Malattie metaboliche ereditarie: una vasta classe di malattie ereditarie umane, che comprende più di 600 forme diverse. Il numero di nuove forme di malattie metaboliche e persino di classi cresce ogni anno, il numero di pubblicazioni relative alle possibilità di diagnosticare, prevenire e, soprattutto, curare le malattie metaboliche aumenta in modo esponenziale. Le singole forme di malattie metaboliche sono rare o estremamente rare, ma la loro frequenza totale è piuttosto elevata e ammonta a 1:3.000-1:5.000 nati vivi. Una caratteristica di queste malattie sono i cambiamenti biochimici pronunciati che compaiono prima della comparsa dei primi sintomi clinici.

Secondo la classificazione biochimica, le malattie metaboliche sono divise in 22 gruppi a seconda del tipo di via metabolica danneggiata (aminoacidopatia, disturbi del metabolismo dei carboidrati, ecc.) o in base alla sua localizzazione all'interno di un determinato componente cellulare (malattie lisosomiali, perossisomiali e mitocondriali).

La classificazione biochimica delle malattie metaboliche è la seguente.
Malattie da accumulo lisosomiale.
Malattie mitocondriali.
malattie perossisomiali.
Disturbi congeniti della glicosilazione.
Disturbi del metabolismo della creatinina.
Disturbi del metabolismo del colesterolo.
Violazioni della sintesi di citochine e altri immunomodulatori.
Disturbi metabolici degli aminoacidi/acidi organici.
Violazioni della b-ossidazione mitocondriale.
Disturbi metabolici dei corpi chetonici.
Disturbi metabolici dei grassi e degli acidi grassi, lipoproteine.
Disturbi del metabolismo dei carboidrati e del glicogeno.
Disturbi del trasporto del glucosio.
Disturbi del metabolismo della glicerina.
Violazioni del metabolismo delle vitamine.
Disturbi metabolici dei metalli e degli anioni.
Disturbi del metabolismo degli acidi biliari.
Disturbi del metabolismo dei neurotrasmettitori.
Disturbi metabolici degli steroidi e di altri ormoni.
Disturbi metabolici dell'eme e delle porfirine.
Disturbi del metabolismo purine/pirimidine.
Disturbi del metabolismo della bilirubina.

I principali meccanismi della patogenesi delle malattie metaboliche
ACCUMULO DEL SUBSTRATO
L'accumulo del substrato della reazione enzimatica bloccata è uno dei principali meccanismi di patogenesi nella stragrande maggioranza delle malattie metaboliche.

Innanzitutto, questo si riferisce all'interruzione delle reazioni cataboliche, come la scomposizione di grandi macromolecole, amminoacidi, acidi organici, ecc. Se il substrato accumulato viene facilmente rimosso dalle cellule e la sua concentrazione nei fluidi biologici è molte volte superiore a livello omeostatico, l'equilibrio acido-base può cambiare (acidi organici nell'aciduria organica), si accumula in diversi tessuti (acido omogentisico nell'alcaptonuria). In alcuni casi, il substrato compete con composti simili durante il trasporto attraverso la barriera emato-encefalica, portando alla loro deplezione nel cervello (aminoacidopatia). Se il substrato accumulato è scarsamente solubile, si accumula all'interno della cellula, innescando i meccanismi di morte apoptotica. Una delle ulteriori conseguenze dell'accumulo di substrati può essere l'attivazione di vie metaboliche minori, la cui quota nel normale metabolismo è trascurabile.

Tale meccanismo, ad esempio, è alla base dell'accumulo di acido fenilpiruvico nella fenilchetonuria.

I metaboliti accumulati hanno un grande valore diagnostico; in alcuni casi, la loro analisi quantitativa o semiquantitativa consente di determinare con precisione la forma della malattia. Con aciduria organica e aminoacidopatia, l'accumulo di grandi quantità di composti idrosolubili nel plasma sanguigno e nelle urine consente di determinarli rapidamente quantitativamente o qualitativamente utilizzando metodi di analisi cromatografici.

INSUFFICIENZA DEI PRODOTTI DI REAZIONE
L'insufficienza dei prodotti di reazione è il secondo meccanismo principale nella patogenesi delle malattie metaboliche. La causa dei cambiamenti patologici può essere direttamente l'insufficienza del prodotto della reazione bloccata. Ad esempio, con un difetto della biotinidasi, la scissione della biotina dalle proteine ​​alimentari è disturbata e le manifestazioni cliniche della malattia sono associate alla carenza di questa vitamina.

L'insufficienza di prodotti di reazione nel processo del ciclo dell'urea crea una situazione metabolica notevole: alcuni aminoacidi passano da non essenziali a essenziali. Quindi, con l'aciduria arginina-succinica, si verifica una violazione della formazione di arginina dall'acido arginina-succinico, che porta ad una carenza di arginina e ornitina. In alcuni casi può esserci una carenza di un prodotto più distante in questa catena metabolica, ad esempio l'aldosterone e il cortisolo, con sindrome adrenogenitale,

ISOLAMENTO METABOLICO
In un gruppo separato è necessario individuare le malattie associate all'isolamento metabolico del prodotto di reazione. Questo è il principale meccanismo di patogenesi in violazione delle proteine ​​trasportatrici, che non sono enzimi, ma sono coinvolte nella regolazione di una determinata reazione biochimica. La cascata di eventi metabolici innescata da queste malattie ha conseguenze simili per l’organismo e per la cellula. La sindrome iperornitinemia - iperammoniemia - omocitrullinuria (acronimo dei tre principali marcatori biochimici - iperammoniemia, iperornitinemia, omocitrullinemia) è associata ad una violazione del trasporto dell'ornitina. Di conseguenza, all'interno dei mitocondri c'è una carenza di ornitina, che porta all'accumulo di carbamilfosfato e ammonio.

È quasi impossibile individuare un unico meccanismo principale della patogenesi, poiché i processi metabolici sono strettamente correlati. Di norma, si osserva una combinazione di tutti i meccanismi descritti e con ciascuno dei blocchi enzimatici si verificano cambiamenti significativi nell'intera rete metabolica della cellula.

Diagnostica di laboratorio delle malattie metaboliche ereditarie
La diagnosi differenziale delle malattie metaboliche ereditarie dipende interamente dall'uso di una gamma insolitamente ampia di metodi biochimici, fisico-chimici e genetici molecolari. Nella maggior parte dei casi, solo un'interpretazione combinata di tutti i risultati ottenuti consente di determinare con precisione la forma della malattia. Di norma, la strategia generale per diagnosticare le malattie metaboliche ereditarie comprende diverse fasi.

I - identificazione di un collegamento difettoso nella via metabolica attraverso l'analisi (quantitativa, semiquantitativa o qualitativa) dei metaboliti.
II - rilevamento della disfunzione proteica determinandone la quantità e/o l'attività.
III - chiarimento della natura della mutazione, ovvero caratterizzazione dell'allele mutante a livello genetico.

Tale strategia viene utilizzata non solo per risolvere problemi legati allo studio dei meccanismi molecolari della patogenesi delle malattie metaboliche ereditarie, all'identificazione delle correlazioni genofenotipiche, è necessaria principalmente per la diagnosi pratica delle malattie metaboliche ereditarie.

La verifica della diagnosi a livello della proteina e del gene mutante è necessaria sia per la diagnosi prenatale, la consulenza genetica medica delle famiglie gravate, sia in alcuni casi per la nomina di una terapia adeguata. Ad esempio, nel deficit di deidropteridina reduttasi, il fenotipo clinico e i livelli di fenilalanina saranno indistinguibili dalla forma classica di fenilchetonuria, ma gli approcci al trattamento di queste malattie sono fondamentalmente diversi. L'importanza della differenziazione del locus delle malattie metaboliche ereditarie per la consulenza genetica medica può essere illustrata dall'esempio della mucopolisaccaridosi di tipo II (malattia di Hunter). Secondo lo spettro dei glicosaminoglicani escreti, è impossibile distinguere le mucopolisaccaridosi di tipo I, II e VII, ma di queste malattie solo la malattia di Hunter è ereditata secondo il tipo recessivo legato all'X, che è di fondamentale importanza per la prognosi della prole in una famiglia con una storia gravata. Per quanto riguarda la diagnosi prenatale, avendo dati sulla forma della mucopolisaccaridosi (questa può essere stabilita solo esaminando l'attività degli enzimi), è possibile effettuare la diagnosi prenatale già alla 8-11a settimana di gravidanza, se la forma non è specificata , quindi solo alla 20a settimana. La priorità dei metodi di genetica molecolare è incondizionata nello stabilire il portatore eterozigote, così come nella diagnosi prenatale di malattie in cui l'enzima mutante non è espresso nelle cellule dei villi coriali, ad esempio nella fenilchetonuria, in alcune glicogenosi e nei difetti della β-ossidazione mitocondriale. .

IDENTIFICAZIONE DI UN COLLEGAMENTO DIFETTOSO DELLA VIA METABOLICA
L'analisi dei metaboliti è il passo più importante nella diagnosi di molte malattie della classe delle malattie metaboliche ereditarie. Prima di tutto, questo si riferisce alle violazioni del metabolismo interstiziale degli aminoacidi e degli acidi organici. Nella maggior parte di queste malattie, la determinazione quantitativa dei metaboliti nei fluidi biologici consente una diagnosi accurata. A tal fine vengono utilizzati metodi di analisi chimica qualitativa, metodi spettrofotometrici per la valutazione quantitativa dei composti, nonché vari tipi di cromatografia (spettrometria di massa a strato sottile, liquida ad alte prestazioni, gas, tandem). Il materiale biologico per questi studi è solitamente costituito da campioni di plasma sanguigno o siero e urina.

Nelle malattie metaboliche ereditarie come i disturbi del metabolismo energetico, il metabolismo dei carboidrati e degli aminoacidi, l'analisi dei composti comuni a molte vie metaboliche (metaboliti chiave) consente la diagnosi differenziale delle malattie e la pianificazione di ulteriori tattiche di esame. Per molti gruppi di malattie metaboliche ereditarie, viene utilizzata l'analisi semiquantitativa per determinare la concentrazione dei metaboliti. A volte l'analisi qualitativa è la prima fase di una ricerca diagnostica e consente di sospettare con elevata affidabilità una certa forma nosologica di una malattia o un gruppo di malattie.

ESAMI DELLE URINE QUALITATIVI E SEMIQUANTITATIVI
Poiché in molte malattie metaboliche ereditarie si accumulano substrati della reazione enzimatica bloccata o dei loro derivati, concentrazioni eccessive di questi metaboliti possono essere rilevate mediante test chimici qualitativi. Questi test sono sensibili, facili da usare, economici e non danno risultati falsi negativi, e le informazioni ottenute dal loro utilizzo permettono di sospettare con un alto grado di probabilità malattie metaboliche ereditarie in un paziente. Bisogna tenere presente che i risultati di questi test sono influenzati da farmaci, integratori alimentari e dai loro metaboliti. I test di analisi qualitativa vengono utilizzati nei programmi di screening selettivo.

Test qualitativi
Colore e olfatto: leucinosi, tirosinemia, acidemia isovalerica, fenilchetonuria, alcaptonuria, cistinuria, aciduria 3-idrossi-3-metilglutarica.
Test di Benedict (galattosemia, intolleranza congenita al fruttosio, alcaptonuria). Positivo anche a sindrome di Fanconi, diabete mellito, deficit di lattasi, antibiotici.
Test del cloruro ferrico (fenilchetonuria, leucinosi, iperglicinemia, alcaptonuria, tirosinemia, istidinemia). Positivo anche per cirrosi epatica, pleocromocitoma, iperbilirubinemia, acidosi lattica, chetoacidosi, melanoma.
Test della dinitrofenilidrazina (fenilchetonuria, leucinosi, iperglicinemia, alcaptonuria). Positivo anche per glicogenosi, acidosi lattica.
Test della p-nitroanilina: aciduria metilmalonica.
Test al solfito: mancanza del cofattore molibdeno.
Test dell'acido omogentisico: alcaptonuria.
Test con nitrosonaftolo: tirosinemia. Positivo anche alla fruttosemia e alla galattosemia.

METABOLITI CHIAVE
Per molti gruppi di malattie metaboliche ereditarie, un passo importante nella diagnosi differenziale di laboratorio è la misurazione della concentrazione di alcuni metaboliti in vari fluidi biologici (sangue, plasma, liquido cerebrospinale e urina). Questi composti includono glucosio, acido lattico (lattato), acido piruvico (piruvato), ammonio, corpi chetonici (b-idrossibutirrato e acetoacetato), acido urico. La concentrazione di questi composti cambia in molte malattie metaboliche ereditarie e la loro valutazione completa rende possibile lo sviluppo di algoritmi per ulteriori diagnostiche di laboratorio.

lattato e piruvato
Le concentrazioni di lattato, piruvato e corpi chetonici sono gli indicatori più importanti dei disturbi del metabolismo energetico. Sono note circa 25 forme nosologiche di malattie metaboliche ereditarie, in cui si verifica un aumento del livello di lattato nel sangue (acidosi del lattato).

L'acidosi lattica è una condizione in cui il livello di acido lattico supera i 2,1 mm. L'acidosi lattica primaria può essere associata a deficit di piruvato deidrogenasi (complesso piruvato deidrogenasi), disturbi della catena respiratoria mitocondriale (la stragrande maggioranza delle forme), gluconeogenesi e metabolismo del glicogeno. In alcuni casi si osserva acidosi lattica secondaria, aciduria organica, disturbi della β-ossidazione mitocondriale, difetti del ciclo dell'urea. La concentrazione di questi metaboliti dipende in gran parte dallo stato fisiologico (prima o dopo il carico di cibo) e il livello di lattato è influenzato anche dall'attività fisica e persino dallo stress associato alla procedura di prelievo del sangue, soprattutto nei bambini piccoli. Tutto ciò deve essere preso in considerazione quando si interpretano i dati biochimici. Il rapporto lattato/piruvato nel sangue è un importante criterio diagnostico differenziale. Biochimicamente, questo rapporto riflette il rapporto tra la forma ridotta e quella ossidata dei dinucleotidi della nicotinammide nel citoplasma - il cosiddetto stato ossidativo del citoplasma.

Corpi chetonici
I corpi chetonici si formano nel fegato, la loro fonte principale è la b-ossidazione degli acidi grassi. Vengono poi trasferiti a vari tessuti del corpo. Il rapporto dei corpi chetonici 3-idrossibutirrato/acetoacetato riflette lo stato redox dei mitocondri, poiché il loro rapporto è associato esclusivamente al pool mitocondriale dei dinucleotidi della nicotinammide. Il β-idrossibutirrato è relativamente stabile nel plasma, a differenza dell'acetoacetato, che viene rapidamente degradato. Molti difetti nella β-ossidazione mitocondriale sono caratterizzati da bassi livelli di corpi chetonici anche dopo un digiuno prolungato, che è associato all’esaurimento della produzione di acetil-CoA, che è il principale precursore dei corpi chetonici. Nelle malattie mitocondriali associate a difetti nella catena respiratoria mitocondriale, si osserva un'iperchetonemia paradossa: il livello dei corpi chetonici dopo un carico di cibo aumenta in modo significativo (normalmente, si osserva un aumento della concentrazione di corpi chetonici dopo una fame prolungata).

Ammonio
Nelle malattie metaboliche ereditarie, procedendo in base al tipo di scompenso metabolico acuto, è importante determinare il livello di ammonio nel sangue. Un aumento significativo dell'ammonio nel sangue si osserva nelle malattie metaboliche ereditarie causate da violazioni del ciclo dell'urea e del metabolismo degli acidi organici. In queste malattie la concentrazione di ammonio sale da 200 a 1000 micron. L'iperammoniemia non è solo un importante segno diagnostico differenziale, ma richiede anche misure terapeutiche urgenti, poiché porta rapidamente a gravi danni cerebrali. È importante differenziare questa condizione dall'iperammonemia neonatale transitoria, che si verifica nei neonati pretermine con indici di crescita e di massa elevati e sintomi clinici di danno polmonare. Il livello di ammonio in questo stato non supera i 200 micron. La concentrazione di ammonio nel sangue può aumentare in caso di gravi danni al fegato. Valori normali di concentrazione di ammonio nel sangue: nel periodo neonatale - meno di 110 micron, nei bambini più grandi - meno di 100 micron.

Glucosio
Una diminuzione dei livelli di glucosio nel sangue può essere osservata in numerose malattie metaboliche ereditarie. Innanzitutto si tratta di disturbi del metabolismo del glicogeno e di difetti nella β-ossidazione mitocondriale, in cui l'ipoglicemia può essere l'unico cambiamento biochimico rilevato nei test di laboratorio standard. La risposta fisiologica alla diminuzione dei livelli di glucosio nel sangue è l'abolizione del rilascio di insulina, della produzione di glucagone e di altri ormoni regolatori. Ciò porta alla formazione di glucosio dal glicogeno nel fegato e alla conversione delle proteine ​​in glucosio nella catena della gluconeogenesi. Viene attivata anche la lipolisi che porta alla formazione di glicerolo e acidi grassi liberi. Gli acidi grassi vengono trasportati ai mitocondri del fegato, dove vengono p-ossidati e si formano corpi chetonici, e il glicerolo viene convertito in glucosio nella catena della gluconeogenesi. I bambini hanno un bisogno di glucosio molto maggiore rispetto agli adulti. Si ritiene che ciò sia dovuto al fatto che il rapporto cervello-corpo è più elevato nei bambini e il cervello è il principale consumatore di glucosio.

Inoltre, il cervello adulto è più adatto all’utilizzo dei corpi chetonici come fonte di energia rispetto al cervello di un bambino. È per questi motivi che i bambini sono più sensibili alle condizioni ipoglicemiche rispetto agli adulti. Nei disturbi del metabolismo del glicogeno, l'ipoglicemia è associata all'incapacità di formare glucosio dal glicogeno, quindi è più pronunciata durante i periodi di digiuno prolungato.

La maggior parte delle malattie del gruppo dei difetti della β-ossidazione mitocondriale sono accompagnate anche da una diminuzione dei livelli di glucosio. Questo gruppo di malattie è una delle malattie metaboliche ereditarie più comuni. La causa dell'ipoglicemia è associata all'incapacità di utilizzare i grassi immagazzinati durante il periodo di digiuno e all'esaurimento del glicogeno immagazzinato, che diventa l'unica fonte di glucosio e, di conseguenza, di energia metabolica. L'ipoglicemia con difetti nella β-ossidazione mitocondriale, a differenza della glicogenosi, non è accompagnata da iperchetonemia. L'ipoglicemia può verificarsi anche nella galattosemia di tipo I, nell'intolleranza ereditaria al fruttosio, nel deficit di fruttosio-1,6-bisfosfatasi.

acidosi metabolica
L'acidosi metabolica è una delle complicanze frequenti di malattie infettive, grave ipossia, disidratazione e intossicazione. Anche le malattie metaboliche ereditarie che si manifestano nella prima infanzia sono spesso accompagnate da acidosi metabolica da deficit di basi.

Il criterio più importante nella diagnosi differenziale dell'acidosi metabolica è il livello dei corpi chetonici nel sangue e nelle urine, nonché la concentrazione di glucosio. Se l'acidosi metabolica è accompagnata da chetonuria, ciò indica una violazione del metabolismo del piruvato, degli aminoacidi ramificati, disturbi del metabolismo del glicogeno. Difetti nella β-ossidazione mitocondriale, nella chetogenesi e alcuni disturbi della gluconeogenesi non sono accompagnati da un aumento del livello dei corpi chetonici nel sangue e nelle urine. Le malattie metaboliche ereditarie più comuni che si verificano con acidosi metabolica grave sono l’acidemia propionica, metilmalonica e isovalerica. I disturbi del metabolismo del piruvato e della catena respiratoria mitocondriale, che si manifestano in tenera età, di solito portano ad una grave acidosi metabolica.

Acido urico
L'acido urico è il prodotto finale del metabolismo delle purine. Le basi puriniche - adenina, guanina, ipoxantina e xantina - vengono ossidate ad acido urico. L'acido urico è sintetizzato principalmente nel fegato, nel sangue non è legato alle proteine, quindi quasi tutto viene filtrato nei reni. Un aumento della concentrazione di acido urico nelle urine è strettamente correlato ad un aumento del suo livello nel plasma sanguigno.

L'aumento della produzione e dell'escrezione di acido urico (iperuricemia e iperuricosuria) deriva dall'iperattività (un fenomeno unico tra le malattie metaboliche ereditarie) o dalla carenza di enzimi coinvolti nella sintesi de novo delle purine, risparmiando le vie del loro metabolismo, o da una ridotta formazione di inosina monofosfato da adenosina monofosfato nel ciclo nucleotidico purinico. L'iperuricemia secondaria si osserva anche nell'intolleranza ereditaria al fruttosio, nel deficit di fruttosio-1,6-defosfatasi, nella glicogenosi di tipo I, III, V, VII e nell'insufficienza dell'acetil-CoA deidrogenasi degli acidi grassi a catena media.

ANALISI DEI METABOLITI MEDIANTE METODI QUANTITATIVI SPECIALI
I metodi di analisi cromatografici svolgono un ruolo importante nella diagnosi delle malattie metaboliche ereditarie. Il moderno arsenale di tecnologie cromatografiche è estremamente ampio, il che consente di separare in modo efficace e informativo miscele complesse e multicomponenti, che includono materiale biologico. Per l'analisi quantitativa dei metaboliti nelle malattie metaboliche ereditarie, vengono utilizzati con successo metodi cromatografici come la cromatografia a gas e liquida ad alte prestazioni, la cromatografia-spettrometria di massa. La gascromatografia e la gascromatografia ad alte prestazioni sono i metodi più versatili per separare miscele complesse di composti, caratterizzati da elevata sensibilità e riproducibilità. In entrambi i casi la separazione viene effettuata a seguito della diversa interazione dei componenti della miscela con le fasi stazionaria e mobile della colonna cromatografica. Per la gascromatografia, la fase mobile è un gas vettore, per la gascromatografia ad alte prestazioni è un liquido (eluente). L'uscita di ciascun composto viene registrata dal rilevatore del dispositivo, il cui segnale viene convertito in picchi sul cromatogramma. Ogni picco è caratterizzato da tempo di ritenzione e area. Va notato che, di norma, la gascromatografia viene eseguita ad alta temperatura, pertanto l'instabilità termica dei composti rappresenta un limite al suo utilizzo. Per la gascromatografia ad alte prestazioni non esistono tali restrizioni, poiché in questo caso l'analisi viene eseguita in condizioni blande. La spettrometria di cromatomassa è un sistema combinato di gascromatografia o gascromatografia ad alte prestazioni con un rilevatore selettivo di massa, che consente di ottenere non solo informazioni quantitative ma anche qualitative, ovvero viene determinata ulteriormente la struttura dei composti nella miscela analizzata.

acidi organici
Nella genetica biochimica, il termine "acidi organici" si riferisce a piccoli acidi carbossilici idrosolubili (peso molecolare - inferiore a 300 kDa), che sono prodotti intermedi o finali del metabolismo di aminoacidi, carboidrati, lipidi e ammine biogene.

Per determinare gli acidi organici vengono utilizzati diversi metodi cromatografici: cromatografia liquida ad alta prestazione, cromatografia-spettrometria di massa e gascromatografia ad alta prestazione seguita da spettrometria di massa tandem. In un campione di urina si possono trovare oltre 250 diversi acidi organici e coniugati di glicina. La loro concentrazione dipende dalla dieta, dai farmaci e da altri motivi fisiologici. Sono note circa 65 malattie metaboliche ereditarie, caratterizzate da un profilo specifico di acidi organici. Una quantità relativamente piccola di acidi organici è altamente specifica, la loro presenza in alte concentrazioni nelle urine consente di stabilire con precisione la diagnosi: succinilacetone nella tirosinemia di tipo I, N-acetilaspartato nella malattia di Canavan, acido mevalonico nell'aciduria mevalonica. Nella stragrande maggioranza dei casi, la diagnosi di malattie metaboliche ereditarie basata solo sull'analisi degli acidi organici nelle urine è piuttosto difficile da stabilire, pertanto è necessaria un'ulteriore diagnostica di conferma.

L'interpretazione dei risultati dell'analisi degli acidi organici nelle urine presenta alcuni problemi, sia a causa del gran numero di acidi escreti e dei loro derivati, sia a causa dei profili sovrapposti di alcuni metaboliti dei farmaci. Per una diagnosi accurata, i dati ottenuti dall'analisi degli acidi organici devono essere correlati alle caratteristiche cliniche della malattia ed essere confermati dai risultati di altri metodi di analisi di laboratorio (analisi di aminoacidi, lattato, piruvato, acilcarnitine nel sangue, attività enzimatica e dati genetici molecolari).

La concentrazione di acidi organici nelle malattie metaboliche ereditarie è caratterizzata da un intervallo abbastanza ampio: da un aumento del loro livello di diverse centinaia di volte a un leggero eccesso, vicino alla norma. Ad esempio, nell'aciduria glutarica di tipo I, i livelli di acido glutarico possono essere normali in alcuni pazienti; in caso di insufficienza dell'acetil-CoA deidrogenasi a catena media degli acidi grassi, la concentrazione degli acidi adipico, sebacico e suberico può rientrare nell'intervallo normale. Il rilevamento di un profilo anomalo degli acidi organici nelle urine è talvolta possibile solo nei pazienti in fase di scompenso metabolico. Ciò è particolarmente vero per le forme benigne e lievi di malattie che, di regola, si manifestano tardivamente.

Aminoacidi e acilcarnitine
La determinazione della concentrazione di aminoacidi e acilcarnitine viene effettuata mediante spettrometria di massa tandem. La spettrometria di massa è un metodo analitico che può essere utilizzato per ottenere informazioni sia qualitative (struttura) che quantitative (peso molecolare o concentrazione) delle molecole analizzate dopo che sono state convertite in ioni. La differenza essenziale tra la spettrometria di massa e altri metodi fisico-chimici analitici è che lo spettrometro di massa determina direttamente la massa delle molecole e dei loro frammenti. I risultati vengono presentati graficamente (il cosiddetto spettro di massa). A volte non è possibile analizzare miscele complesse di molecole multicomponenti senza prima separarle. Le molecole possono essere separate mediante cromatografia o utilizzando due spettrometri di massa collegati in serie - spettrometria di massa tandem. Il metodo della spettrometria di massa tandem è stato utilizzato per la prima volta negli anni '70. del secolo scorso e ha trovato applicazione in chimica, biologia e medicina. Questo metodo viene utilizzato per chiarire la struttura di sostanze sconosciute, nonché per analizzare miscele complesse con una purificazione minima del campione.

Prima dell'analisi spettrometrica di massa, è necessario convertire le particelle neutre di una sostanza in ioni carichi e trasferirle dallo stato liquido allo stato gassoso. A questo scopo è stato inizialmente utilizzato il metodo della ionizzazione mediante bombardamento di atomi veloci; più recentemente si è preferito il metodo della ionizzazione in elettrospray. Con l'avvento di nuovi metodi di ionizzazione, l'uso della spettrometria di massa tandem nel campo della biochimica analitica è diventato più accessibile. La prima analisi delle acilcarnitine mediante spettrometria di massa tandem è stata eseguita da David Millington et al., che hanno utilizzato la derivatizzazione chimica di campioni biologici per formare esteri butilici delle acilcarnitine. Nel 1993, Donald Chase et al. hanno adattato questo metodo per l'analisi degli aminoacidi nelle macchie di sangue essiccato, costituendo così la base per lo screening di molteplici componenti nelle malattie metaboliche ereditarie. Da allora il metodo è stato adattato ai test su larga scala necessari per lo screening neonatale.

L'analisi della spettrometria di massa tandem è più efficace per i composti che hanno ioni figli simili o molecole neutre, come l'analisi di amminoacidi e acilcarnitine. È inoltre necessario sottolineare la possibilità di analisi MS/MS di vari gruppi chimici in un'unica analisi in un tempo molto breve (~2 min). Ciò fornisce un'ampia gamma di test e un'elevata produttività, il che risulta conveniente per lo screening di un gran numero di malattie. Sulla base dell'aumento della concentrazione di alcune acilcarnitine si possono sospettare malattie del gruppo dei disturbi della p-ossidazione mitocondriale dovute al cambiamento del profilo degli aminoacidi - aminoacidopatia. Utilizzando la spettrometria di massa tandem, è possibile rilevare metaboliti estranei degli acidi biliari che compaiono nei disturbi del metabolismo del colesterolo e dei lipidi, degli acidi biliari e nei difetti della biogenesi dei perossisomi. In diverse patologie epatobiliari colestatiche (malattia epatica cronica ad eziologia sconosciuta, sindrome di Zellweger, deficit di proteine ​​bifunzionali perossisomiali, tirosinemia di tipo I, atresia biliare, colestasi intraepatica familiare progressiva di tipo indeterminato), utilizzando la spettrometria di massa tandem, è possibile determinare la concentrazione di acidi biliari coniugati in vari fluidi biologici.

Vengono descritti i metodi per la determinazione degli acidi grassi a catena molto lunga: eicosanoico (C20:0), docosanoico (C22:0), tetracosanoico (C24:0), esacosanoico (C26:0), nonché acidi fitanici e pristanici - utilizzando la spettrometria di massa tandem nelle macchie di plasma e sangue, potenzialmente adatta per lo screening di molte malattie perossisomiali.

La diagnosi dei disturbi del metabolismo delle purine e delle pirimidine (deficit di nucleoside fosforilasi purinico, ornitina transcarbamilasi, cofattore molibdeno, adenilosuccinasi, deidropirimidina deidrogenasi) si basa sulla presenza di metaboliti anomali o sull'assenza di metaboliti normali nel siero, nelle urine o nelle cellule del sangue. Pertanto, sono stati sviluppati metodi rapidi di spettrometria di massa tandem che consentono la determinazione quantitativa di 17-24 purine e pirimidine nelle urine in un'unica analisi.

La spettrometria di massa tandem può essere utilizzata anche per studiare altre classi di metaboliti. Pertanto, è stato sviluppato un nuovo metodo di spettrometria di massa tandem per la misurazione dell'esoso monofosfato totale nelle macchie di sangue, un marcatore del galattosio-1-fosfato, che può essere utilizzato nello screening della galattosemia.

La determinazione delle catecolamine nelle urine è importante per diagnosticare disturbi del metabolismo delle catecolamine e dei neurotrasmettitori. Svantaggi significativi dei metodi esistenti sono i lunghi tempi di analisi e la possibile interferenza di farmaci e dei loro metaboliti strutturalmente simili alle catecolamine. Nuovi metodi in combinazione con la preparazione del campione specifica per composti contenenti gruppi catecoli consentono una diagnosi rapida di questo gruppo di malattie, eliminando le carenze dei metodi HPLC.

Ricerca sulle proteine
La stragrande maggioranza delle malattie metaboliche ereditarie è causata da una violazione dell'attività degli enzimi, pertanto, nella diagnosi di queste malattie, l'individuazione di una diminuzione dell'attività di enzimi specifici è il metodo più importante e talvolta l'unico affidabile per confermando la diagnosi.

DETERMINAZIONE DELL'ATTIVITÀ ENZIMATICA
Attualmente la diagnosi post- e prenatale di molte malattie metaboliche ereditarie (soprattutto malattie da accumulo lisosomiale) viene effettuata utilizzando metodi di analisi dell'attività enzimatica. Il materiale per misurare l'attività degli enzimi nelle malattie metaboliche ereditarie sono principalmente i leucociti del sangue periferico: in quasi tutte le malattie da accumulo lisosomiale, l'aciduria metilmalonica e alcune glicogenosi. Il plasma sanguigno o il siero vengono utilizzati per diagnosticare le gangliosidosi GM2 e il deficit di biotinidasi. In alcuni casi, gli oggetti di studio sono il tessuto muscolare o epatico, la coltura dei fibroblasti cutanei.

I substrati per gli enzimi possono essere cromogenici, fluorogenici, contenere un'etichetta radioattiva. Per misurare l'attività degli enzimi, vengono utilizzati metodi spettrofotometrici, fluorimetrici e per misurare la radioattività. Il principio generale dell'uso di substrati fluorogenici è che il substrato è un derivato chimico del fluorocromo che non è in grado di fluorescenza nello stato iniziale, ma sotto l'azione delle molecole degli enzimi corrispondenti, il substrato viene scisso cataliticamente per rilasciare fluorocromo, il la cui fluorescenza può essere misurata. I metodi spettrofotometrici consentono di misurare l'assorbimento dei prodotti della reazione enzimatica ottenuti dopo l'introduzione di substrati cromogenici. Per molti enzimi (ad esempio le deidrogenasi), i prodotti di reazione risultanti possono essere cromogenici. Esistono numerosi substrati fluorogenici per lo studio di vari enzimi: esterasi di diversa specificità, perossidasi, peptidasi, fosfatasi, solfatasi, lipasi, ecc. Substrati radiomarcati vengono utilizzati nella diagnosi di aciduria organica, difetti nell'ossidazione P mitocondriale , disturbi del metabolismo dei carboidrati e malattie da accumulo lisosomiale.

Ogni reazione enzimatica richiede determinate condizioni: pH e composizione della miscela tampone, substrato(i) specifico(i), presenza di attivatori e cofattori, condizioni di temperatura, ecc. Quasi ogni cellula contiene il proprio set di enzimi, quindi la loro distribuzione nei tessuti varia in modo significativo . Molti enzimi sono presenti nei tessuti in varie forme (isoenzimi). Nella maggior parte dei casi ciò è dovuto alla presenza di subunità polipeptidiche che, se combinate, formano diversi isoenzimi. La distribuzione degli isoenzimi può variare da tessuto a tessuto. Alcuni enzimi si trovano solo in un particolare organo o tessuto.

Malattie da accumulo lisosomiale
La determinazione dell'attività enzimatica è il "gold standard" per la diagnosi di conferma delle malattie da accumulo lisosomiale. Per analizzare l'attività degli enzimi, vengono utilizzati substrati cromogenici e fluorogenici. I substrati fluorogenici a base di 4-metilumberifelone sono sempre molto sensibili; con il loro aiuto è possibile determinare l'attività degli enzimi anche in microquantità di materiale biologico (macchie di sangue essiccato). Di norma, l'attività degli enzimi nei pazienti con malattie da accumulo lisosomiale è inferiore al 10% della norma e i test biochimici facilitano la diagnosi accurata. Ci sono una serie di fattori che rendono difficile l’interpretazione degli studi biochimici. Uno di questi è la presenza di alleli “pseudo-carenza”, che portano a cambiamenti nella struttura dell’enzima e non consentono alla proteina di scindere adeguatamente il substrato artificiale in vitro, mentre questo enzima non mostra una diminuzione di attività con un substrato naturale. Questo fenomeno è stato descritto per l'arilsolfatasi A, la p-galattosidasi, la p-glucuronidasi, l'a-iduronidasi, l'a-galattosidasi, la galattocerebrosidasi.

Ricerca sui geni mutanti
Lo sviluppo di metodi di biologia molecolare ha rappresentato una vera rivoluzione nel campo della biochimica clinica. Lo sviluppo di protocolli standard per gli studi molecolari e l'automazione dei metodi oggi utilizzati costituisce un insieme completo di approcci diagnostici che possono diventare una procedura di routine nei laboratori clinici. Il rapido sviluppo della ricerca nel campo della decifrazione del genoma umano e della determinazione della sequenza del DNA dei geni rende possibile la diagnosi del DNA di varie malattie ereditarie. Nell'ultimo decennio sono stati utilizzati metodi di diagnostica del DNA, analisi della struttura dei geni normali e dei loro analoghi mutanti nelle malattie metaboliche ereditarie.

Per la diagnostica del DNA delle malattie ereditarie vengono utilizzati due approcci principali: la diagnostica del DNA diretta e indiretta. La diagnostica diretta del DNA è uno studio della struttura primaria di un gene danneggiato e l'isolamento delle mutazioni che portano a una malattia. Per rilevare il danno molecolare nei geni che causano malattie ereditarie, utilizzare l'arsenale standard di metodi di biologia molecolare. A seconda delle caratteristiche e dei tipi di mutazioni, della prevalenza in varie malattie ereditarie, alcuni metodi sono più preferibili.

Per la diagnosi di malattie metaboliche ereditarie nei casi in cui il difetto biochimico è noto con precisione, determinato in modo semplice e affidabile utilizzando metodi biochimici, è improbabile che i metodi del DNA occupino un posto prioritario. In questi casi, l’uso dell’analisi del DNA è più un approccio di ricerca che diagnostico. Dopo una diagnosi accurata, i metodi di analisi del DNA saranno utili per la successiva diagnosi prenatale, l'identificazione dei portatori eterozigoti nella famiglia e la prognosi della malattia negli omozigoti, nonché per la selezione dei pazienti per la futura terapia casuale (sostituzione enzimatica e terapia genetica). Inoltre, nei casi in cui il difetto biochimico non è esattamente noto, la diagnosi biochimica è difficile, non sufficientemente affidabile o richiede metodi di ricerca invasivi, il metodo diagnostico del DNA è l'unico e indispensabile per una diagnosi accurata.

In generale, la tattica per diagnosticare le malattie metaboliche ereditarie in ciascun caso specifico dovrebbe essere pianificata insieme a un biochimico e un genetista. Le condizioni necessarie per una diagnosi rapida e efficace sono la comprensione dell'eziologia, dei meccanismi della patogenesi della malattia, la conoscenza di specifici marcatori biochimici.

Controllo qualità di laboratorio
Uno dei componenti più importanti di qualsiasi diagnostica di laboratorio è il costante controllo di qualità della ricerca. In un settore così complesso e sfaccettato come quello delle malattie metaboliche ereditarie, il controllo di qualità esterno ed interno è di particolare importanza. Ciò è dovuto al fatto che il laboratorio si occupa di malattie rare e, di norma, non è possibile acquisire un'esperienza sufficiente nella diagnosi di ciascuna malattia. Inoltre, le attrezzature di laboratorio e gli approcci metodologici possono differire da un laboratorio all'altro.

Descrizione

Preparazione

Indicazioni

Interpretazione dei risultati

Documenti da completare

Descrizione

Metodo di determinazione

Spettrometria di massa tandem con ionizzazione elettrospray.

Materiale in studio Sangue capillare raccolto su una speciale carta filtrante n. 903

Analisi dello spettro degli aminoacidi e delle acilcarnitine mediante spettrometria di massa tandem (TMS)

Cosa sono i disturbi metabolici? I disordini metabolici ereditari o in altre parole il metabolismo sono circa 500 malattie diverse causate dal malfunzionamento di speciali catalizzatori biochimici: gli enzimi. Gli enzimi forniscono processi per la scomposizione di aminoacidi, acidi organici, acidi grassi e altre biomolecole. Molti credono erroneamente che, poiché le malattie di questo gruppo sono estremamente rare, dovrebbero essere escluse per ultime. Tuttavia, secondo la letteratura*, un neonato su 3000 soffre di disturbi metabolici ereditari!

Un posto speciale tra queste malattie è occupato dalle malattie che iniziano nella prima infanzia. Queste malattie sono spesso combinate con gravi patologie neonatali e/o si manifestano sotto forma di condizioni come sepsi, danni perinatali al sistema nervoso, infezioni intrauterine. Il rilevamento tardivo delle malattie di questo gruppo può portare a gravi disabilità o addirittura alla morte. È stato accertato che il 5%** di tutti i casi di "sindrome della morte improvvisa del lattante" sono il risultato di disturbi metabolici ereditari. Tuttavia, alcune di queste malattie vengono trattate efficacemente con una diagnosi tempestiva. Uno dei metodi moderni per diagnosticare i disturbi metabolici è la spettrometria di massa tandem (TMS). Questo metodo consente di determinare in una piccola quantità di materiale biologico (una goccia di sangue essiccato), che consente di sospettare una malattia ereditaria con una certa probabilità. In alcuni paesi, questo metodo viene utilizzato per sottoporre a screening tutti i neonati per individuare 10-30 disturbi metabolici ereditari. In altre parole, tutti i neonati vengono sottoposti a uno speciale studio biochimico chiamato screening. * Vilarinho L, Rocha H, Sousa C, Marcão A, Fonseca H, Bogas M, Osório RV. Quattro anni di screening neonatale ampliato in Portogallo con spettrometria di massa tandem. J Eredita Metab Dis. 23 febbraio 2010 ** Olpin SE L'indagine metabolica della morte improvvisa infantile. Ann Clin Biochem, 2004, 41 luglio (Pt4), 282-293 **Opdal SH, Rognum TO Il gene della sindrome della morte improvvisa infantile: esiste? Pediatria, 2004, V.114, N.4, pp. e506-e512 Cos'è lo screening? Lo screening (dall'inglese Screening - screening) è un esame di massa dei pazienti per identificare varie malattie, la cui diagnosi precoce può prevenire lo sviluppo di gravi complicanze e disabilità. Quali malattie sono obbligatorie per lo screening neonatale nel nostro Paese? In Russia esiste un programma statale che prevede l'esame obbligatorio (screening) di tutti i neonati solo per 5 malattie ereditarie: fenilchetonuria (PKU), fibrosi cistica, galattosemia, sindrome adrenogenitale e ipotiroidismo congenito.

Attiriamo la vostra attenzione sul fatto che da questo elenco lo studio PHEEL include solo lo screening per la fenilchetonuria (per un elenco completo delle malattie metaboliche ereditarie rilevate utilizzando lo screening PHEEL, vedere sotto nel testo).

Per quali malattie il bambino può essere esaminato ulteriormente? Lo screening neonatale, finalizzato alla diagnosi dei disturbi metabolici mediante TMS, attualmente non viene effettuato in Russia. In Russia, questo studio viene ancora effettuato come prescritto da un medico se vi sono sospetti di malattie metaboliche ereditarie, sebbene molte malattie di questo gruppo non si manifestino immediatamente dopo la nascita, ma il neonato le ha già. Tuttavia, con il metodo della spettrometria di massa tandem (TMS) sopra menzionato è possibile esaminare ulteriormente un neonato per escludere 37 diverse malattie ereditarie che si riferiscono a disturbi metabolici di aminoacidi, acidi organici e difetti nella ß-ossidazione degli acidi grassi. Aminoacidopatia L'aminoacidopatia si sviluppa a causa della mancanza di enzimi specifici necessari per il metabolismo degli aminoacidi. Ciò porta a livelli anormalmente elevati di aminoacidi e loro derivati ​​nel sangue e nelle urine, che hanno un effetto tossico sulle cellule e sui tessuti del corpo. I sintomi principali sono ritardo dello sviluppo, convulsioni, coma, vomito, diarrea, odore insolito di urina, disturbi della vista e dell'udito. Il trattamento consiste nel prescrivere una dieta speciale e vitamine. L’efficacia della terapia dipende dalla tempestività e dall’accuratezza con cui viene fatta la diagnosi. Sfortunatamente, alcune malattie di questo gruppo non sono curabili. Aciduria/acidemia organica L'aciduria/acidemia organica è il risultato di un difetto nella scomposizione chimica degli aminoacidi dovuto ad un'attività enzimatica insufficiente. Le loro manifestazioni cliniche sono simili a quelle dell'aminoacidopatia. Il trattamento consiste nel prescrivere una dieta speciale e/o vitamine. Sfortunatamente, alcune malattie di questo gruppo non sono curabili. Difetti nella ß-ossidazione degli acidi grassi La ß-ossidazione degli acidi grassi è un processo a più fasi della loro scissione, a seguito del quale si forma l'energia necessaria per la vita della cellula. Ogni fase del processo di ossidazione viene effettuata sotto l'azione di enzimi specifici. In assenza di uno degli enzimi, il processo viene interrotto. Sintomi: sonnolenza, coma, vomito, bassi livelli di zucchero nel sangue, danni al fegato, cuore, muscoli. Il trattamento consiste nella nomina di una dieta a basso contenuto di grassi con alimentazione frequente e frazionata, altri prodotti dietetici specializzati e levocarnitina. Un elenco completo delle malattie metaboliche ereditarie rilevate

1. Malattia con odore di urina di sciroppo d'acero (leucinosi).
2. Citrulinemia tipo 1, citrulinemia neonatale.
3. Aciduria argininosuccinica (ASA) / deficit di argininosuccinato liasi liasi.
4. Carenza di ornitina transcarbamilasi.
5. Carenza di carbamilfosfato sintasi.
6. Carenza di N-acetilglutammato sintasi.
7. Iperglicinemia non chetotica.
8. Tirosinemia di tipo 1.
9. Tirosinemia di tipo 2.
10. Omocistinuria/deficit di cistationina beta sintetasi.
11. Fenilchetonuria.
12. Carenza di argininemia/arginasi.
13. Acidemia propionica (carenza di propionil CoA carbossilasi).
14. Acidemia metilmalonica.
15. Acidemia isovalerica (carenza di isovaleril CoA deidrogenasi).
16. Carenza di 2-metilbutirril CoA deidrogenasi.
17. Carenza di isobutiril CoA deidrogenasi.
18. Acidemia glutarica di tipo 1 (carenza di glutaril-CoA deidrogenasi di tipo 1).
19. Carenza di 3-metilcrotonil CoA carbossilasi.
20. Deficit multiplo di carbossilasi.
21. Carenza di biotinidasi.
22. Acidemia malonica (carenza di malonil CoA decarbossilasi).
23. Deficit mitocondriale di acetoacetil CoA tiolasi.
24. Carenza di 2-metil-3-idrossibutirril CoA deidrogenasi.
25. Carenza di 3-idrossi-3-metilglutaril CoA liasi.
26. Carenza di 3-metilglutaconil CoA idratasi.
27. Carenza di acil-CoA deidrogenasi a catena media.
28. Carenza di acil-CoA deidrogenasi a catena molto lunga.
29. Carenza di acil-CoA deidrogenasi a catena corta.
30. Carenza di 3-idrossiacil-CoA deidrogenasi a catena lunga (difetto della proteina trifunzionale).
31. Acidemia glutarica di tipo II (carenza di glutaril-CoA deidrogenasi di tipo II), deficit multiplo di acil-CoA deidrogenasi.
32. Interruzione del trasporto della carnitina.
33. Carenza di carnitina palmitoil transferasi di tipo I.
34. Carenza di carnitina palmitoil transferasi di tipo II.
35. Carenza di traslocasi carnitina/acilcarnitina.
36. Carenza di 2,4-dienoil CoA reduttasi.
37. Carenza di 3-chetoacil-CoA tiolasi a catena media.
38. Carenza di acil-CoA deidrogenasi a catena media/corta.

Materiale per la ricerca: sangue capillare raccolto su una speciale carta filtrante n. 903.

Letteratura

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2. Leonard J.V., Dezateux C. Screening per la malattia metabolica ereditaria nei neonati mediante spettrometria di massa tandem. BMJ. 2002; vol. 324(7328); P. 4-5.
3. Millington D., Kodo N., Terada N., Roe D., Chace D. Analisi di marcatori diagnostici di disordini genetici nel sangue e nelle urine umani mediante spettrometria di massa tandem con spettrometria di massa di ioni secondari liquidi.1991 Int.J.Mass Spectr .Processo ionico. 111:211-28.
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Preparazione

Cosa fare se è necessario esaminare un bambino per disturbi metabolici ereditari?

• Su appuntamento di un medico o autonomamente presso qualsiasi studio medico INVITRO, è necessario acquistare in anticipo un kit di test, che comprende:

Preparazione allo studio e regole per il prelievo di sangue dai neonati

1. Il prelievo di campioni di sangue dai neonati viene effettuato negli istituti ostetrici da un dipendente appositamente formato e, in caso di dimissione anticipata di un neonato (fino a 4 giorni di vita), da un'infermiera di patrocinio appositamente addestrata.
2. Quando si esaminano i neonati, il prelievo di sangue deve essere effettuato non prima di 4 giorni nei neonati a termine e 7 giorni nei neonati prematuri. Nei neonati, il sangue viene prelevato dal tallone, nei bambini di età superiore a 3 mesi, dal dito.
3. Nei neonati devono trascorrere almeno 4 giorni dall'inizio dell'allattamento al seno o artificiale al prelievo di sangue. Il prelievo di sangue viene effettuato 3 ore dopo l'alimentazione (nei neonati - prima dell'alimentazione successiva).
4. Prima di prelevare il sangue da un neonato, il piede del bambino deve essere lavato accuratamente con sapone, asciugato con un tampone sterile inumidito con alcool al 70%, quindi l'area trattata deve essere asciugata con un panno sterile e asciutto!
5. La puntura viene effettuata con uno scarificatore sterile monouso ad una profondità di 2,0 mm (le zone di puntura sono mostrate su). La prima goccia di sangue viene rimossa con un tampone sterile e asciutto.
6. Mediante una leggera pressione sul tallone, contribuiscono all'accumulo di una seconda goccia di sangue, sulla quale viene applicata perpendicolarmente una speciale carta filtro e imbevuta completamente e attraverso 5 zone delineate da una linea circolare. Le macchie di sangue non devono essere più piccole della dimensione indicata sul modulo, la tipologia delle macchie deve essere la stessa su entrambi i lati. Non utilizzare mai il lato opposto della carta da filtro per riempire i cerchi.
7. Dopo aver prelevato il sangue, asciugare l'area della puntura con un tampone sterile e applicare un cerotto battericida sul sito della puntura. Attenzione! L'accuratezza e l'affidabilità dello studio dipendono dalla qualità del prelievo di sangue!
8. Asciugare una speciale carta da filtro per almeno 2-4 ore a temperatura ambiente. Evitare la luce solare diretta! Per fare ciò, ritrarre il lembo esterno della carta e portare il suo bordo sotto la superficie opposta del filtro (dove non sono indicati i cerchi), . Dopo che le gocce di sangue si sono completamente asciugate, spostare l'aletta della scheda sulla superficie del filtro. Firmare il Cognome e l'I.O. del bambino in fondo alla scheda (Nome) e indicare la data del prelievo di sangue (Data). Metti la carta in una busta piccola e inseriscila in una busta grande prefirmata. Compila il modulo d'ordine e allegalo anche nella busta grande.
9. Consegnare la busta grande allo studio medico INVITRO più vicino (la busta non è sigillata). Un addetto INVITRO controllerà in tua presenza il contenuto della busta e la correttezza della compilazione del modulo d'ordine.

Conservazione e trasporto: prima e dopo il prelievo di sangue, conservare il kit a temperatura ambiente in un luogo asciutto; evitare il contatto con impianti di riscaldamento; evitare la luce solare diretta; durante il trasporto, imballare i set in un sacchetto di plastica sigillato.

Indicazioni per l'appuntamento

• Casi simili di malattia in famiglia.
• Casi di morte improvvisa di un bambino in tenera età in famiglia.
• Un netto peggioramento delle condizioni del bambino dopo un breve periodo di sviluppo normale (il periodo asintomatico può variare da alcune ore a diverse settimane).
• Odore insolito del corpo e/o delle urine (“dolce”, “topo”, “cavolo bollito”, “piedi sudati”, ecc.).
• Disturbi neurologici: disturbi della coscienza (letargia, coma), vari tipi di convulsioni convulsive, cambiamenti nel tono muscolare (ipotensione muscolare o tetraparesi spastica).
• Disturbi del ritmo respiratorio (bradipnea, tachipnea, apnea).
• Violazioni da altri organi e sistemi (danno epatico, epatosplenomegalia, cardiomiopatia, retinopatia).
• Cambiamenti nei parametri di laboratorio del sangue e delle urine - neutropenia, anemia, acidosi / alcalosi metabolica, ipoglicemia / iperglicemia, aumento dell'attività degli enzimi epatici e dei livelli di creatina fosfochinasi, chetonuria.
• Diagnostica aggiuntiva di 37 malattie metaboliche ereditarie insieme al programma statale obbligatorio per l'individuazione di 5 malattie ereditarie: screening dei neonati: "TALLONE".

Interpretazione dei risultati

L'interpretazione dei risultati del test contiene informazioni per il medico curante e non costituisce una diagnosi. Le informazioni contenute in questa sezione non devono essere utilizzate per l'autodiagnosi o l'autotrattamento. Il medico effettua una diagnosi accurata utilizzando sia i risultati di questo esame sia le informazioni necessarie provenienti da altre fonti: anamnesi, risultati di altri esami, ecc.

Unità di misura nel laboratorio INVITRO: µmol/litro. Valori di riferimento per i parametri determinati (interpretazione dettagliata dei risultati)

Interpretazione generale del risultato

malattie metaboliche ereditarie	Cambiamento nella concentrazione dei metaboliti
Malattia delle urine a sciroppo d’acero (leucinosi)	Leucina Valina
Citrulinemia tipo 1, citrulinemia neonatale	citrullina
Deficit di aciduria argininosuccinico (ASA)/argininosuccinato liasi liasi	citrullina
Carenza di ornitina transcarbamilasi	citrullina
Carenza di carbamilfosfato sintasi	citrullina
Deficit di N-acetilglutammato sintasi	citrullina
Iperglicinemia non chetotica	Glicina
Tirosinemia di tipo 1	Tirosina
Tirosinemia di tipo 2	Tirosina
Deficit di omocistinuria/cistationina beta sintetasi	Metionina
Fenilchetonuria	Fenilalanina
Carenza di argininemia/arginasi	Arginina
Acidemia propionica (carenza di propionil-CoA carbossilasi)	C3
Acidemia metilmalonica	C3 (C4DC)
Acidemia isovalerica (carenza di isovaleril-CoA deidrogenasi)	C5
Carenza di 2-metilbutirril CoA deidrogenasi	C5
Deficit di isobutirril CoA deidrogenasi	C4
Acidemia glutarica di tipo 1 (carenza di glutaril-CoA deidrogenasi di tipo 1)	С5DC
Carenza di 3-metilcrotonil CoA carbossilasi	C5OH
Deficit multiplo di carbossilasi	C5OH C3
Carenza di biotinidasi	C5OH
Acidemia malonica (carenza di malonil-CoA decarbossilasi)	С3DC
Deficit mitocondriale di acetoacetil CoA tiolasi	C5:1 C5OH
Carenza di 2-metil-3-idrossibutirril CoA deidrogenasi	C5:1 C5OH
Carenza di 3-idrossi-3-metilglutaril CoA liasi	C5OH C6DC
Carenza di 3-metilglutaconil CoA idratasi	С6DC
Carenza di acil-CoA deidrogenasi a catena media	C6 C8 C10 C10:1
Deficit di acil-CoA deidrogenasi a catena molto lunga	C14 C14:1 C14:2 C16:1
Deficit di acil-CoA deidrogenasi a catena corta	C4
Deficit di 3-idrossiacil-CoA deidrogenasi a catena lunga (difetto della proteina trifunzionale)	C16OH C18OH C18:1OH C18:2OH
Acidemia glutarica di tipo II (deficit di glutaril-CoA deidrogenasi di tipo II), deficit multiplo di acil-CoA deidrogenasi	C4 C5 C6 C8 C10 C12 C14 C16 C18
Trasporto compromesso della carnitina	C0 ↓ diminuzione totale delle acilcarnitine
Carenza di carnitina palmitoil transferasi di tipo I	C0 C16 ↓ C18:1 ↓ C18:2 ↓
Carenza di carnitina palmitoil transferasi di tipo II	C0 ↓ C16 C18:1 C18:2
Carenza di traslocasi di carnitina/acilcarnitina	C0 ↓ C16 C18:1 C18:2
Carenza di 2,4-dienoil CoA reduttasi	C10:2
Carenza di 3-chetoacil-CoA tiolasi a catena media	С6DC С8DC
Deficit di acil-CoA deidrogenasi a catena media/corta	C4OH C6OH

Cosa fare se lo studio rivela un cambiamento negli indicatori? Deve essere chiaro che i cambiamenti rilevati durante la TMS non confermano completamente la malattia e, in alcuni casi, è necessario sottoporsi a test aggiuntivi (vedere l'elenco dei test aggiuntivi e) per verificare l'affidabilità delle violazioni identificate. Si consiglia di consultare un genetista e un pediatra per sviluppare una tattica per un'azione congiunta. Letteratura utilizzata (valori di riferimento)

1. Wiley V., Carpenter K., Wilcken B. Screening neonatale con spettrometria di massa tandem: 12 mesi di esperienza nel NSW Australia. Acta Pediatrica 1999; 88(Suppl):48-51.
2. MS rash, Rahbeeni Z, Ozand PT. Applicazione della spettrometria di massa tandem elettrospray allo screening neonatale. Semin Perinatol 1999; 23:183-93.
3. Schulze A., Lindner M., Kohlmüller D., Olgemöller K., Mayatepek E., Hoffmann G.F. Screening neonatale ampliato per errori congeniti del metabolismo mediante ionizzazione elettrospray-spettrometria di massa tandem: risultati, esiti e implicazioni, Pediatria, 2003; 111; 1399-1406.
4. Hoffman G., Litsheim T., Laessig R. Implementazione della spettrometria di massa tandem nel programma di screening neonatale del Wisconsin. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2001; 50 (RR-3): 26–7.
5. Lin WD, Wu J.Y., Lai C.C., Tsai F.J., Tsai C.H., Lin S.P., Niu D.M. Uno studio pilota sullo screening neonatale mediante spettrometria di massa tandem con ionizzazione elettrospray a Taiwan. Acta Paediatr Taiwan 2001; 42:224-30.
6. Zytkovicz T.H., Fitzgerald E.F., Marsden D., Larson C.A., Shih V.E., Johnson D.M., et al. Analisi spettrometrica di massa tandem per disturbi degli aminoacidi, organici e degli acidi grassi nelle macchie di sangue essiccato dei neonati: un riepilogo di due anni dal programma di screening neonatale del New England. Clin Chem 2001;47:1945–55.

Laboratorio di malattie metaboliche ereditarieè stato creato presso il Centro di ricerca genetica medica più di 30 anni fa. Il primo lavoro in laboratorio è stato associato allo sviluppo di test per l'individuazione della fenilchetonuria e di programmi di screening selettivo per le malattie metaboliche ereditarie (HMD). A poco a poco, il laboratorio è passato all'uso di complessi metodi biochimici e genetici molecolari per la diagnosi accurata delle malattie ereditarie. È stato qui, sotto la guida della professoressa Xenia Dmitrievna Krasnopolskaya, che sono stati sviluppati gli approcci alla diagnosi biochimica delle malattie degli organelli cellulari. Oggi è l'unico laboratorio in Russia dove viene effettuata la diagnostica postnatale e prenatale della stragrande maggioranza delle malattie di questo gruppo.

Una delle direzioni scientifiche del lavoro del dipartimento è la ricerca di nuovi marcatori biochimici per le malattie ereditarie, lo sviluppo di nuovi metodi per la loro diagnosi efficace.

La gamma di metodi biochimici utilizzati in laboratorio è estremamente ampia e comprende: elettroforesi dei glicosaminoglicani urinari, isoelettrofocalizzazione delle transferrine, spettrometria cromatografica di massa, cromatografia liquida ad alta prestazione, analisi dell'attività degli enzimi lisosomiali e mitocondriali utilizzando substrati cromogenici e fluorogenici, e ossigrafia. Alcune forme di NBO, mai rilevate in precedenza nel nostro Paese, sono state diagnosticate per la prima volta in laboratorio.

Una svolta significativa nella diagnosi dell'NBO è stata l'introduzione del metodo della spettrometria di massa tandem, che consente di rilevare circa 30 forme di malattie ereditarie dai gruppi degli NBO più comuni in microquantità di materiale biologico (una macchia di sangue essiccato o plasma): aminoacidopatia, aciduria organica e difetti nella β-ossidazione mitocondriale.

Negli ultimi anni, i metodi di genetica molecolare sono stati attivamente sviluppati in laboratorio. Per alcune malattie del gruppo NBO, sono stati creati protocolli diagnostici del DNA per ridurre i tempi per stabilire una diagnosi ed evitare l'uso di metodi biochimici dispendiosi in termini di tempo e invasivi. Dal 2015, il laboratorio utilizza il sequenziamento di nuova generazione per analizzare più geni contemporaneamente. Tali pannelli sono progettati per malattie mitocondriali, malattie ereditarie con lesione primaria del fegato, leucodistrofie/leucoencefalopatie.

Ad oggi, i metodi biochimici e genetici molecolari utilizzati consentono di diagnosticare più di 200 forme diverse di malattie metaboliche ereditarie.

Il laboratorio sta lavorando alla caratterizzazione dello spettro e della frequenza delle mutazioni nelle mucopolisaccaridosi ereditarie, nelle sfingolipidosi, nella ceroide lipofuscinosi neuronale, sono in fase di sviluppo algoritmi per la diagnosi di malattie che si verificano con danni alla sostanza bianca del cervello, nonché altri disturbi neurometabolici ereditari .

Classificazione in 22 sottoclassi in base alla via metabolica interessata Sottoclassi: Frequenza Aminoacidopatia 31% Aciduria organica 27% Difetti del ciclo dell'urea 21% Difetti della catena respiratoria mitocondriale 12% Glicogenosi 8% Difetti della β-ossidazione mitocondriale 8% Malattie perossisomali 4%

Ereditarietà autosomica recessiva Fenilchetonuria 1:8.000 Malattia di Tay-Sachs 1: (tra gli ebrei ashkenaziti) 1:3.000 Malattia di Gaucher 1: Malattia di Krabbe 1: Adrenoleucodistrofia recessiva legata all'X 1: Mucopolisaccaridosi di tipo II1: Ereditarietà autosomica recessiva Fenilchetonuria 1:8.000 Malattia di Tay-Sachs 1: (tra gli ebrei ashkenaziti) 1:3.000 Malattia di Gaucher 1: Malattia di Krabbe 1: Tipo di ereditarietà recessiva legata all'X Adrenoleucodistrofia legata all'X 1: Mucopolisaccaridosi di tipo II1: Incidenza della malattia Frequenza

Perché identificare le NBO? La NBO comprende un numero limitato di malattie monogeniche estremamente rare. La stragrande maggioranza delle NBO incurabili rappresenta un’ampia classe di malattie rare monogeniche con un’elevata incidenza cumulativa (almeno 1 su 5.000 nati vivi). Molti degli NBO sono curabili. Per alcuni è possibile una correzione clinica completa. Con una diagnosi accuratamente stabilita, è possibile condurre la diagnostica prenatale (prenatale) in famiglia.

Metodi cromatografici utilizzati nella diagnosi degli aminoacidi NBO AC, aminoacidopatia EZHH Acidi organici di HC-MS Aciduria organica, aminoacidopatia di purine/pirimidine Disturbi VEZH/Pirimidine OdnsHK, Fitanic, Plazmologi dell'Accademia statale delle scienze Terina Sindrome GH-MS SLO Catecolamine , aminoacidi HPLC Malattie del metabolismo dei neurotrasmettitori HPLC mono- e disaccaridi Disturbi del metabolismo dei carboidrati Ormoni HPLC Endocrinopatie ereditarie Carnitina e suoi esteri GC-MS Disturbi della β-ossidazione mitocondriale

La spettrometria di massa tandem è una tecnologia moderna per la diagnosi di NBO Consente di analizzare un gran numero di metaboliti e quindi di identificare un gran numero di disturbi metabolici ereditari Il tempo di analisi per un campione è di diversi minuti Richiede una piccola quantità di materiale biologico (un punto di sangue secco)

Controllo m/z, amu 50% Intensità 100 STANDARD INTERNI Gly Ala Val Leu Met Cit Phe Tyr Glu Gly Ala Ser Pro Val Leu + Ile Gln Tyr Phe Glu Asp Aminoacidi

Malattia dello sciroppo d'acero nelle urine m/z, amu 50% Intensità 100

Tirosinemia m/z, amu 50% Intensità 100 STANDARD INTERNI Gly Ala Val Leu Met Cit Phe Tyr Glu Gly Ala Ser Pro Val Leu + Ile Gln Tyr Phe Glu Asp

M/z, amu % Intensità C3C3 STANDARD INTERNI C4C4 C5C5 C8 C16 Aciduria glutarica tipo 1 C6C6 C18 C10 C12 C14 C5DC

Spettrometria di massa tandem Spettrometria di massa tandem difetti di β-ossidazione deficit di SCAD deficit di MCAD (1:8000) deficit di VLCAD deficit di LCAHD deficit di CPT1 deficit di CPT2 Altri difetti di β-ossidazione Aciduria organica Aciduria glutarica tipo 1 (1:30.000) Acidemia propionica (1:50.000) Aciduria metilmalonica (1:48.000) Aciduria isovalerica (1:50.000) Aminoacidopatia Leucinosi (1:) PKU (1:8.000) Tirosinemia tipo 1 (1:) Iperglicinemia non chetotica (1:55.000) Citrulinemia (1 :)

Diagnosi del DNA Diagnosi di portatori di malattie (estremamente importante per le forme di malattie legate all'X e malattie comuni in alcuni gruppi etnici) Diagnosi di malattie con un difetto biochimico primario sconosciuto Diagnosi di malattie in cui i metodi biochimici sono complessi e richiedono procedure invasive (ad esempio, biopsia epatica) Diagnosi prenatale Diagnostica preimpianto

Quando prestano servizi medici, i medici devono innanzitutto rimanere esseri umani. Quando trovi un laboratorio di malattie metaboliche ereditarie con noi, non dimenticare di lasciare una recensione.

Il trattamento deve essere professionale, il Laboratorio delle Malattie Metaboliche Ereditarie: qui i medici forniranno servizi di qualità e cure senza conseguenze. Prenota un appuntamento in pochi minuti, nuove recensioni.

Nella tua città c'è un Laboratorio di analisi delle malattie metaboliche ereditarie, utilizza i servizi di ospedali e cliniche, medici secondo dati verificati. Fissare un appuntamento con i medici del Laboratorio di Malattie Metaboliche Ereditarie di Mosca attraverso il nostro sito web è diventato ancora più semplice!

Centro di ricerca genetica medica dell'Accademia russa delle scienze mediche. Il sito web del Laboratorio delle Malattie Metaboliche Ereditarie contiene informazioni sulla diagnosi di laboratorio delle malattie ereditarie rare, sulle loro manifestazioni cliniche e sulle opzioni terapeutiche. Sul sito: spettrometria di massa tandem / malattie rilevate dalla TMS / indicazioni per l'analisi TMS / malattie da accumulo lisosomiale / regole per il prelievo di sangue / listino prezzi / invio del campione per l'analisi / come raggiungerci / link utili

Come arrivare là

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Feedback e domande

Anna Mignenko, 01/09/2015

Ciao. Siamo di Stavropol. Il bambino ha 3,5 anni. Abbiamo consultato un genetista dell'SKKKDC in merito al ritardo psicomotorio con perdita di abilità precedentemente acquisite di origine sconosciuta e atassia di origine sconosciuta.
Sono state effettuate le seguenti operazioni. esami:
-studio citogenetico (cariotipo): 46,XX
-esame del sangue per FA - 0,7 mg%
- TLC di aminoacidi e carboidrati nel sangue - nessuna patologia
- TLC degli aminoacidi nelle urine: iperaminoaciduria generalizzata!
-analisi delle urine: leucociti++; test per l'acido xanturenico - debolmente positivo.
Nelle condizioni del laboratorio NBO, sono stati eseguiti quanto segue:
- analisi del sangue con il metodo TMS - non sono stati rilevati dati per aminoacidopatia ereditaria, aciduria organica e difetti nella beta-ossidazione mitocondriale;
- Diagnostica enzimatica per 6 malattie da accumulo: non sono state riscontrate deviazioni.
Ci è stata consigliata la consulenza di Ekaterina Yurievna Zakharova. Potete dirmi come possiamo contattarla e fissare un appuntamento?