Laboratorio di malattie metaboliche ereditarie. Ekaterina Zakharova: “Per evitare gravi conseguenze invalidanti, è necessaria una diagnosi precoce

Capo di
"Oncogenetica"

Zhusina
Julia Gennadievna

Laureato presso la Facoltà di Pediatria dell'Università medica statale di Voronezh. N.N. Burdenko nel 2014.

2015 - tirocinio in terapia presso il Dipartimento di Terapia della Facoltà dell'Università medica statale di Voronezh. N.N. Burdenko.

2015 - corso di certificazione nella specialità "Ematologia" sulla base del Centro di ricerca ematologica di Mosca.

2015-2016 – terapista del VGKBSMP n. 1.

2016 - è stato approvato il tema della tesi di laurea in scienze mediche "studio del decorso clinico della malattia e della prognosi in pazienti con malattia polmonare ostruttiva cronica con sindrome anemica". Coautore di più di 10 pubblicazioni. Partecipante a conferenze scientifiche e pratiche su genetica e oncologia.

2017 - corso di formazione avanzata sul tema: “interpretazione dei risultati di studi genetici in pazienti con malattie ereditarie”.

Dal 2017 residenza nella specialità "Genetica" sulla base di RMANPO.

Capo di
"Genetica"

Kanivets
Ilya Vyacheslavovich

Kanivets Ilya Vyacheslavovich, genetista, candidato alle scienze mediche, capo del dipartimento di genetica del centro genetico medico Genomed. Assistente del Dipartimento di Genetica Medica dell'Accademia Medica Russa di Formazione Professionale Continua.

Si è laureato presso la Facoltà di Medicina dell'Università Statale di Medicina e Odontoiatria di Mosca nel 2009 e nel 2011 ha conseguito la specializzazione nella specialità "Genetica" presso il Dipartimento di Genetica Medica della stessa università. Nel 2017 ha difeso la sua tesi per il grado di candidato in scienze mediche sul tema: Diagnostica molecolare delle variazioni del numero di copie dei segmenti di DNA (CNV) in bambini con malformazioni congenite, anomalie fenotipiche e/o ritardo mentale utilizzando oligonucleotide SNP ad alta densità microarray»

Dal 2011 al 2017 ha lavorato come genetista presso l'Ospedale Clinico Pediatrico. NF Filatov, dipartimento di consulenza scientifica dell'istituto scientifico di bilancio dello Stato federale "Centro di ricerca genetica medica". Dal 2014 ad oggi è stato responsabile del dipartimento di genetica dell'MHC Genomed.

Principali attività: diagnosi e gestione di pazienti con malattie ereditarie e malformazioni congenite, epilessia, consulenza genetica medica di famiglie in cui è nato un bambino con una patologia o malformazioni ereditarie, diagnostica prenatale. Durante la consultazione viene effettuata un'analisi dei dati clinici e della genealogia per determinare l'ipotesi clinica e la quantità necessaria di test genetici. Sulla base dei risultati dell'indagine, i dati vengono interpretati e le informazioni ricevute vengono spiegate ai consulenti.

È uno dei fondatori del progetto Scuola di Genetica. Effettua regolarmente presentazioni a convegni. Tiene conferenze per genetisti, neurologi e ostetrici-ginecologi, nonché per genitori di pazienti con malattie ereditarie. È autore e coautore di oltre 20 articoli e recensioni su riviste russe e straniere.

L'area di interesse professionale è l'introduzione dei moderni studi sull'intero genoma nella pratica clinica, l'interpretazione dei loro risultati.

Orario di ricevimento: mercoledì, venerdì 16-19

Capo di
"Neurologia"

Sharkov
Artem Alekseevich

Sharkov Artyom Alekseevich– neurologo, epilettologo

Nel 2012 ha studiato nell'ambito del programma internazionale “Medicina orientale” presso l'Università di Daegu Haanu in Corea del Sud.

Dal 2012 - partecipazione all'organizzazione del database e dell'algoritmo per l'interpretazione dei test genetici xGenCloud (https://www.xgencloud.com/, Project Manager - Igor Ugarov)

Nel 2013 si è laureato presso la Facoltà di Pediatria dell'Università Nazionale Russa di Ricerca Medica intitolata a N.I. Pirogov.

Dal 2013 al 2015 ha studiato in neurologia presso l'istituto scientifico di bilancio dello Stato federale "Centro scientifico di neurologia".

Dal 2015 lavora come neurologo, ricercatore presso l'Istituto clinico di ricerca scientifica di pediatria intitolato all'accademico Yu.E. Veltishchev GBOU VPO RNIMU loro. N.I. Pirogov. Lavora anche come neurologo e medico nel laboratorio di monitoraggio video-EEG nelle cliniche del Centro di Epilettologia e Neurologia intitolato ad A.I. AA Ghazaryan” e “Centro Epilessia”.

Nel 2015 ha studiato in Italia presso la scuola “2° Corso Residenziale Internazionale sulle Epilessie Farmacoresistenti, ILAE, 2015”.

Nel 2015 formazione avanzata – “Genetica clinica e molecolare per medici praticanti”, RCCH, RUSNANO.

Nel 2016 formazione avanzata - "Fondamenti di genetica molecolare" sotto la guida di bioinformatica, Ph.D. Konovalova F.A.

Dal 2016 - capo della direzione neurologica del laboratorio "Genomed".

Nel 2016 ha studiato in Italia presso la scuola “Corso avanzato internazionale San Servolo: Brain Exploration and Epilepsy Surger, ILAE, 2016”.

Nel 2016 formazione avanzata – “Tecnologie genetiche innovative per i medici”, “Istituto di Medicina di Laboratorio”.

Nel 2017 - la scuola "NGS in Medical Genetics 2017", Centro scientifico statale di Mosca

Attualmente sta conducendo ricerche scientifiche nel campo della genetica dell'epilessia sotto la guida del Professore MD. Belousova E.D. e professore, d.m.s. Dadali E.L.

È stato approvato il tema della tesi di laurea in scienze mediche "Caratteristiche cliniche e genetiche delle varianti monogeniche delle encefalopatie epilettiche precoci".

Le principali aree di attività sono la diagnosi e il trattamento dell'epilessia nei bambini e negli adulti. Specializzazione ristretta: trattamento chirurgico dell'epilessia, genetica dell'epilessia. Neurogenetica.

Pubblicazioni scientifiche

Sharkov A., Sharkova I., Golovteev A., Ugarov I. "Ottimizzazione della diagnostica differenziale e interpretazione dei risultati dei test genetici da parte del sistema esperto XGenCloud in alcune forme di epilessia". Genetica medica, n. 4, 2015, pag. 41.
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Sharkov A.A., Vorobyov A.N., Troitsky A.A., Savkina I.S., Dorofeeva M.Yu., Melikyan A.G., Golovteev A.L. "Chirurgia per l'epilessia nelle lesioni cerebrali multifocali nei bambini con sclerosi tuberosa". Abstract del XIV Congresso Russo "TECNOLOGIE INNOVATIVE IN PEDIATRIA E CHIRURGIA PEDIATRICA". Bollettino russo di perinatologia e pediatria, 4, 2015. - p.226-227.
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Dadali E.L., Belousova E.D., Sharkov A.A. "Approcci genetici molecolari alla diagnosi dell'epilessia monogenica idiopatica e sintomatica". Abstract del XIV Congresso Russo “TECNOLOGIE INNOVATIVE IN PEDIATRIA E CHIRURGIA PEDIATRICA”. Bollettino russo di perinatologia e pediatria, 4, 2015. - p.221.
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Sharkov A.A., Dadali E.L., Sharkova I.V. "Una rara variante dell'encefalopatia epilettica precoce di tipo 2 causata da mutazioni nel gene CDKL5 in un paziente maschio." Convegno “L'epilettologia nel sistema delle neuroscienze”. Raccolta materiali del convegno: / A cura di: prof. Neznanova N.G., prof. Mikhailova V.A. San Pietroburgo: 2015. - p. 210-212.
*
Dadali E.L., Sharkov A.A., Kanivets I.V., Gundorova P., Fominykh V.V., Sharkova I.V. Troitsky A.A., Golovteev A.L., Polyakov A.V. Una nuova variante allelica dell'epilessia mioclonica di tipo 3 causata da mutazioni nel gene KCTD7 // Genetica medica.-2015.- v.14.-№9.- p.44-47
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Dadali E.L., Sharkova I.V., Sharkov A.A., Akimova I.A. "Caratteristiche cliniche e genetiche e metodi moderni di diagnosi dell'epilessia ereditaria". Raccolta di materiali "Tecnologie biologiche molecolari nella pratica medica" / Ed. membro corrispondente RANEN A.B. Maslennikova.- Problema. 24.- Novosibirsk: Academizdat, 2016.- 262: p. 52-63
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Belousova E.D., Dorofeeva M.Yu., Sharkov A.A. Epilessia nella sclerosi tuberosa. In "Malattie cerebrali, aspetti medici e sociali" a cura di Gusev E.I., Gekht A.B., Mosca; 2016; pp.391-399
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Dadali E.L., Sharkov A.A., Sharkova I.V., Kanivets I.V., Konovalov F.A., Akimova I.A. Malattie e sindromi ereditarie accompagnate da convulsioni febbrili: caratteristiche cliniche e genetiche e metodi diagnostici. //Giornale russo di neurologia infantile.- T. 11.- N. 2, p. 33-41.doi: 10.17650/ 2073-8803-2016-11-2-33-41
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Sharkov A.A., Konovalov F.A., Sharkova I.V., Belousova E.D., Dadali E.L. Approcci genetici molecolari alla diagnosi delle encefalopatie epilettiche. Raccolta di abstract "VI CONGRESSO BALTICO SULLA NEUROLOGIA INFANTILE" / A cura della Professoressa Guzeva V.I. San Pietroburgo, 2016, pag. 391
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Emisferotomia nell'epilessia resistente ai farmaci in bambini con danno cerebrale bilaterale Zubkova N.S., Altunina G.E., Zemlyansky M.Yu., Troitsky A.A., Sharkov A.A., Golovteev A.L. Raccolta di abstract "VI CONGRESSO BALTICO SULLA NEUROLOGIA INFANTILE" / A cura della Professoressa Guzeva V.I. San Pietroburgo, 2016, pag. 157.
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Articolo: Genetica e trattamento differenziato delle encefalopatie epilettiche precoci. AA. Sharkov*, I.V. Sharkova, E.D. Belousova, E.L. Dadali. Giornale di Neurologia e Psichiatria, 9, 2016; Problema. 2doi:10.17116/jnevro20161169267-73
*
Golovteev A.L., Sharkov A.A., Troitsky A.A., Altunina G.E., Zemlyansky M.Yu., Kopachev D.N., Dorofeeva M.Yu. "Trattamento chirurgico dell'epilessia nella sclerosi tuberosa" a cura di Dorofeeva M.Yu., Mosca; 2017; p.274
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Nuove classificazioni internazionali dell'epilessia e delle crisi epilettiche della Lega Internazionale contro l'epilessia. Giornale di Neurologia e Psichiatria. C.C. Korsakov. 2017. V. 117. N. 7. S. 99-106

Capo di
"Diagnosi prenatale"

Kiev
Yulia Kirillovna

Nel 2011 si è laureata presso l'Università statale di medicina e odontoiatria di Mosca. A.I. Evdokimova con una laurea in Medicina Generale Ha studiato in specializzazione presso il Dipartimento di Genetica Medica della stessa università con una laurea in Genetica

Nel 2015 ha completato uno stage in Ostetricia e Ginecologia presso l'Istituto medico per l'educazione medica post-laurea dell'Istituto educativo di bilancio dello Stato federale di istruzione professionale superiore "MGUPP"

Dal 2013 svolge attività consultiva presso il Centro per la pianificazione e la riproduzione familiare, DZM

Dal 2017 è responsabile del dipartimento di Diagnostica Prenatale del laboratorio Genomed

Effettua regolarmente presentazioni a convegni e seminari. Tiene conferenze per medici di varie specialità nel campo della riproduzione e della diagnostica prenatale

Svolge consulenza medico-genetica alle donne in gravidanza sulla diagnostica prenatale al fine di prevenire la nascita di bambini con malformazioni congenite, nonché di famiglie con patologie presumibilmente ereditarie o congenite. Conduce l'interpretazione dei risultati ottenuti dalla diagnostica del DNA.

SPECIALISTI

Latypov
Artur Shamilevich

Latypov Artur Shamilevich – medico genetista della categoria di qualifica più alta.

Dopo essersi laureato presso la facoltà di medicina dell'Istituto medico statale di Kazan nel 1976, ha lavorato per molti anni prima come medico presso l'ufficio di genetica medica, poi come capo del centro di genetica medica dell'Ospedale repubblicano del Tatarstan, specialista capo del Ministero della Salute della Repubblica del Tatarstan, docente presso i dipartimenti dell'Università di Medicina di Kazan.

Autore di oltre 20 articoli scientifici sui problemi della genetica riproduttiva e biochimica, partecipante a numerosi congressi e conferenze nazionali e internazionali sui problemi della genetica medica. Ha introdotto metodi di screening di massa di donne incinte e neonati per malattie ereditarie nel lavoro pratico del centro, ha eseguito migliaia di procedure invasive per sospette malattie ereditarie del feto in diverse fasi della gravidanza.

Dal 2012 lavora presso il Dipartimento di Genetica Medica con un corso di diagnostica prenatale presso l'Accademia Russa di Formazione Post-laurea.

Interessi di ricerca – malattie metaboliche del bambino, diagnostica prenatale.

Orario ricevimento: mercoledì 12-15, sabato 10-14

I medici sono ammessi su appuntamento.

Genetista

Gabelko
Denis Igorevich

Nel 2009 si è laureato presso la facoltà di medicina della KSMU da cui prende il nome. S. V. Kurashova (specialità "Medicina").

Stage presso l'Accademia medica di formazione post-laurea di San Pietroburgo dell'Agenzia federale per la salute e lo sviluppo sociale (specialità "Genetica").

Stage in Terapia. Riqualificazione primaria nella specialità "Diagnostica ad ultrasuoni". Dal 2016 è dipendente del dipartimento del Dipartimento di Fondamenti Fondamentali di Medicina Clinica dell'Istituto di Medicina Fondamentale e Biologia.

Area di interessi professionali: diagnosi prenatale, utilizzo dei moderni metodi diagnostici e di screening per identificare la patologia genetica del feto. Determinazione del rischio di recidiva di malattie ereditarie in famiglia.

Partecipante a conferenze scientifiche e pratiche su genetica, ostetricia e ginecologia.

Esperienza lavorativa 5 anni.

Consultazione su appuntamento

I medici sono ammessi su appuntamento.

Genetista

Grishina
Cristina Aleksandrovna

Nel 2015 si è laureata in Medicina Generale presso l'Università statale di medicina e odontoiatria di Mosca. Nello stesso anno, è entrata nella specialità 30.08.30 "Genetica" presso l'istituto scientifico di bilancio dello Stato federale "Centro di ricerca genetica medica".
È stata assunta nel Laboratorio di genetica molecolare delle malattie ereditarie complesse (responsabile - Dottore in scienze biologiche Karpukhin A.V.) nel marzo 2015 come assistente di laboratorio di ricerca. Da settembre 2015 è stata trasferita all'incarico di ricercatrice. È autore e coautore di oltre 10 articoli e abstract su genetica clinica, oncogenetica e oncologia molecolare su riviste russe e straniere. Partecipante regolare a conferenze sulla genetica medica.

Area di interessi scientifici e pratici: consulenza genetica medica di pazienti con patologia ereditaria sindromica e multifattoriale.

La consultazione con un genetista ti consente di rispondere alle seguenti domande:

I sintomi del bambino sono segni di una malattia ereditaria? quali ricerche sono necessarie per identificare la causa determinare una previsione accurata raccomandazioni per condurre e valutare i risultati della diagnosi prenatale tutto quello che devi sapere sulla pianificazione familiare Consulenza sulla pianificazione della fecondazione in vitro consultazioni sul campo e online

ha preso parte alla scuola scientifico-pratica “Tecnologie genetiche innovative per i medici: applicazione nella pratica clinica”, al convegno della Società Europea di Genetica Umana (ESHG) e ad altri convegni dedicati alla genetica umana.

Conduce consulenza genetica medica per famiglie con patologie presumibilmente ereditarie o congenite, comprese malattie monogeniche e anomalie cromosomiche, determina le indicazioni per studi genetici di laboratorio, interpreta i risultati della diagnostica del DNA. Fornisce consulenza alle donne incinte sulla diagnostica prenatale al fine di prevenire la nascita di bambini con malformazioni congenite.

Genetista, ostetrico-ginecologo, candidato alle scienze mediche

Kudryavtseva
Elena Vladimirovna

Genetista, ostetrico-ginecologo, candidato alle scienze mediche.

Specialista nel campo della consulenza riproduttiva e della patologia ereditaria.

Laureato presso l'Accademia medica statale degli Urali nel 2005.

Specializzazione in Ostetricia e Ginecologia

Stage nella specialità "Genetica"

Riqualificazione professionale nella specialità "Diagnostica ad ultrasuoni"

Attività:

Infertilità e aborto spontaneo

Si è laureata all'Accademia medica statale di Nizhny Novgorod, Facoltà di Medicina (specialità "Medicina"). Ha conseguito il tirocinio clinico presso la FBGNU "MGNTS" con una laurea in "Genetica". Nel 2014 ha completato un tirocinio presso la clinica della maternità e dell'infanzia (IRCCS materno infantile Burlo Garofolo, Trieste, Italia).

Dal 2016 lavora come medico consulente presso Genomed LLC.

Partecipa regolarmente a conferenze scientifiche e pratiche sulla genetica.

Principali attività: Consulenza sulla diagnostica clinica e di laboratorio delle malattie genetiche e interpretazione dei risultati. Gestione dei pazienti e dei loro familiari con sospetta patologia ereditaria. Consulenza durante la pianificazione di una gravidanza, nonché durante la gravidanza sulla diagnostica prenatale al fine di prevenire la nascita di bambini con patologie congenite.

Malattie metaboliche ereditarie: una vasta classe di malattie ereditarie umane, che comprende più di 600 forme diverse. Il numero di nuove forme di malattie metaboliche e persino di classi cresce ogni anno, il numero di pubblicazioni relative alle possibilità di diagnosticare, prevenire e, soprattutto, curare le malattie metaboliche aumenta in modo esponenziale. Le singole forme di malattie metaboliche sono rare o estremamente rare, ma la loro frequenza totale è piuttosto elevata e ammonta a 1:3.000-1:5.000 nati vivi. Una caratteristica di queste malattie sono i cambiamenti biochimici pronunciati che compaiono prima della comparsa dei primi sintomi clinici.

Secondo la classificazione biochimica, le malattie metaboliche sono divise in 22 gruppi a seconda del tipo di via metabolica danneggiata (aminoacidopatia, disturbi del metabolismo dei carboidrati, ecc.) o in base alla sua localizzazione all'interno di un determinato componente cellulare (malattie lisosomiali, perossisomiali e mitocondriali).

La classificazione biochimica delle malattie metaboliche è la seguente.
Malattie da accumulo lisosomiale.
Malattie mitocondriali.
malattie perossisomiali.
Disturbi congeniti della glicosilazione.
Disturbi del metabolismo della creatinina.
Disturbi del metabolismo del colesterolo.
Violazioni della sintesi di citochine e altri immunomodulatori.
Disturbi metabolici degli aminoacidi/acidi organici.
Violazioni della b-ossidazione mitocondriale.
Disturbi metabolici dei corpi chetonici.
Disturbi metabolici dei grassi e degli acidi grassi, lipoproteine.
Disturbi del metabolismo dei carboidrati e del glicogeno.
Disturbi del trasporto del glucosio.
Disturbi del metabolismo della glicerina.
Violazioni del metabolismo delle vitamine.
Disturbi metabolici dei metalli e degli anioni.
Disturbi del metabolismo degli acidi biliari.
Disturbi del metabolismo dei neurotrasmettitori.
Disturbi metabolici degli steroidi e di altri ormoni.
Disturbi metabolici dell'eme e delle porfirine.
Disturbi del metabolismo purine/pirimidine.
Disturbi del metabolismo della bilirubina.

I principali meccanismi della patogenesi delle malattie metaboliche
ACCUMULO DEL SUBSTRATO
L'accumulo del substrato della reazione enzimatica bloccata è uno dei principali meccanismi di patogenesi nella stragrande maggioranza delle malattie metaboliche.

Innanzitutto, questo si riferisce all'interruzione delle reazioni cataboliche, come la scomposizione di grandi macromolecole, amminoacidi, acidi organici, ecc. Se il substrato accumulato viene facilmente rimosso dalle cellule e la sua concentrazione nei fluidi biologici è molte volte superiore a livello omeostatico, l'equilibrio acido-base può cambiare (acidi organici nell'aciduria organica), si accumula in diversi tessuti (acido omogentisico nell'alcaptonuria). In alcuni casi, il substrato compete con composti simili durante il trasporto attraverso la barriera emato-encefalica, portando alla loro deplezione nel cervello (aminoacidopatia). Se il substrato accumulato è scarsamente solubile, si accumula all'interno della cellula, innescando i meccanismi di morte apoptotica. Una delle ulteriori conseguenze dell'accumulo di substrati può essere l'attivazione di vie metaboliche minori, la cui quota nel normale metabolismo è trascurabile.

Tale meccanismo, ad esempio, è alla base dell'accumulo di acido fenilpiruvico nella fenilchetonuria.

I metaboliti accumulati hanno un grande valore diagnostico; in alcuni casi, la loro analisi quantitativa o semiquantitativa consente di determinare con precisione la forma della malattia. Con aciduria organica e aminoacidopatia, l'accumulo di grandi quantità di composti idrosolubili nel plasma sanguigno e nelle urine consente di determinarli rapidamente quantitativamente o qualitativamente utilizzando metodi di analisi cromatografici.

INSUFFICIENZA DEI PRODOTTI DI REAZIONE
L'insufficienza dei prodotti di reazione è il secondo meccanismo principale nella patogenesi delle malattie metaboliche. La causa dei cambiamenti patologici può essere direttamente l'insufficienza del prodotto della reazione bloccata. Ad esempio, con un difetto della biotinidasi, la scissione della biotina dalle proteine alimentari è disturbata e le manifestazioni cliniche della malattia sono associate alla carenza di questa vitamina.

L'insufficienza di prodotti di reazione nel processo del ciclo dell'urea crea una situazione metabolica notevole: alcuni aminoacidi passano da non essenziali a essenziali. Quindi, con l'aciduria arginina-succinica, si verifica una violazione della formazione di arginina dall'acido arginina-succinico, che porta ad una carenza di arginina e ornitina. In alcuni casi può esserci una carenza di un prodotto più distante in questa catena metabolica, ad esempio l'aldosterone e il cortisolo, con sindrome adrenogenitale,

ISOLAMENTO METABOLICO
In un gruppo separato è necessario individuare le malattie associate all'isolamento metabolico del prodotto di reazione. Questo è il principale meccanismo di patogenesi in violazione delle proteine trasportatrici, che non sono enzimi, ma sono coinvolte nella regolazione di una determinata reazione biochimica. La cascata di eventi metabolici innescata da queste malattie ha conseguenze simili per l’organismo e per la cellula. La sindrome iperornitinemia - iperammoniemia - omocitrullinuria (acronimo dei tre principali marcatori biochimici - iperammoniemia, iperornitinemia, omocitrullinemia) è associata ad una violazione del trasporto dell'ornitina. Di conseguenza, all'interno dei mitocondri c'è una carenza di ornitina, che porta all'accumulo di carbamilfosfato e ammonio.

È quasi impossibile individuare un unico meccanismo principale della patogenesi, poiché i processi metabolici sono strettamente correlati. Di norma, si osserva una combinazione di tutti i meccanismi descritti e con ciascuno dei blocchi enzimatici si verificano cambiamenti significativi nell'intera rete metabolica della cellula.

Diagnostica di laboratorio delle malattie metaboliche ereditarie
La diagnosi differenziale delle malattie metaboliche ereditarie dipende interamente dall'uso di una gamma insolitamente ampia di metodi biochimici, fisico-chimici e genetici molecolari. Nella maggior parte dei casi, solo un'interpretazione combinata di tutti i risultati ottenuti consente di determinare con precisione la forma della malattia. Di norma, la strategia generale per diagnosticare le malattie metaboliche ereditarie comprende diverse fasi.

I - identificazione di un collegamento difettoso nella via metabolica attraverso l'analisi (quantitativa, semiquantitativa o qualitativa) dei metaboliti.
II - rilevamento della disfunzione proteica determinandone la quantità e/o l'attività.
III - chiarimento della natura della mutazione, ovvero caratterizzazione dell'allele mutante a livello genetico.

Tale strategia viene utilizzata non solo per risolvere problemi legati allo studio dei meccanismi molecolari della patogenesi delle malattie metaboliche ereditarie, all'identificazione delle correlazioni genofenotipiche, è necessaria principalmente per la diagnosi pratica delle malattie metaboliche ereditarie.

La verifica della diagnosi a livello della proteina e del gene mutante è necessaria sia per la diagnosi prenatale, la consulenza genetica medica delle famiglie gravate, sia in alcuni casi per la nomina di una terapia adeguata. Ad esempio, nel deficit di deidropteridina reduttasi, il fenotipo clinico e i livelli di fenilalanina saranno indistinguibili dalla forma classica di fenilchetonuria, ma gli approcci al trattamento di queste malattie sono fondamentalmente diversi. L'importanza della differenziazione del locus delle malattie metaboliche ereditarie per la consulenza genetica medica può essere illustrata dall'esempio della mucopolisaccaridosi di tipo II (malattia di Hunter). Secondo lo spettro dei glicosaminoglicani escreti, è impossibile distinguere le mucopolisaccaridosi di tipo I, II e VII, ma di queste malattie solo la malattia di Hunter è ereditata secondo il tipo recessivo legato all'X, che è di fondamentale importanza per la prognosi della prole in una famiglia con una storia gravata. Per quanto riguarda la diagnosi prenatale, avendo dati sulla forma della mucopolisaccaridosi (questa può essere stabilita solo esaminando l'attività degli enzimi), è possibile effettuare la diagnosi prenatale già alla 8-11a settimana di gravidanza, se la forma non è specificata , quindi solo alla 20a settimana. La priorità dei metodi di genetica molecolare è incondizionata nello stabilire il portatore eterozigote, così come nella diagnosi prenatale di malattie in cui l'enzima mutante non è espresso nelle cellule dei villi coriali, ad esempio nella fenilchetonuria, in alcune glicogenosi e nei difetti della β-ossidazione mitocondriale. .

IDENTIFICAZIONE DI UN COLLEGAMENTO DIFETTOSO DELLA VIA METABOLICA
L'analisi dei metaboliti è il passo più importante nella diagnosi di molte malattie della classe delle malattie metaboliche ereditarie. Prima di tutto, questo si riferisce alle violazioni del metabolismo interstiziale degli aminoacidi e degli acidi organici. Nella maggior parte di queste malattie, la determinazione quantitativa dei metaboliti nei fluidi biologici consente una diagnosi accurata. A tal fine vengono utilizzati metodi di analisi chimica qualitativa, metodi spettrofotometrici per la valutazione quantitativa dei composti, nonché vari tipi di cromatografia (spettrometria di massa a strato sottile, liquida ad alte prestazioni, gas, tandem). Il materiale biologico per questi studi è solitamente costituito da campioni di plasma sanguigno o siero e urina.

Nelle malattie metaboliche ereditarie come i disturbi del metabolismo energetico, il metabolismo dei carboidrati e degli aminoacidi, l'analisi dei composti comuni a molte vie metaboliche (metaboliti chiave) consente la diagnosi differenziale delle malattie e la pianificazione di ulteriori tattiche di esame. Per molti gruppi di malattie metaboliche ereditarie, viene utilizzata l'analisi semiquantitativa per determinare la concentrazione dei metaboliti. A volte l'analisi qualitativa è la prima fase di una ricerca diagnostica e consente di sospettare con elevata affidabilità una certa forma nosologica di una malattia o un gruppo di malattie.

ESAMI DELLE URINE QUALITATIVI E SEMIQUANTITATIVI
Poiché in molte malattie metaboliche ereditarie si accumulano substrati della reazione enzimatica bloccata o dei loro derivati, concentrazioni eccessive di questi metaboliti possono essere rilevate mediante test chimici qualitativi. Questi test sono sensibili, facili da usare, economici e non danno risultati falsi negativi, e le informazioni ottenute dal loro utilizzo permettono di sospettare con un alto grado di probabilità malattie metaboliche ereditarie in un paziente. Bisogna tenere presente che i risultati di questi test sono influenzati da farmaci, integratori alimentari e dai loro metaboliti. I test di analisi qualitativa vengono utilizzati nei programmi di screening selettivo.

Test qualitativi
Colore e olfatto: leucinosi, tirosinemia, acidemia isovalerica, fenilchetonuria, alcaptonuria, cistinuria, aciduria 3-idrossi-3-metilglutarica.
Test di Benedict (galattosemia, intolleranza congenita al fruttosio, alcaptonuria). Positivo anche a sindrome di Fanconi, diabete mellito, deficit di lattasi, antibiotici.
Test del cloruro ferrico (fenilchetonuria, leucinosi, iperglicinemia, alcaptonuria, tirosinemia, istidinemia). Positivo anche per cirrosi epatica, pleocromocitoma, iperbilirubinemia, acidosi lattica, chetoacidosi, melanoma.
Test della dinitrofenilidrazina (fenilchetonuria, leucinosi, iperglicinemia, alcaptonuria). Positivo anche per glicogenosi, acidosi lattica.
Test della p-nitroanilina: aciduria metilmalonica.
Test al solfito: mancanza del cofattore molibdeno.
Test dell'acido omogentisico: alcaptonuria.
Test con nitrosonaftolo: tirosinemia. Positivo anche alla fruttosemia e alla galattosemia.

METABOLITI CHIAVE
Per molti gruppi di malattie metaboliche ereditarie, un passo importante nella diagnosi differenziale di laboratorio è la misurazione della concentrazione di alcuni metaboliti in vari fluidi biologici (sangue, plasma, liquido cerebrospinale e urina). Questi composti includono glucosio, acido lattico (lattato), acido piruvico (piruvato), ammonio, corpi chetonici (b-idrossibutirrato e acetoacetato), acido urico. La concentrazione di questi composti cambia in molte malattie metaboliche ereditarie e la loro valutazione completa rende possibile lo sviluppo di algoritmi per ulteriori diagnostiche di laboratorio.

lattato e piruvato
Le concentrazioni di lattato, piruvato e corpi chetonici sono gli indicatori più importanti dei disturbi del metabolismo energetico. Sono note circa 25 forme nosologiche di malattie metaboliche ereditarie, in cui si verifica un aumento del livello di lattato nel sangue (acidosi del lattato).

L'acidosi lattica è una condizione in cui il livello di acido lattico supera i 2,1 mm. L'acidosi lattica primaria può essere associata a deficit di piruvato deidrogenasi (complesso piruvato deidrogenasi), disturbi della catena respiratoria mitocondriale (la stragrande maggioranza delle forme), gluconeogenesi e metabolismo del glicogeno. In alcuni casi si osserva acidosi lattica secondaria, aciduria organica, disturbi della β-ossidazione mitocondriale, difetti del ciclo dell'urea. La concentrazione di questi metaboliti dipende in gran parte dallo stato fisiologico (prima o dopo il carico di cibo) e il livello di lattato è influenzato anche dall'attività fisica e persino dallo stress associato alla procedura di prelievo del sangue, soprattutto nei bambini piccoli. Tutto ciò deve essere preso in considerazione quando si interpretano i dati biochimici. Il rapporto lattato/piruvato nel sangue è un importante criterio diagnostico differenziale. Biochimicamente, questo rapporto riflette il rapporto tra la forma ridotta e quella ossidata dei dinucleotidi della nicotinammide nel citoplasma - il cosiddetto stato ossidativo del citoplasma.

Corpi chetonici
I corpi chetonici si formano nel fegato, la loro fonte principale è la b-ossidazione degli acidi grassi. Vengono poi trasferiti a vari tessuti del corpo. Il rapporto dei corpi chetonici 3-idrossibutirrato/acetoacetato riflette lo stato redox dei mitocondri, poiché il loro rapporto è associato esclusivamente al pool mitocondriale dei dinucleotidi della nicotinammide. Il β-idrossibutirrato è relativamente stabile nel plasma, a differenza dell'acetoacetato, che viene rapidamente degradato. Molti difetti nella β-ossidazione mitocondriale sono caratterizzati da bassi livelli di corpi chetonici anche dopo un digiuno prolungato, che è associato all’esaurimento della produzione di acetil-CoA, che è il principale precursore dei corpi chetonici. Nelle malattie mitocondriali associate a difetti nella catena respiratoria mitocondriale, si osserva un'iperchetonemia paradossa: il livello dei corpi chetonici dopo un carico di cibo aumenta in modo significativo (normalmente, si osserva un aumento della concentrazione di corpi chetonici dopo una fame prolungata).

Ammonio
Nelle malattie metaboliche ereditarie, procedendo in base al tipo di scompenso metabolico acuto, è importante determinare il livello di ammonio nel sangue. Un aumento significativo dell'ammonio nel sangue si osserva nelle malattie metaboliche ereditarie causate da violazioni del ciclo dell'urea e del metabolismo degli acidi organici. In queste malattie la concentrazione di ammonio sale da 200 a 1000 micron. L'iperammoniemia non è solo un importante segno diagnostico differenziale, ma richiede anche misure terapeutiche urgenti, poiché porta rapidamente a gravi danni cerebrali. È importante differenziare questa condizione dall'iperammonemia neonatale transitoria, che si verifica nei neonati pretermine con indici di crescita e di massa elevati e sintomi clinici di danno polmonare. Il livello di ammonio in questo stato non supera i 200 micron. La concentrazione di ammonio nel sangue può aumentare in caso di gravi danni al fegato. Valori normali di concentrazione di ammonio nel sangue: nel periodo neonatale - meno di 110 micron, nei bambini più grandi - meno di 100 micron.

Glucosio
Una diminuzione dei livelli di glucosio nel sangue può essere osservata in numerose malattie metaboliche ereditarie. Innanzitutto si tratta di disturbi del metabolismo del glicogeno e di difetti nella β-ossidazione mitocondriale, in cui l'ipoglicemia può essere l'unico cambiamento biochimico rilevato nei test di laboratorio standard. La risposta fisiologica alla diminuzione dei livelli di glucosio nel sangue è l'abolizione del rilascio di insulina, della produzione di glucagone e di altri ormoni regolatori. Ciò porta alla formazione di glucosio dal glicogeno nel fegato e alla conversione delle proteine in glucosio nella catena della gluconeogenesi. Viene attivata anche la lipolisi che porta alla formazione di glicerolo e acidi grassi liberi. Gli acidi grassi vengono trasportati ai mitocondri del fegato, dove vengono p-ossidati e si formano corpi chetonici, e il glicerolo viene convertito in glucosio nella catena della gluconeogenesi. I bambini hanno un bisogno di glucosio molto maggiore rispetto agli adulti. Si ritiene che ciò sia dovuto al fatto che il rapporto cervello-corpo è più elevato nei bambini e il cervello è il principale consumatore di glucosio.

Inoltre, il cervello adulto è più adatto all’utilizzo dei corpi chetonici come fonte di energia rispetto al cervello di un bambino. È per questi motivi che i bambini sono più sensibili alle condizioni ipoglicemiche rispetto agli adulti. Nei disturbi del metabolismo del glicogeno, l'ipoglicemia è associata all'incapacità di formare glucosio dal glicogeno, quindi è più pronunciata durante i periodi di digiuno prolungato.

La maggior parte delle malattie del gruppo dei difetti della β-ossidazione mitocondriale sono accompagnate anche da una diminuzione dei livelli di glucosio. Questo gruppo di malattie è una delle malattie metaboliche ereditarie più comuni. La causa dell'ipoglicemia è associata all'incapacità di utilizzare i grassi immagazzinati durante il periodo di digiuno e all'esaurimento del glicogeno immagazzinato, che diventa l'unica fonte di glucosio e, di conseguenza, di energia metabolica. L'ipoglicemia con difetti nella β-ossidazione mitocondriale, a differenza della glicogenosi, non è accompagnata da iperchetonemia. L'ipoglicemia può verificarsi anche nella galattosemia di tipo I, nell'intolleranza ereditaria al fruttosio, nel deficit di fruttosio-1,6-bisfosfatasi.

acidosi metabolica
L'acidosi metabolica è una delle complicanze frequenti di malattie infettive, grave ipossia, disidratazione e intossicazione. Anche le malattie metaboliche ereditarie che si manifestano nella prima infanzia sono spesso accompagnate da acidosi metabolica da deficit di basi.

Il criterio più importante nella diagnosi differenziale dell'acidosi metabolica è il livello dei corpi chetonici nel sangue e nelle urine, nonché la concentrazione di glucosio. Se l'acidosi metabolica è accompagnata da chetonuria, ciò indica una violazione del metabolismo del piruvato, degli aminoacidi ramificati, disturbi del metabolismo del glicogeno. Difetti nella β-ossidazione mitocondriale, nella chetogenesi e alcuni disturbi della gluconeogenesi non sono accompagnati da un aumento del livello dei corpi chetonici nel sangue e nelle urine. Le malattie metaboliche ereditarie più comuni che si verificano con acidosi metabolica grave sono l’acidemia propionica, metilmalonica e isovalerica. I disturbi del metabolismo del piruvato e della catena respiratoria mitocondriale, che si manifestano in tenera età, di solito portano ad una grave acidosi metabolica.

Acido urico
L'acido urico è il prodotto finale del metabolismo delle purine. Le basi puriniche - adenina, guanina, ipoxantina e xantina - vengono ossidate ad acido urico. L'acido urico è sintetizzato principalmente nel fegato, nel sangue non è legato alle proteine, quindi quasi tutto subisce filtrazione nei reni. Un aumento della concentrazione di acido urico nelle urine è strettamente correlato ad un aumento del suo livello nel plasma sanguigno.

L'aumento della produzione e dell'escrezione di acido urico (iperuricemia e iperuricosuria) deriva dall'iperattività (un fenomeno unico tra le malattie metaboliche ereditarie) o dalla carenza di enzimi coinvolti nella sintesi de novo delle purine, risparmiando le vie del loro metabolismo, o da una ridotta formazione di inosina monofosfato da adenosina monofosfato nel ciclo nucleotidico purinico. L'iperuricemia secondaria si osserva anche nell'intolleranza ereditaria al fruttosio, nel deficit di fruttosio-1,6-defosfatasi, nella glicogenosi di tipo I, III, V, VII e nell'insufficienza dell'acetil-CoA deidrogenasi degli acidi grassi a catena media.

ANALISI DEI METABOLITI MEDIANTE METODI QUANTITATIVI SPECIALI
I metodi di analisi cromatografici svolgono un ruolo importante nella diagnosi delle malattie metaboliche ereditarie. Il moderno arsenale di tecnologie cromatografiche è estremamente ampio, il che consente di separare in modo efficace e informativo miscele complesse e multicomponenti, che includono materiale biologico. Per l'analisi quantitativa dei metaboliti nelle malattie metaboliche ereditarie, vengono utilizzati con successo metodi cromatografici come la cromatografia a gas e liquida ad alte prestazioni, la cromatografia-spettrometria di massa. La gascromatografia e la gascromatografia ad alte prestazioni sono i metodi più versatili per separare miscele complesse di composti, caratterizzati da elevata sensibilità e riproducibilità. In entrambi i casi la separazione viene effettuata a seguito della diversa interazione dei componenti della miscela con le fasi stazionaria e mobile della colonna cromatografica. Per la gascromatografia, la fase mobile è un gas vettore, per la gascromatografia ad alte prestazioni è un liquido (eluente). L'uscita di ciascun composto viene registrata dal rilevatore del dispositivo, il cui segnale viene convertito in picchi sul cromatogramma. Ogni picco è caratterizzato da tempo di ritenzione e area. Va notato che, di norma, la gascromatografia viene eseguita ad alta temperatura, pertanto l'instabilità termica dei composti rappresenta un limite al suo utilizzo. Per la gascromatografia ad alte prestazioni non esistono tali restrizioni, poiché in questo caso l'analisi viene eseguita in condizioni blande. La spettrometria di cromatomassa è un sistema combinato di gascromatografia o gascromatografia ad alte prestazioni con un rilevatore selettivo di massa, che consente di ottenere non solo informazioni quantitative ma anche qualitative, ovvero viene determinata ulteriormente la struttura dei composti nella miscela analizzata.

acidi organici
Nella genetica biochimica, il termine "acidi organici" si riferisce a piccoli acidi carbossilici idrosolubili (peso molecolare - inferiore a 300 kDa), che sono prodotti intermedi o finali del metabolismo di aminoacidi, carboidrati, lipidi e ammine biogene.

Per determinare gli acidi organici vengono utilizzati diversi metodi cromatografici: cromatografia liquida ad alta prestazione, cromatografia-spettrometria di massa e gascromatografia ad alta prestazione seguita da spettrometria di massa tandem. In un campione di urina si possono trovare oltre 250 diversi acidi organici e coniugati di glicina. La loro concentrazione dipende dalla dieta, dai farmaci e da altri motivi fisiologici. Sono note circa 65 malattie metaboliche ereditarie, caratterizzate da un profilo specifico di acidi organici. Una quantità relativamente piccola di acidi organici è altamente specifica, la loro presenza in alte concentrazioni nelle urine consente di stabilire con precisione la diagnosi: succinilacetone nella tirosinemia di tipo I, N-acetilaspartato nella malattia di Canavan, acido mevalonico nell'aciduria mevalonica. Nella stragrande maggioranza dei casi, la diagnosi di malattie metaboliche ereditarie basata solo sull'analisi degli acidi organici nelle urine è piuttosto difficile da stabilire, pertanto è necessaria un'ulteriore diagnostica di conferma.

L'interpretazione dei risultati dell'analisi degli acidi organici nelle urine presenta alcuni problemi, sia a causa del gran numero di acidi escreti e dei loro derivati, sia a causa dei profili sovrapposti di alcuni metaboliti dei farmaci. Per una diagnosi accurata, i dati ottenuti dall'analisi degli acidi organici devono essere correlati alle caratteristiche cliniche della malattia ed essere confermati dai risultati di altri metodi di analisi di laboratorio (analisi di aminoacidi, lattato, piruvato, acilcarnitine nel sangue, attività enzimatica e dati genetici molecolari).

La concentrazione di acidi organici nelle malattie metaboliche ereditarie è caratterizzata da un intervallo abbastanza ampio: da un aumento del loro livello di diverse centinaia di volte a un leggero eccesso, vicino alla norma. Ad esempio, nell'aciduria glutarica di tipo I, i livelli di acido glutarico possono essere normali in alcuni pazienti; in caso di insufficienza dell'acetil-CoA deidrogenasi a catena media degli acidi grassi, la concentrazione degli acidi adipico, sebacico e suberico può rientrare nell'intervallo normale. Il rilevamento di un profilo anomalo degli acidi organici nelle urine è talvolta possibile solo nei pazienti in fase di scompenso metabolico. Ciò è particolarmente vero per le forme benigne e lievi di malattie che, di regola, si manifestano tardivamente.

Aminoacidi e acilcarnitine
La determinazione della concentrazione di aminoacidi e acilcarnitine viene effettuata mediante spettrometria di massa tandem. La spettrometria di massa è un metodo analitico che può essere utilizzato per ottenere informazioni sia qualitative (struttura) che quantitative (peso molecolare o concentrazione) delle molecole analizzate dopo che sono state convertite in ioni. La differenza essenziale tra la spettrometria di massa e altri metodi fisico-chimici analitici è che lo spettrometro di massa determina direttamente la massa delle molecole e dei loro frammenti. I risultati vengono presentati graficamente (il cosiddetto spettro di massa). A volte non è possibile analizzare miscele complesse di molecole multicomponenti senza prima separarle. Le molecole possono essere separate mediante cromatografia o utilizzando due spettrometri di massa collegati in serie - spettrometria di massa tandem. Il metodo della spettrometria di massa tandem è stato utilizzato per la prima volta negli anni '70. del secolo scorso e ha trovato applicazione in chimica, biologia e medicina. Questo metodo viene utilizzato per chiarire la struttura di sostanze sconosciute, nonché per analizzare miscele complesse con una purificazione minima del campione.

Prima dell'analisi spettrometrica di massa, è necessario convertire le particelle neutre di una sostanza in ioni carichi e trasferirle dallo stato liquido allo stato gassoso. A questo scopo è stato inizialmente utilizzato il metodo della ionizzazione mediante bombardamento di atomi veloci; più recentemente si è preferito il metodo della ionizzazione in elettrospray. Con l'avvento di nuovi metodi di ionizzazione, l'uso della spettrometria di massa tandem nel campo della biochimica analitica è diventato più accessibile. La prima analisi delle acilcarnitine mediante spettrometria di massa tandem è stata eseguita da David Millington et al., che hanno utilizzato la derivatizzazione chimica di campioni biologici per formare esteri butilici delle acilcarnitine. Nel 1993, Donald Chase et al. hanno adattato questo metodo per l'analisi degli aminoacidi nelle macchie di sangue essiccato, costituendo così la base per lo screening di molteplici componenti nelle malattie metaboliche ereditarie. Da allora il metodo è stato adattato ai test su larga scala necessari per lo screening neonatale.

L'analisi della spettrometria di massa tandem è più efficace per i composti che hanno ioni figli simili o molecole neutre, come l'analisi di amminoacidi e acilcarnitine. È inoltre necessario sottolineare la possibilità di analisi MS/MS di vari gruppi chimici in un'unica analisi in un tempo molto breve (~2 min). Ciò fornisce un'ampia gamma di test e un'elevata produttività, il che è economicamente vantaggioso per lo screening di un gran numero di malattie. Sulla base dell'aumento della concentrazione di alcune acilcarnitine si possono sospettare malattie del gruppo dei disturbi della p-ossidazione mitocondriale dovute al cambiamento del profilo degli aminoacidi - aminoacidopatia. Utilizzando la spettrometria di massa tandem, è possibile rilevare metaboliti estranei degli acidi biliari che compaiono nei disturbi del metabolismo del colesterolo e dei lipidi, degli acidi biliari e nei difetti della biogenesi dei perossisomi. In diverse patologie epatobiliari colestatiche (malattia epatica cronica ad eziologia sconosciuta, sindrome di Zellweger, deficit di proteine bifunzionali perossisomiali, tirosinemia di tipo I, atresia biliare, colestasi intraepatica familiare progressiva di tipo indeterminato), utilizzando la spettrometria di massa tandem, è possibile determinare la concentrazione di acidi biliari coniugati in vari fluidi biologici.

Vengono descritti i metodi per la determinazione degli acidi grassi a catena molto lunga: eicosanoico (C20:0), docosanoico (C22:0), tetracosanoico (C24:0), esacosanoico (C26:0), nonché acidi fitanici e pristanici - utilizzando la spettrometria di massa tandem nelle macchie di plasma e sangue, potenzialmente adatta per lo screening di molte malattie perossisomiali.

La diagnosi dei disturbi del metabolismo delle purine e delle pirimidine (deficit di nucleoside fosforilasi purinico, ornitina transcarbamilasi, cofattore molibdeno, adenilosuccinasi, deidropirimidina deidrogenasi) si basa sulla presenza di metaboliti anomali o sull'assenza di metaboliti normali nel siero, nelle urine o nelle cellule del sangue. Pertanto, sono stati sviluppati metodi rapidi di spettrometria di massa tandem che consentono la determinazione quantitativa di 17-24 purine e pirimidine nelle urine in un'unica analisi.

La spettrometria di massa tandem può essere utilizzata anche per studiare altre classi di metaboliti. Pertanto, è stato sviluppato un nuovo metodo di spettrometria di massa tandem per la misurazione dell'esoso monofosfato totale nelle macchie di sangue, un marcatore del galattosio-1-fosfato, che può essere utilizzato nello screening della galattosemia.

La determinazione delle catecolamine nelle urine è importante per diagnosticare disturbi del metabolismo delle catecolamine e dei neurotrasmettitori. Svantaggi significativi dei metodi esistenti sono i lunghi tempi di analisi e la possibile interferenza di farmaci e dei loro metaboliti strutturalmente simili alle catecolamine. Nuovi metodi in combinazione con la preparazione del campione specifica per composti contenenti gruppi catecoli consentono una diagnosi rapida di questo gruppo di malattie, eliminando le carenze dei metodi HPLC.

Ricerca sulle proteine
La stragrande maggioranza delle malattie metaboliche ereditarie è causata da una violazione dell'attività degli enzimi, pertanto, nella diagnosi di queste malattie, l'individuazione di una diminuzione dell'attività di enzimi specifici è il metodo più importante e talvolta l'unico affidabile per confermando la diagnosi.

DETERMINAZIONE DELL'ATTIVITÀ ENZIMATICA
Attualmente la diagnosi post- e prenatale di molte malattie metaboliche ereditarie (soprattutto malattie da accumulo lisosomiale) viene effettuata utilizzando metodi di analisi dell'attività enzimatica. Il materiale per misurare l'attività degli enzimi nelle malattie metaboliche ereditarie sono principalmente i leucociti del sangue periferico: in quasi tutte le malattie da accumulo lisosomiale, l'aciduria metilmalonica e alcune glicogenosi. Il plasma sanguigno o il siero vengono utilizzati per diagnosticare le gangliosidosi GM2 e il deficit di biotinidasi. In alcuni casi, gli oggetti di studio sono il tessuto muscolare o epatico, la coltura dei fibroblasti cutanei.

I substrati per gli enzimi possono essere cromogenici, fluorogenici, contenere un'etichetta radioattiva. Per misurare l'attività degli enzimi, vengono utilizzati metodi spettrofotometrici, fluorimetrici e per misurare la radioattività. Il principio generale dell'uso di substrati fluorogenici è che il substrato è un derivato chimico del fluorocromo che non è in grado di fluorescenza nello stato iniziale, ma sotto l'azione delle molecole degli enzimi corrispondenti, il substrato viene scisso cataliticamente per rilasciare fluorocromo, il la cui fluorescenza può essere misurata. I metodi spettrofotometrici consentono di misurare l'assorbimento dei prodotti della reazione enzimatica ottenuti dopo l'introduzione di substrati cromogenici. Per molti enzimi (ad esempio le deidrogenasi), i prodotti di reazione risultanti possono essere cromogenici. Esistono numerosi substrati fluorogenici per lo studio di vari enzimi: esterasi di diversa specificità, perossidasi, peptidasi, fosfatasi, solfatasi, lipasi, ecc. Substrati radiomarcati vengono utilizzati nella diagnosi di aciduria organica, difetti nell'ossidazione P mitocondriale , disturbi del metabolismo dei carboidrati e malattie da accumulo lisosomiale.

Ogni reazione enzimatica richiede determinate condizioni: pH e composizione della miscela tampone, substrato(i) specifico(i), presenza di attivatori e cofattori, condizioni di temperatura, ecc. Quasi ogni cellula contiene il proprio set di enzimi, quindi la loro distribuzione nei tessuti varia in modo significativo . Molti enzimi sono presenti nei tessuti in varie forme (isoenzimi). Nella maggior parte dei casi ciò è dovuto alla presenza di subunità polipeptidiche che, se combinate, formano diversi isoenzimi. La distribuzione degli isoenzimi può variare da tessuto a tessuto. Alcuni enzimi si trovano solo in un particolare organo o tessuto.

Malattie da accumulo lisosomiale
La determinazione dell'attività enzimatica è il "gold standard" per la diagnosi di conferma delle malattie da accumulo lisosomiale. Substrati cromogenici e fluorogenici vengono utilizzati per analizzare l'attività enzimatica. I substrati fluorogenici a base di 4-metilumberifelone sono sempre molto sensibili; con il loro aiuto è possibile determinare l'attività degli enzimi anche in microquantità di materiale biologico (macchie di sangue essiccato). Di norma, l'attività degli enzimi nei pazienti con malattie da accumulo lisosomiale è inferiore al 10% della norma e i test biochimici facilitano la diagnosi accurata. Ci sono una serie di fattori che rendono difficile l’interpretazione degli studi biochimici. Uno di questi è la presenza di alleli “pseudo-carenza”, che portano a cambiamenti nella struttura dell’enzima e non consentono alla proteina di scindere adeguatamente il substrato artificiale in vitro, mentre questo enzima non mostra una diminuzione di attività con un substrato naturale. Questo fenomeno è stato descritto per l'arilsolfatasi A, la p-galattosidasi, la p-glucuronidasi, l'a-iduronidasi, l'a-galattosidasi, la galattocerebrosidasi.

Ricerca sui geni mutanti
Lo sviluppo di metodi di biologia molecolare ha rappresentato una vera rivoluzione nel campo della biochimica clinica. Lo sviluppo di protocolli standard per gli studi molecolari e l'automazione dei metodi oggi utilizzati costituisce un insieme completo di approcci diagnostici che possono diventare una procedura di routine nei laboratori clinici. Il rapido sviluppo della ricerca nel campo della decifrazione del genoma umano e della determinazione della sequenza del DNA dei geni rende possibile la diagnosi del DNA di varie malattie ereditarie. Nell'ultimo decennio sono stati utilizzati metodi di diagnostica del DNA, analisi della struttura dei geni normali e dei loro analoghi mutanti nelle malattie metaboliche ereditarie.

Per la diagnostica del DNA delle malattie ereditarie vengono utilizzati due approcci principali: la diagnostica del DNA diretta e indiretta. La diagnostica diretta del DNA è uno studio della struttura primaria di un gene danneggiato e l'isolamento delle mutazioni che portano a una malattia. Per rilevare il danno molecolare nei geni che causano malattie ereditarie, utilizzare l'arsenale standard di metodi di biologia molecolare. A seconda delle caratteristiche e dei tipi di mutazioni, della prevalenza in varie malattie ereditarie, alcuni metodi sono più preferibili.

Per la diagnosi di malattie metaboliche ereditarie nei casi in cui il difetto biochimico è noto con precisione, determinato in modo semplice e affidabile utilizzando metodi biochimici, è improbabile che i metodi del DNA occupino un posto prioritario. In questi casi, l’uso dell’analisi del DNA è più un approccio di ricerca che diagnostico. Dopo una diagnosi accurata, i metodi di analisi del DNA saranno utili per la successiva diagnosi prenatale, l'identificazione dei portatori eterozigoti nella famiglia e la prognosi della malattia negli omozigoti, nonché per la selezione dei pazienti per la futura terapia casuale (sostituzione enzimatica e terapia genetica). Inoltre, nei casi in cui il difetto biochimico non è esattamente noto, la diagnosi biochimica è difficile, non sufficientemente affidabile o richiede metodi di ricerca invasivi, il metodo diagnostico del DNA è l'unico e indispensabile per una diagnosi accurata.

In generale, la tattica per diagnosticare le malattie metaboliche ereditarie in ciascun caso specifico dovrebbe essere pianificata insieme a un biochimico e un genetista. Le condizioni necessarie per una diagnosi rapida e efficace sono la comprensione dell'eziologia, dei meccanismi della patogenesi della malattia, la conoscenza di specifici marcatori biochimici.

Controllo qualità di laboratorio
Uno dei componenti più importanti di qualsiasi diagnostica di laboratorio è il costante controllo di qualità della ricerca. In un settore così complesso e sfaccettato come quello delle malattie metaboliche ereditarie, il controllo di qualità esterno ed interno è di particolare importanza. Ciò è dovuto al fatto che il laboratorio si occupa di malattie rare e, di norma, non è possibile acquisire un'esperienza sufficiente nella diagnosi di ciascuna malattia. Inoltre, le attrezzature di laboratorio e gli approcci metodologici possono differire da un laboratorio all'altro.

Classificazione 22 sottoclassi a seconda della via metabolica interessata Sottoclassi: Frequenza Aminoacidopatia 31% Aciduria organica 27% Difetti del ciclo dell'urea 21% Difetti della catena respiratoria mitocondriale 12% Glicogenosi 8% Difetti della β-ossidazione mitocondriale 8% Malattie perossisomali 4%

Ereditarietà autosomica recessiva Fenilchetonuria 1:8.000 Malattia di Tay-Sachs 1: (tra gli ebrei ashkenaziti) 1:3.000 Malattia di Gaucher 1: Malattia di Krabbe 1: Adrenoleucodistrofia recessiva legata all'X 1: Mucopolisaccaridosi di tipo II1: Ereditarietà autosomica recessiva Fenilchetonuria 1:8.000 Malattia di Tay-Sachs 1: (tra gli ebrei ashkenaziti) 1:3.000 Malattia di Gaucher 1: Malattia di Krabbe 1: Tipo di ereditarietà recessiva legata all'X Adrenoleucodistrofia legata all'X 1: Mucopolisaccaridosi di tipo II1: Incidenza della malattia Frequenza

Perché identificare le NBO? La NBO comprende un numero limitato di malattie monogeniche estremamente rare. La stragrande maggioranza delle NBO incurabili rappresenta un’ampia classe di malattie rare monogeniche con un’elevata incidenza cumulativa (almeno 1 su 5.000 nati vivi). Molti degli NBO sono curabili. Per alcuni è possibile una correzione clinica completa. Con una diagnosi accuratamente stabilita, è possibile condurre la diagnostica prenatale (prenatale) in famiglia.

Metodi cromatografici utilizzati nella diagnosi degli aminoacidi NBO AC, aminoacidopatia EZHH Acidi organici di HC-MS Aciduria organica, aminoacidopatia di purine/pirimidine Disturbi VEZH/Pirimidine OdnsHK, Fitanic, Plazmologi dell'Accademia statale delle scienze Terina Sindrome GH-MS SLO Catecolamine , aminoacidi HPLC Malattie del metabolismo dei neurotrasmettitori HPLC mono- e disaccaridi Disturbi del metabolismo dei carboidrati Ormoni HPLC Endocrinopatie ereditarie Carnitina e suoi esteri GC-MS Disturbi della β-ossidazione mitocondriale

La spettrometria di massa tandem è una tecnologia moderna per la diagnosi di NBO Consente di analizzare un gran numero di metaboliti e quindi di identificare un gran numero di disturbi metabolici ereditari Il tempo di analisi per un campione è di diversi minuti Richiede una piccola quantità di materiale biologico (un punto di sangue secco)

Controllo m/z, amu 50% Intensità 100 STANDARD INTERNI Gly Ala Val Leu Met Cit Phe Tyr Glu Gly Ala Ser Pro Val Leu + Ile Gln Tyr Phe Glu Asp Aminoacidi

Malattia dello sciroppo d'acero nelle urine m/z, amu 50% Intensità 100

Tirosinemia m/z, amu 50% Intensità 100 STANDARD INTERNI Gly Ala Val Leu Met Cit Phe Tyr Glu Gly Ala Ser Pro Val Leu + Ile Gln Tyr Phe Glu Asp

M/z, amu % Intensità C3C3 STANDARD INTERNI C4C4 C5C5 C8 C16 Aciduria glutarica tipo 1 C6C6 C18 C10 C12 C14 C5DC

Spettrometria di massa tandem Spettrometria di massa tandem difetti di β-ossidazione deficit di SCAD deficit di MCAD (1:8000) deficit di VLCAD deficit di LCAHD deficit di CPT1 deficit di CPT2 Altri difetti di β-ossidazione Aciduria organica Aciduria glutarica tipo 1 (1:30.000) Acidemia propionica (1:50.000) Aciduria metilmalonica (1:48.000) Aciduria isovalerica (1:50.000) Aminoacidopatia Leucinosi (1:) PKU (1:8.000) Tirosinemia tipo 1 (1:) Iperglicinemia non chetotica (1:55.000) Citrulinemia (1 :)

Diagnosi del DNA Diagnosi di portatori di malattie (estremamente importante per le forme di malattie legate all'X e malattie comuni in alcuni gruppi etnici) Diagnosi di malattie con un difetto biochimico primario sconosciuto Diagnosi di malattie in cui i metodi biochimici sono complessi e richiedono procedure invasive (ad esempio, biopsia epatica) Diagnosi prenatale Diagnostica preimpianto

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I materiali della tesi vengono utilizzati nel processo educativo presso il Dipartimento di genetica medica con un corso di diagnostica prenatale dell'Istituto statale di istruzione di bilancio per l'istruzione professionale aggiuntiva "Accademia medica russa di istruzione post-laurea" del Ministero della sanità della Federazione Russa, come così come nella preparazione degli specializzandi clinici presso l'Istituto di bilancio dello Stato federale "Centro di ricerca genetica medica" dell'Accademia russa delle scienze mediche.

Partecipazione personale alla tesi.

Tutti i dati utilizzati nel lavoro sono stati ottenuti con la partecipazione diretta dell'autore. L'autore ha formulato lo scopo e gli obiettivi dello studio, sviluppato approcci metodologici alla diagnosi di varie classi di NBO. La raccolta dei dati primari e la conduzione degli studi di laboratorio sono stati effettuati personalmente dall'autore o con la sua partecipazione diretta, l'elaborazione, l'analisi e la generalizzazione dei risultati ottenuti durante la scrittura e la preparazione del manoscritto sono stati effettuati personalmente dall'autore.

Pubblicazioni.

Sul tema della tesi sono stati pubblicati 64 articoli scientifici, inclusi 43 articoli su riviste raccomandate dalla Commissione di attestazione superiore del Ministero dell'Istruzione e della Scienza della Federazione Russa, linee guida per medici, un brevetto "Biochip per il rilevamento di mutazioni in il gene della galattosio-1-fosfato-uridil transferasi che causa danni epatici nei neonati" n. 2423521 del 27/10/2009, 1 guida per i medici, 2 capitoli in "Pediatria: linee guida nazionali", 1 capitolo in "Neurologia: linee guida nazionali ", 3 capitoli in "Malattie ereditarie: linee guida nazionali", 1 capitolo in "Diagnostica clinica di laboratorio: leadership nazionale".

Struttura e ambito di lavoro.

Il lavoro di tesi è presentato su 254 pagine di testo dattiloscritto e consiste in un'introduzione, 6 capitoli che descrivono la metodologia e i risultati dello studio, conclusioni, conclusioni, bibliografia da 288 fonti (di cui 30 in russo e 258 in lingue straniere) e 4 appendici . L'opera contiene 40 figure e 52 tavole.

MATERIALI E METODI DI RICERCA

Caratterizzazione di campioni e materiali per la ricerca.

Il lavoro si basa sui risultati di studi condotti nel laboratorio di malattie metaboliche ereditarie presso l'istituto di bilancio dello Stato federale "Centro di ricerca genetica medica" dell'Accademia russa delle scienze mediche (lab. Per valutare la struttura nosologica del gruppo LSD, è stata effettuata un'analisi di 902 casi di LSD, diagnosticati in laboratorio dal 1992 al 2009. La caratterizzazione della frequenza relativa delle sottoclassi NBO è stata effettuata su un campione di 370 pazienti identificati durante l'esame di 9875 pazienti riferiti con sospetto di NBO dal Dipartimento di consulenza scientifica dell'Istituto di bilancio dello Stato federale "Centro scientifico statale di Mosca" dell'Istituto russo Accademia delle scienze mediche, dipartimenti di neurologia ed endocrinologia dell'istituto di bilancio dello Stato federale "Ospedale clinico per bambini russi" del Ministero della sanità della Federazione Russa, cliniche di malattie nervose. A. Ya Kozhevnikov Università medica statale di Mosca. LORO. Sechenov, Istituzione di bilancio dello Stato federale "Centro di ricerca endocrinologica del Ministero della sanità della Federazione Russa", Istituzione di bilancio dello Stato federale "Centro scientifico per la salute dei bambini e degli adolescenti" dell'Accademia russa delle scienze mediche, Istituzione di bilancio dello Stato federale "Mosca Istituto di ricerca di pediatria e chirurgia pediatrica del Ministero della sanità russo", consultazioni mediche e genetiche regionali.

L'incidenza dell'LSD nel Distretto Federale Centrale della Russia è stata calcolata sulla base del numero di nuovi casi di malattie diagnosticate nel laboratorio dell'NBO dell'Istituto di bilancio dello Stato federale "MGNTS" dell'Accademia russa delle scienze mediche per il periodo 2000-2000. 2009. I dati sul numero di nati vivi per questo periodo per regioni della Federazione Russa sono stati ottenuti dai dati Rosstat sul sito web: (http://gks.ru/wps/wcm/connect/rosstat/). Per calcolare la frequenza, il metodo descritto da Poorthuis B.J. et al. (1999). La frequenza è stata calcolata come numero totale di pazienti diagnosticati rispetto al numero totale di neonati nello stesso periodo (dove per periodo di nascita si intende l'intervallo tra l'anno di nascita del paziente più anziano e l'anno di nascita del paziente più giovane nel campione). Se durante il periodo specificato veniva identificato un solo paziente, veniva preso in considerazione il numero totale di neonati in questi anni.

I campioni di macchie di sangue (n=113), nonché i dati sulla concentrazione di galattosio totale nel sangue dei neonati con sospetta galattosemia, sono stati forniti dal Centro per lo screening neonatale di Mosca. Per lo screening selettivo per NBO con il metodo MS/MS, sono stati analizzati 500 campioni di macchie neonatali del Centro di screening neonatale di Mosca e 5205 pazienti dei reparti psiconeurologici di grandi ospedali clinici pediatrici: Istituto di bilancio dello Stato federale "Ospedale clinico pediatrico russo " del Ministero della Sanità della Federazione Russa, Istituto federale di bilancio dello Stato "Centro scientifico per la salute dei bambini e degli adolescenti" RAMS. Per selezionare i pazienti per lo screening selettivo, sono stati utilizzati criteri generalmente accettati sviluppati in precedenza (Krasnopolskaya K.D., 2000).

Il materiale per la diagnostica biochimica era plasma di sangue venoso eparinizzato e/o campioni di urina del mattino.

Campioni di DNA isolati da sangue intero o macchie di sangue essiccato su filtri sono stati utilizzati come materiale per studi di genetica molecolare.

Metodi sperimentali.

L'analisi degli amminoacidi e delle acilcarnitine è stata effettuata su uno spettrometro di massa tandem quadrupolo PE Sciex API 2000 (PE Sciex, Ontario, Canada) con ionizzazione positiva in elettrospray. La preparazione dei campioni per l'analisi di aminoacidi e acilcarnitine mediante MS/MS è stata effettuata utilizzando il kit di spettrometria di massa tandem per aminoacidi e acilcarnitine NeoGram (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Wallac OY, Finlandia).

Gascromatografia: la spettrometria di massa è stata eseguita su uno strumento HP5972A, colonna HP-5MS (30 m*0,25 mm*4 µm). La concentrazione di acidi organici nelle urine è stata determinata come trimetilsilil eteri.

Per determinare l'attività dell'enzima G-1-FUT è stato utilizzato un test fluorimetrico di Butler modificato (Beutler E., 1968).

Per l'analisi genetica molecolare, il DNA genomico è stato isolato dal sangue intero e dalle macchie di sangue sui filtri utilizzando il kit Diatom DNA Prep (OOO Biokom, Russia) secondo il metodo raccomandato dal produttore. L'amplificazione è stata effettuata su un termociclatore multicanale MS2 (JSC DNA-Technology, Mosca).

Per ciascuna coppia di primer sono state selezionate condizioni che differiscono nella temperatura di ricottura richiesta e nella concentrazione di MgCl2. L'analisi delle mutazioni frequenti è stata eseguita mediante PCR, analisi di restrizione, elettroforesi su gel, utilizzando primer oligonucleotidici, le cui sequenze sono state selezionate in base alla sequenza nucleotidica dei geni pubblicata nel database GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih. governo/genbank/). La ricerca di mutazioni nei geni è stata effettuata mediante sequenziamento automatico di frammenti di DNA secondo il protocollo del produttore su un dispositivo ABI Prism 3100 (Applied Biosystems).

Elaborazione statistica dei risultati della ricerca

La valutazione della significatività statistica dei risultati è stata effettuata utilizzando i metodi della statistica parametrica e non parametrica per confronti multipli. L’analisi dei dati è stata preceduta dalla verifica della conformità delle distribuzioni dei valori degli indicatori ai loro criteri di “normalità”. Nel caso di una distribuzione normale è stata utilizzata l'analisi della varianza unidirezionale ANOVA o ANOVA per misurazioni ripetute, altrimenti il test di Kruskal-Wallis e/o il test di Newman-Keuls. I risultati sono stati elaborati utilizzando il software Excel 2000, Statistica 6.0.

RISULTATI E DISCUSSIONE

Spettro e frequenze relative delle singole sottoclassi NBO

In totale, il laboratorio NBO diagnostica 157 diverse forme di malattie, ovvero circa il 30% di tutte le NBO conosciute. Nel periodo 2004-2009 sono stati esaminati 9875 pazienti con sospetta NBO, in 370 pazienti sono state identificate 48 diverse forme nosologiche appartenenti a 10 diverse sottoclassi di NBO.

I risultati dell’analisi hanno mostrato che le forme più comuni di NBO nel campione analizzato sono LSD (n=177-48%) e MB (n=69-19%), che insieme rappresentano più della metà di tutti i casi (Fig .1).

Le malattie associate ad un alterato metabolismo degli aminoacidi, degli acidi organici e ai difetti dell'ossidazione mitocondriale rappresentano rispettivamente il 2%, 7%, 4% (i casi di fenilchetonuria non sono inclusi nel calcolo).

Secondo i laboratori stranieri, le quote relative delle malattie di queste classi sono più significative rispetto al nostro campione, il che indica la necessità di migliorare i metodi di diagnosi.

Figura 1. Frequenze relative delle singole sottoclassi NBO nel campione di studio.

Nota: malattie mitocondriali MB, aciduria organica OA, aminoacidopatia AA, disturbi del metabolismo dei carboidrati OH, malattie da accumulo lisosomiale LSD, malattie perossisomiali PB, difetti di β-ossidazione nell'ossidazione mitocondriale degli acidi grassi

Analisi della struttura nosologica delle sottoclassi NBO più rappresentate

Per valutare la struttura nosologica del gruppo LSD, abbiamo analizzato 902 casi di LSD diagnosticati in laboratorio dal 1992 al 2009. Durante questo periodo furono identificate 25 diverse forme di LSD. L'analisi effettuata mostra che le mucopolisaccaridosi e le lipidosi (sfingolipidi e gangliosidosi) sono le più frequenti, e costituiscono una percentuale significativa di tutti i casi diagnosticati di LSD. Nel gruppo delle sfingolipidosi, la forma più comune della malattia è la malattia di Gaucher (Fig. 2). Una tendenza simile si osserva in altri paesi europei: Repubblica Ceca, Australia e Germania.

Per valutare la struttura nosologica del gruppo MB, è stata effettuata un'analisi di 176 casi di MB diagnosticati in laboratorio nel periodo 2004-2009. L'intervallo di tempo selezionato corrisponde all'inizio della diagnosi di queste malattie nel laboratorio dell'NBO FSBI "MGNTS" dell'Accademia russa delle scienze mediche. Nel gruppo MB sono più comuni le malattie associate a mutazioni del mtDNA, tra le quali prevalgono le mutazioni che portano alla sindrome di Leber (n=62).

Riso. 2. Frequenza relativa delle forme nosologiche nel campione di pazienti affetti da LSD

Nota: B. Gaucher - malattia di Gaucher, MLD - leucodistrofia metacromatica, MPS - mucopolisaccaridosi, NCL2 - ceroide lipofuscinosi neuronale di tipo 2, ML II / III - mucolipidosi di tipo II / III, B. Krabbe - malattia di Krabbe

Nel nostro studio, un gran numero di casi (n=34) sono stati segnalati associati a mutazioni nel gene SURF1, che porta al deficit di citocromo c ossidasi (IV del complesso della catena respiratoria mitocondriale). Le mutazioni di questo gene sono la causa di una delle forme frequenti di MB che debutta nell'infanzia: la sindrome di Leigh.

La frequenza delle malattie del gruppo delle malattie da accumulo lisosomiale in Russia (Distretto Federale Centrale)

L'LSD è uno dei gruppi NBO più diversificati e ben studiati, che comprende più di 45 diverse entità nosologiche. Dal 1982, il RAMS è impegnato nella diagnosi di laboratorio di conferma dell'LSD presso il laboratorio NBO del Centro scientifico statale di Mosca dell'Accademia russa delle scienze mediche ed è l'unico laboratorio nella Federazione Russa che esegue diagnosi accurate della maggior parte dell'LSD. Il laboratorio riceve campioni da tutte le regioni della Federazione Russa, ma il presente studio ha incluso solo pazienti residenti nel Distretto Federale Centrale (CFD) a cui è stata diagnosticata in laboratorio nel periodo dal 2000 al 2009 (Tabella 1). Ciò è dovuto alla vicinanza geografica a Mosca e al livello piuttosto elevato di assistenza genetica medica in questa regione.

L'incidenza totale delle malattie del gruppo LSD è stata determinata in diversi paesi europei e varia da 7,6 a 25 per 100.000 neonati (Meikle P.J. et al., 1999; Poorthuis B.J. et al., 1999; Applegarth D.A. et al., 2000; Dionisi-Vici C. et al., 2002; Pinto R. et al., 2004). Nella Federazione Russa tali studi non sono stati condotti.

Dall'analisi emerge che la frequenza totale dell'LSD nella Federazione Russa (CFD) è di 5,22:100.000 neonati (1:19937), negli altri paesi europei il valore è circa 2-3 volte superiore, ma va tenuto presente che tutti queste malattie sono estremamente rare e la variazione casuale nella stima della loro frequenza è molto elevata, riflettendo le soglie minima e massima all'intervallo di confidenza del 95% nonché diversi approcci di calcolo.

La frequenza più alta si riscontra per le seguenti forme nosologiche: malattia di Gaucher -0,93 (IC 95% 0,790-1,070), MPS tipo I - 0,82 (IC 95% 0,552-1,089), MPS tipo II -0,74 (IC 95% 0,478-1,075 ), gangliosidosi GM1 -0,58 (IC 95% 0,117-1,052). Va notato che, a differenza di altri paesi, nella Federazione Russa sono stati diagnosticati solo casi isolati di malattia di Niemann-Pick di tipo C (n=3) e di malattia di Pompe (n=5), che insieme influenzano anche l’incidenza complessiva dell’LSD. Ci sono meno casi di MPS di tipo III nel gruppo MPS che in altri paesi.

Tabella 1. Frequenza di alcune forme di LSD per 100.000 neonati.