e la sopravvivenza delle cellule macrofagiche del topo Francisella tularensis.

È possibile che anche specifiche citochine batteriche svolgano un ruolo significativo nella formazione di forme dormienti e nel loro ripristino in cellule attive in divisione. Quindi, tenendo conto dei problemi legati all'emergere della resistenza agli antibiotici, è difficile sopravvalutare l'importanza di trovare fattori di crescita autocrini necessari per la crescita di batteri patogeni e, quindi, di essere un bersaglio per l'azione di antibiotici fondamentalmente nuovi che non sono -tossico per il paziente.

L'utilizzo di citochine batteriche specifiche può migliorare sensibilmente anche la situazione con la coltivazione di batteri incolti in ambienti non del tutto adatti alla loro riproduzione. Ad esempio, i micrococchi che di solito non crescono su un terreno succinato minimo iniziano a moltiplicarsi normalmente in presenza del fattore autocrino Rpf (fattore di promozione della rianimazione) e delle cellule lavate Mycobacterium smegmatis, che crescono su terreno minimo solo con l'aggiunta di Rpf, isolato da Micrococco luteo, può essere considerato come un modello di una popolazione di batteri “affamati” nel suolo, che probabilmente richiedono la presenza di una citochina specifica per iniziare la divisione. L'utilizzo di citochine batteriche specifiche può migliorare sensibilmente anche la situazione con la coltivazione di batteri incolti in ambienti non del tutto adatti alla loro riproduzione. Geni simili al gene che codifica per la proteina Rpf M. luteus, sono ampiamente distribuiti tra i batteri gram-positivi con un elevato contenuto di G+C, che comprendono streptomiceti, corinebatteri e micobatteri. Questo fatto apre nuove opportunità per la prevenzione e il trattamento delle malattie causate da agenti microbici e ci consente anche di dare uno sguardo diverso al complesso complesso delle interazioni batteriche interspecie negli habitat naturali dei microrganismi.

Ultimo aggiornamento: 20/02/2004

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Il sistema di comunicazione intercellulare nei microrganismi è chiamato sistema rilevamento del quorum (QS ). Oggi il sistema QS è definito come un sistema di espressione genica coordinata in una popolazione, a seconda della sua densità, utilizzando piccole molecole di segnalazione. Come notato sopra, questo meccanismo fu descritto per la prima volta nel 1970 da Nilsson nel batterio marino Vibrio fisheri come sistema di regolazione della bioluminescenza. Inizialmente, si presumeva che questo meccanismo di regolazione fosse caratteristico solo di un piccolo numero di specie strettamente imparentate del genere Vibrione Tuttavia, ulteriori ricerche hanno dimostrato la diffusa prevalenza di questo meccanismo di regolazione nel mondo dei microrganismi. Si è scoperto che con l'aiuto del sistema QS i microrganismi sono in grado di regolare molti processi vitali, in particolare la patogenicità, il metabolismo secondario, la formazione di biofilm e molto altro. È stato dimostrato che il sistema QS si verifica non solo nei batteri, ma anche in alcuni eucarioti inferiori, come i funghi simili a lieviti del genere Candida E Criptococco. Inoltre, si è scoperto che con l'aiuto di questo sistema i microrganismi sono in grado di interagire non solo con i propri simili, ma anche di effettuare comunicazioni tra regni, compresi gli eucarioti superiori.

In generale, il funzionamento del sistema QS si basa su una serie di principi chiave (Fig. 11):

1. Utilizzo di piccole molecole di segnalazione: nel sistema QS, la trasmissione del segnale da una cellula all'altra viene effettuata utilizzando molecole di segnalazione di varia natura chimica.

2. La presenza di recettori specifici: le molecole di segnalazione non influenzano direttamente l'espressione dei geni bersaglio. L'attivazione dei geni bersaglio avviene solo dopo il legame delle molecole segnale ai recettori corrispondenti.

3. Influenza della densità di popolazione cellulare – il sistema QS viene avviato solo al raggiungimento di un certo valore di densità di popolazione cellulare, che è correlato alla concentrazione di molecole di segnalazione nell'ambiente esterno.

4. Automantenimento del funzionamento: il controllo della sintesi di nuove molecole di segnalazione e recettori viene effettuato allo stesso modo dei geni bersaglio in assenza di attivazione dei sistemi di repressione.

5. La presenza di meccanismi di regolazione negativa selettiva: le cellule microbiche contengono geni di regolazione negativa sia QS-dipendenti che QS-indipendenti, i cui prodotti sono in grado di disattivare selettivamente interi collegamenti del sistema QS o l'intero sistema nel suo insieme.

Riso. 11. Schema generale di funzionamento del sistema di rilevamento del quorum.

Questi principi sono comuni a quasi tutte le tipologie di sistemi QS, indipendentemente dalla loro specifica organizzazione strutturale. L'avvio del sistema QS coincide solitamente con la fase iniziale della crescita esponenziale, caratterizzata da un rapido aumento della densità della popolazione cellulare. L'espressione dei geni bersaglio, al contrario, inizia solitamente con l'ingresso della popolazione cellulare nella fase stazionaria, ed è solitamente complessa, ovvero comporta l'inizio della biosintesi di quasi tutti i prodotti regolati dal QS in un breve periodo di tempo. Pertanto, le prime fasi del funzionamento del sistema QS consistono nel garantire la biosintesi di molecole segnale e recettori per essi, fino a un certo punto, che coincide con l'accumulo della massima concentrazione di molecole segnale nello spazio intercellulare, al raggiungimento del quale il funzionamento del sistema QS entra in uno stato di autosostentamento.

I meccanismi alla base dell’attivazione precoce del sistema QS non sono stati ancora del tutto chiariti. Nonostante siano stati scoperti numerosi regolatori diversi, ai quali viene attribuito un certo ruolo nell’attivazione anticipata del sistema, molte domande rimangono irrisolte. Innanzitutto non è chiaro come sia regolato l’accumulo primario delle molecole di segnalazione e dei loro recettori. Esiste un'ipotesi che un certo numero di molecole segnale e recettori per loro siano costantemente presenti nelle cellule e il loro accumulo primario avvenga secondo lo stesso meccanismo autosufficiente, mentre parte del pool intracellulare di questi composti viene consumato per la sintesi di molecole segnale e recettori. Il resto viene escreto dalle cellule e, una volta raggiunta una concentrazione soglia, viene riassorbito e innesca l'espressione dei geni bersaglio. Tuttavia, viste le peculiarità del funzionamento di alcuni tipi di sistemi QS, ciò sembra improbabile. James P. Pearson, al contrario, ritiene che l'innesco primario del QS avvenga con l'aiuto di regolatori della trascrizione non specifici come MvaT E Vfr (V irulenza F attori R egulatore) Pseudomonas aeruginosa, e il sistema entra in uno stato di autosostentamento molto più tardi.

Capitolo 2. Rilevamento del quorum

2.1. Caratteristiche generali e meccanismo di quorum sensing

Il sistema di comunicazione intercellulare nei microrganismi è chiamato sistema rilevamento del quorum (QS). Oggi il sistema QS è definito come un sistema di espressione genica coordinata in una popolazione, a seconda della sua densità, utilizzando piccole molecole di segnalazione. Come notato sopra, questo meccanismo fu descritto per la prima volta nel 1970 da Nilsson nel batterio marino Vibrio fisheri come sistema di regolazione della bioluminescenza. Inizialmente, si presumeva che questo meccanismo di regolazione fosse caratteristico solo di un piccolo numero di specie strettamente imparentate del genere Vibrione Tuttavia, ulteriori ricerche hanno dimostrato la diffusa prevalenza di questo meccanismo di regolazione nel mondo dei microrganismi. Si è scoperto che con l'aiuto del sistema QS i microrganismi sono in grado di regolare molti processi vitali, in particolare la patogenicità, il metabolismo secondario, la formazione di biofilm e molto altro. È stato dimostrato che il sistema QS si verifica non solo nei batteri, ma anche in alcuni eucarioti inferiori, come i funghi simili a lieviti del genere Candida E Criptococco. Inoltre, si è scoperto che con l'aiuto di questo sistema i microrganismi sono in grado di interagire non solo con i propri simili, ma anche di effettuare comunicazioni tra regni, compresi gli eucarioti superiori.

In generale, il funzionamento del sistema QS si basa su una serie di principi chiave (Fig. 1):

1. 
   L'uso di piccole molecole di segnalazione: nel sistema QS, la trasmissione del segnale da una cellula all'altra viene effettuata utilizzando molecole di segnalazione di varia natura chimica.
2. 
   La presenza di recettori specifici - molecole di segnalazione non influenzano direttamente l'espressione dei geni bersaglio. L'attivazione dei geni bersaglio avviene solo dopo il legame delle molecole segnale ai recettori corrispondenti.
3. 
   Influenza della densità di popolazione cellulare: il sistema QS viene avviato solo al raggiungimento di un certo valore di densità di popolazione cellulare, che è correlato alla concentrazione di molecole di segnalazione nell'ambiente esterno.
4. 
   Automantenimento del funzionamento: il controllo della sintesi di nuove molecole di segnalazione e recettori viene effettuato allo stesso modo dei geni bersaglio in assenza di attivazione dei sistemi di repressione.
5. 
   La presenza di meccanismi di regolazione negativa selettiva: le cellule microbiche contengono geni di regolazione negativa sia QS-dipendenti che QS-indipendenti, i cui prodotti sono in grado di disattivare selettivamente interi collegamenti del sistema QS o l'intero sistema nel suo insieme.

Riso. 1. Schema generale di funzionamento del sistema di rilevamento del quorum.

Questi principi sono comuni a quasi tutte le tipologie di sistemi QS, indipendentemente dalla loro specifica organizzazione strutturale. L'avvio del sistema QS coincide solitamente con la fase iniziale della crescita esponenziale, caratterizzata da un rapido aumento della densità della popolazione cellulare. L'espressione dei geni bersaglio, al contrario, inizia solitamente con l'ingresso della popolazione cellulare nella fase stazionaria, ed è solitamente complessa, ovvero comporta l'inizio della biosintesi di quasi tutti i prodotti regolati dal QS in un breve periodo di tempo. Pertanto, le prime fasi del sistema QS sono: garantendo la biosintesi delle molecole segnale e dei recettori per esse, fino a un certo punto, che coincide con l'accumulo della massima concentrazione di molecole segnale nello spazio intercellulare, al raggiungimento del quale il funzionamento del sistema QS entra in uno stato di autosostentamento.

I meccanismi alla base dell’attivazione precoce del sistema QS non sono stati ancora del tutto chiariti. Nonostante siano stati scoperti numerosi regolatori diversi, ai quali viene attribuito un certo ruolo nell’attivazione anticipata del sistema, molte domande rimangono irrisolte. Innanzitutto non è chiaro come sia regolato l’accumulo primario delle molecole di segnalazione e dei loro recettori. Esiste un'ipotesi che un certo numero di molecole segnale e recettori per loro siano costantemente presenti nelle cellule e il loro accumulo primario avvenga secondo lo stesso meccanismo autosufficiente, mentre parte del pool intracellulare di questi composti viene consumato per la sintesi di molecole segnale e recettori. Il resto viene escreto dalle cellule e, una volta raggiunta una concentrazione soglia, viene riassorbito e innesca l'espressione dei geni bersaglio. Tuttavia, viste le peculiarità del funzionamento di alcuni tipi di sistemi QS, ciò sembra improbabile. James P. Pearson ritiene invece che l'attivazione primaria del QS avvenga con l'ausilio di regolatori della trascrizione aspecifici come MvaT E Vfr(V irulenza F attori R egulatore) Pseudomonas aeruginosa, e il sistema entra in uno stato di autosostentamento molto più tardi.

2.2. Reazioni di rilevamento del quorum nei microrganismi gram-positivi

I batteri Gram-positivi comunicano tipicamente utilizzando molecole di segnalazione oligopeptidiche. La trasduzione del segnale nella maggior parte dei casi coinvolge un meccanismo di fosforilazione a due componenti. Di norma, lo stato di quorum viene raggiunto quando una popolazione di cellule batteriche entra nella fase stazionaria di crescita. È in questo momento che vengono rilevate le molecole di segnalazione, con l'aiuto delle quali le cellule entrano in contatto tra loro. Lo schema generale di comunicazione dei batteri gram-positivi può essere rappresentato come segue: in primo luogo, nella cellula viene sintetizzato un precursore che, una volta modificato, si trasforma in un oligopeptide maturo. Quest'ultimo viene escreto all'esterno della cellula dall'esportatore. Le molecole di oligopeptidi si accumulano nello spazio intercellulare man mano che aumenta la densità delle cellule batteriche. Una chinasi sensore bicomponente che attraversa la membrana riconosce il segnale e lo trasmette nella cellula attraverso una cascata di fosforilazione. Nella cellula, la molecola oligopeptidica interagisce con il gene(i) bersaglio.

Un classico sistema quorum-dipendente del peptide può essere considerato un sistema responsabile del trasferimento coniugativo di plasmidi in Enterococcus faecalis e specie batteriche affini. Questo sistema stimola la proliferazione di tratti nella popolazione microbica che sono importanti per l'interazione tra il microrganismo e l'animale ospite, nonché per l'eliminazione della competizione. Il plasmide pPDl, trasportato da un sistema peptidico quorum-dipendente, è responsabile della sintesi delle emolisine, il plasmide pCDl per la formazione della batteriocina, il plasmide pCFlO per la resistenza E.faecalis alla tetraciclina. Ciascun esa- o ottapepeptide induce l'adesione delle cellule batteriche e la loro coniugazione con trasferimento dal donatore al ricevente di uno specifico plasmide. Ad esempio, l'ottapeptide cPDl stimola il trasferimento coniugativo del plasmide pPDl. Il plasmide codifica per un recettore situato sulla proteina repressore dell'operone corrispondente. L'interazione dell'oligopeptide con il recettore provoca la dissociazione del repressore dal DNA, innescando così la sintesi del prodotto corrispondente. Il plasmide pPDl comprende anche il gene traC, il cui prodotto è una proteina che facilita la penetrazione del peptide attraverso la parete cellulare. I segnali oligopeptidici vengono sintetizzati intensamente da cellule che non portano i corrispondenti plasmidi (riceventi), mentre nelle cellule donatrici la sintesi di tali segnali è soppressa; inoltre, il plasmide codifica per un peptide inibitorio.

Il prodotto del plasmide pPDl è il peptide iPDl, HHaKTHBHpyiounmcPDl.

Un altro processo sensibile al quorum trovato in E.faecalis, è la produzione di due fattori di virulenza: gelatinasi (GelE) e serina proteasi (SprE).

Un esempio dell'uso di un segnale peptidico per le interazioni intercellulari è il sistema di rilevamento del quorum, che controlla la sintesi delle esotossine nella fase logaritmica tardiva della crescita in Staphylococcus aureus. In questo sistema, la proteina AgrD viene sintetizzata come un precursore costituito da 46 aminoacidi, che, durante l'esportazione da parte della proteina AgrB, viene convertito in un peptide maturo AIP (peptide autoinducente), costituito da 8 aminoacidi. L'AIP è riconosciuto dal sensore chinasi a due componenti AgrC, che trasmette un segnale nella cellula attraverso la fosforilazione del regolatore di risposta AgrA. AgrA~P attiva la trascrizione dei geni bersaglio, stimola la trascrizione dell'operone agrB, D, C, A (circuito autoregolatorio positivo) e “inibisce” anche la trascrizione dei geni che codificano per altre esotossine. Basato sulle differenze nell'AIP e nel suo recettore, i ceppi S. aureus possono essere classificati in quattro o più gruppi. Gli oligopeptidi sintetizzati da uno dei gruppi inducono patogenicità in questo gruppo e sopprimono specificamente i sistemi di virulenza Agr in altri gruppi.

L’emergere della competenza nella fase logaritmica tardiva della crescita Streptococco pneumoniae. Il gene comC codifica per un precursore costituito da 41 residui aminoacidici. Quest'ultimo viene convertito in un peptide maturo costituito da 17 residui di aminoacidi durante l'interazione con il sistema di esportazione del peptide (sistema ABC), formato dai prodotti dei geni comAB. Il peptide contatta il suo recettore sulla superficie cellulare: l'istidina chinasi, un prodotto del gene comD. L'istidina chinasi attivata fosforila il prodotto del gene comE. Man mano che le cellule si accumulano, il numero di segnali peptidici aumenta e raggiunge un livello critico nell'ambiente. Di conseguenza aumenta la quantità di proteina comE fosforilata che, a partire da una certa concentrazione, si lega al promotore dell'operone comCDE, stimolandone il lavoro (circuito autoregolatorio positivo), attiva il promotore dell'operone comAB (sistema di esportazione delle proteine ​​dalla cellula ), attiva l'operone comCX, che comprende l'intera catena dei geni della competenza tardiva; responsabile del legame e dell'assorbimento del DNA in trasformazione e di tutti gli altri stadi finali della trasformazione.

Oltre agli esempi sopra riportati di reazioni di rilevamento del quorum nei batteri gram-positivi, va notato che, oltre agli oligopeptidi, i batteri gram-positivi utilizzano anche sostanze di diversa natura chimica come molecole segnale. Quindi, tra i rappresentanti dell'ordine Actinomiceti Insieme alle molecole segnale peptidiche sono state scoperte sostanze a basso peso molecolare, la maggior parte delle quali contiene un gruppo lattone.

Negli streptomiceti, i sistemi di rilevamento del quorum coinvolgono i butirrolattoni e i loro corrispondenti recettori proteici, che regolano congiuntamente lo sviluppo morfologico e la formazione di antibiotici nei loro produttori. Il regolatore degli actinomiceti più studiato è il fattore A, che è il 2-iso-capriloil-3-idrossimetil-γ-butirrolattone.

L'influenza del fattore A sulla differenziazione morfologica e sulla formazione di antibiotici è soggetta allo schema generale di funzionamento dei regolatori degli streptomiceti contenenti un gruppo lattone. Durante le fasi iniziali della crescita, quando le concentrazioni del fattore A sono basse, il recettore del fattore A (AgrA) si lega e reprime l'espressione di un ipotetico attivatore comune della biosintesi e della sporulazione della streptomicina. Quando si isola AgrA dal lisato cellulare S.griseusÈ stato dimostrato che l'IFO 13350 è una proteina composta da 276 aminoacidi e un peso molecolare di 29,1 kDa.

Quando la densità della coltura aumenta, la concentrazione del fattore A raggiunge un livello critico al quale si lega ad AgrA, provocando la dissociazione di quest'ultimo dal DNA e, quindi, attivando la trascrizione del gene chiave adpA, che codifica per AdpA (una proteina costituita da 405 aminoacidi contenenti un sito di legame nella regione centrale con il DNA, simili ai regolatori della trascrizione della famiglia di proteine ​​AraC/XylS). AdpA, a sua volta, è un regolatore positivo dell'attivatore citoplasmatico rilevato del cluster genetico della biosintesi della streptomicina e degli attivatori del processo di sporulazione. L'attivatore citoplasmatico, legandosi al DNA nella regione del promotore del gene per la regolazione specifica del cluster di biosintesi della streptomicina strR, induce la trascrizione di questo gene, che si trova dopo di esso, il gene per la resistenza al proprio antibiotico - aphD, il gene adsA, che codifica per il fattore a extracitoplasmatico della RNA polimerasi, necessario per la formazione del micelio aereo, nonché gene sgmA, che codifica per una proteina peptidasi, che è coinvolta, insieme ad altri enzimi idrolitici, nella degradazione delle proteine ​​del micelio substrato come risultato della formazione del micelio aereo. Il prodotto regolatore del gene strR determina l'inizio della trascrizione dei geni della biosintesi strutturale come parte di un cluster di promotori dipendenti da StrR. L'inizio dell'espressione del promotore del gene strR sotto l'influenza di un attivatore citoplasmatico garantisce anche la produzione del prodotto del gene aphD - l'aminoglicoside fosfotransferasi, e quindi la creazione di un livello base di resistenza del ceppo al proprio antibiotico.

È stato dimostrato che in diverse specie di streptomiceti esiste omologia tra gli elementi strutturali dei regolatori. Sequenze nucleotidiche omologhe al gene agrA S.griseus, sono stati trovati anche in altri streptomiceti. Ad esempio, a S.coelicolor A3 (2), sono stati scoperti due geni srgA e srgB, che codificano per le proteine ​​simili ad AgrA srgA e srgB, che sono simili al 90,7% tra loro e al 35% simili ad AgrA.