REAZIONE DI PRECIPITAZIONE DEL GEL, RPG
(Test di precipitazione del gel)

Metodo per rilevare antigeni e anticorpi basato sulla diffusione dei componenti attraverso uno strato di gel di agar (agarosio) e sulla formazione di un precipitato visibile nelle aree in cui vengono create le loro concentrazioni equivalenti.

Il metodo più comunemente utilizzato è la doppia (contro) diffusione, proposta da O. Uchterloni nel 1948, in cui antigeni e sieri vengono introdotti in pozzetti opposti ritagliati in una piastra di gel; dopo un certo tempo si formano nello spessore del gel delle bande di precipitazione corrispondenti al numero di antigeni e anticorpi della stessa specificità. Inoltre, il metodo permette di confrontare più antigeni tra loro con un certo siero standard: se sono identici, le bande di precipitazione da essi formate si fondono in una linea continua e, viceversa, le bande si intersecano se gli antigeni confrontati presentano differenze (il così -fenomeno detto “sperone”). Un altro vantaggio dell'RPG è che le miscele di antigeni possono essere separate con velocità di diffusione diverse e possono essere rilevate individualmente; per lo stesso motivo gli inibitori della precipitazione possono separarsi se presenti nel materiale in esame. Lo svantaggio del metodo è la bassa sensibilità, altrimenti la risoluzione. L'RPG è stato ampiamente utilizzato come test per la rilevazione degli antigeni del virus dell'epatite B e degli anticorpi contro di essi negli anni '60 e '70, in particolare, utilizzando questa reazione, è stato stabilito che l'antigene e o

Questo articolo sarà dedicato al fenomeno della reazione di precipitazione. Qui considereremo le caratteristiche della formulazione di questo fenomeno, il fenomeno della diffusione, le caratteristiche generali, il ruolo nella vita umana e molto altro.

Conoscenza del fenomeno

La precipitazione è un fenomeno di tipo sierologico, durante il quale gli antigeni solubili interagiscono con gli anticorpi e, di conseguenza, si osserva la precipitazione: precipitato.
La caratteristica generale della reazione di precipitazione è una forma di influenza coordinata di antigene e anticorpo. Questi tipi di interazioni consentono di determinare la presenza di antigeni sconosciuti nella sostanza in esame aggiungendo anticorpi e antigeni noti. Il processo di precipitazione senza la presenza di sali procederà peggio e il miglior ottimale si trova nell'intervallo compreso tra 7,0 e 7,4 pH.

Costituenti di una reazione

Tra i componenti della reazione di precipitazione, ci sono tre elementi principali:

1. Un antigene di natura molecolare. È nello stato di tipo fine, in altre parole, è solubile. Inoltre, tale antigene è chiamato precipitogeno, che è un lisato o un estratto di tessuto, ecc. Un precipitogeno ha una differenza caratteristica da un agglutinogeno, che risiede nella dimensione delle particelle di cui è costituito. L'agglutinogeno ha una dimensione cellulare intrinseca e i precipitogeni sono commisurati alla dimensione della molecola. La soluzione antigenica è caratterizzata da trasparenza.
2. Un anticorpo presente nel siero del sangue umano, nonché nel siero diagnostico immunitario, che contiene gli anticorpi studiati.
3. Gli elettroliti sono una soluzione di cloruro di sodio, caratterizzata da uno stato isotonico.

Preparazione del precipitatogeno

L'avvio di una reazione di precipitazione è impossibile senza un precipitogeno, che si ottiene macinando materiali ed estraendo da essi antigeni proteici. L'estrazione avviene mediante bollitura o altri metodi.
Un esempio lampante di precipitogeni sono i lisati, nonché estratti di tessuti e organi, siero di sangue, vari tipi di filtrati a base di colture di brodo microbico, nonché estratti salini di microrganismi e sostanze autolisate.

Stadiazione delle precipitazioni

Consideriamo ora il metodo per impostare la reazione di precipitazione.
Viene effettuata una reazione di precipitazione dell'anello, che avviene in provette appositamente preparate. Il siero viene introdotto nella cavità delle stoviglie, versandolo sulla parete con l'aiuto di un beccuccio a pipetta. Successivamente, la quantità appropriata di precipitatore viene accuratamente stratificata sopra, quindi il tubo viene portato in posizione verticale da orizzontale. Impostare e tenere conto della reazione di precipitazione è un'operazione molto meticolosa. Il risultato viene registrato dopo la comparsa di un anello bianco sul confine tra antigene e anticorpo. Se gli elementi reagenti della reazione corrispondono tra loro, allora sono collegati, ma ciò diventa evidente dopo un lungo periodo di tempo della loro interazione.
La reazione di precipitazione viene effettuata anche in una capsula Petri o su un vetrino, dove viene trasferito il gel di agar, applicandolo in un piccolo strato. Dopo che si è indurito nel gel, viene tagliato un piccolo numero di pozzetti in cui verranno inseriti gli antigeni e gli anticorpi. Esistono due modi per eseguire questa azione: il metodo dell'immunodiffusione radiale e quello della doppia immunodiffusione.

informazioni generali

La meccanica di funzionamento della precipitazione è simile al dispositivo di agglutinazione. Sotto l'influenza del siero di tipo immunitario, l'antigene che è già entrato nella reazione si riduce, una condizione importante è la trasparenza sia del siero che dell'antigene.
È possibile migliorare la registrazione della reazione se gli antigeni vengono sovrapposti agli anticorpi. Di conseguenza, si può osservare l'aspetto dei precipitati sotto forma di anello. Questo fenomeno è chiamato precipitazione ad anello e viene effettuato in tubi speciali aventi un diametro compreso tra 2,5 e 3,5 mm. Uno degli esempi più diffusi di reazione da precipitazione è la diagnosi di antrace.
La precipitazione consente di determinare il livello di tossigenicità della coltura di difterite nell'agar.
Nel corso della reazione in esame vengono precipitati complessi antigenici e anticorpi. La precipitazione è un fenomeno immunologico che consente di determinare la quantità di anticorpi nei sieri sanguigni di una persona malata o vaccinata e di animali.

Conseguenza della titolazione

È importante sapere che i dati ottenuti dalla titolazione del suddetto metodo non sono quantificabili. Per creare e analizzare una valutazione quantitativa del numero di anticorpi contenuti, M. Heidelberger ed E. Kabat hanno sviluppato una speciale tecnica di reazione, che si basa sulla ricerca e l'identificazione della zona di equivalenza. La miscelazione del numero di età degli antigeni con un volume costante di antisiero porta ad un aumento del precipitato inizialmente formato, e poi diminuisce nuovamente a causa dell'aumento della capacità di dissolvere i complessi antigenici. Determinando la quantità di anticorpi nei surnatanti contenuti in ciascuna provetta, è possibile scoprire che in un certo numero di piastre con anticorpi mancherà il liquido. Qui, rispetto ad altre provette, si formerà il precipitato più grande. Grazie a ciò e alla sottrazione del precipitato proteico antigenico dal valore totale delle proteine, è possibile ottenere il valore esatto degli anticorpi contenuti nel volume del siero appositamente studiato. Inoltre, la quantità di molecole proteiche del precipitato è determinata dalla quantità di azoto o mediante metodi colorimetrici.

Stima dei valori

La valutazione dei valori di precipitazione nella metodologia diagnostica dovrebbe tenere conto della possibilità della presenza nel siero immune di un anticorpo che non ha la proprietà della precipitina, da cui ne consegue che il precipitato stesso potrebbe non formarsi dopo aver reagito con antigeni. L'elenco di tali molecole comprende anticorpi incompleti e alcune specie del gruppo delle globuline gamma-A.

La reazione di precipitazione in condizioni di laboratorio trova la sua applicazione in vari tipi di modifiche. Ad esempio, la reazione di termoprecipitazione viene utilizzata per rilevare gli antigeni batterici del botulismo, dell'antrace, ecc., che non subiscono la denaturazione termica. A differenza della precipitazione ad anello, questo tipo di reazione utilizza filtrati del materiale in questione allo stato bollito.
la precipitazione in una miscela complessa non consente di caratterizzare le proprietà dei singoli elementi della miscela. In tali casi, una persona ricorre al metodo di precipitazione nell'agar e utilizza anche l'immunoelettroferesi.

Precipitazioni diffuse

In questo campo di ricerca esiste il concetto di reazione di precipitazione diffusa (RPD). Si basa sulla capacità di diffondere nel gel anticorpi e antigeni solubili. La diffusione è la capacità di una molecola di una certa sostanza di penetrare nelle molecole di un'altra, causata dal movimento termico.
Il gel è un sistema di tipo disperso in cui la fase liquida è distribuita uniformemente nella fase solida. Molto spesso, per tale reazione viene utilizzato il gel di agar.
Dopo aver fornito i parametri secondo i quali le molecole possono diffondersi l'una rispetto all'altra, il loro incontro sarà accompagnato dalla formazione di un complesso antigene + anticorpo. Tale neoplasia è in grado di diffondersi, essendo nel gel stesso, e precipiterà assumendo la forma di una striscia che può essere rilevata ad occhio nudo. Se l'antigene e l'anticorpo sono omologhi, non si formerà alcuna banda.
Creare le condizioni in cui avverrà la diffusione nello strato di agar implica il riempimento dei componenti, ma il numero totale di pozzetti e la loro posizione relativa è determinata dal tipo di problema da risolvere. L'RPD consente a una persona di rilevare e identificare virus isolati sconosciuti testando utilizzando sieri anticorpali noti.

Applicazione

Le precipitazioni sono ampiamente utilizzate non solo nella diagnosi delle malattie, ma trovano anche la loro applicazione negli esami medici forensi. È difficile immaginare un'analisi in cui sia possibile determinare la specie del sangue, di parte di un organo o di un tessuto rinvenuto su un'arma del delitto che non utilizzi la reazione di precipitazione. Durante questo processo vengono utilizzati sieri precipitanti, ottenuti immunizzando vari animali e uccelli. È importante che il livello del titolo sierico non sia inferiore a 1:10000 e che abbia anche una specificità sufficiente. Dalla macchia rilevata di sangue o dalla sua crosta, viene effettuato un estratto per uso fisico. soluzione, che sarà ulteriormente esposta al siero precipitante. Secondo questa reazione è possibile stabilire i tipi di proteine ​​dei tessuti e degli organi sia degli esseri umani che degli animali. L'ottenimento di estratti torbidi obbliga a ricorrere alla precipitazione su agar.

conclusioni

Analizzando le informazioni lette, possiamo concludere che le reazioni di precipitazione sono estremamente importanti per una persona, poiché consentono di diagnosticare vari antigeni mediante anticorpi, questo fenomeno è ampiamente utilizzato anche negli esami medici forensi e consente di identificare il tipo di sangue, tessuto o organo in relazione ad un particolare argomento. Esistono diversi tipi e metodi di precipitazione, che vengono utilizzati in base alle esigenze emergenti del problema da risolvere.

Nella reazione di precipitazione viene precipitato un complesso immunitario specifico, costituito da un antigene solubile (lisato, estratto, aptene) e un anticorpo specifico in presenza di elettroliti.

Viene chiamato l'anello torbido o il precipitato formato come risultato di questa reazione precipitato. Questa reazione differisce dalla reazione di agglutinazione principalmente per la dimensione delle particelle di antigene.

La reazione di precipitazione viene solitamente utilizzata per determinare l'antigene nella diagnosi di numerose infezioni (antrace, meningite, ecc.); in medicina legale - per determinare le specie di sangue, sperma, ecc .; negli studi sanitari e igienici - quando si stabilisce la falsificazione dei prodotti; con il suo aiuto determinare la relazione filogenetica di animali e piante. Per la reazione di cui hai bisogno:

1. Anticorpi (precipitine) - siero immune con un titolo anticorpale elevato (non inferiore a 1:100.000). Il titolo del siero precipitante è determinato dalla più alta diluizione dell'antigene con cui reagisce. Il siero viene solitamente utilizzato non diluito o diluito 1:5 -1:10.

2. Antigene: sostanze disciolte di natura proteica o polisaccaridica lipidica (antigeni completi e apteni).

3. Soluzione isotonica.

I principali metodi per effettuare la reazione di precipitazione sono: reazione di precipitazione ad anello e reazione di precipitazione in agar (gel).

Attenzione! Tutti i componenti coinvolti nella reazione di precipitazione devono essere completamente trasparenti.

Reazione di precipitazione dell'anello. 0,2 - 0,3 ml (5-6 gocce) di siero vengono aggiunti alla provetta di precipitazione utilizzando una pipetta Pasteur (il siero non deve cadere sulle pareti della provetta). L'antigene viene accuratamente stratificato sul siero nello stesso volume, versandolo con una sottile pipetta Pasteur lungo la parete della provetta. La provetta viene mantenuta in posizione inclinata. Con una stratificazione adeguata, si dovrebbe ottenere un confine chiaro tra il siero e l'antigene. Con attenzione, per non mescolare il liquido, posizionare la provetta su un treppiede. Con un risultato positivo della reazione, si forma un "anello" torbido al confine tra l'antigene e l'anticorpo: un precipitato.

Reazione di precipitazione in agar(gel). La particolarità della reazione è che l'interazione dell'antigene e dell'anticorpo avviene in un mezzo denso, cioè in gel. Il precipitato risultante dà una fascia torbida nello spessore del mezzo. L'assenza di una banda indica una mancata corrispondenza tra i componenti della reazione. Questa reazione è ampiamente utilizzata nella ricerca biomedica, in particolare nello studio della formazione di tossine nell'agente eziologico della difterite.

Reazione di lisi (citolisi immunitaria)

lisi immunitaria- questa è la dissoluzione delle cellule sotto l'influenza di anticorpi con la partecipazione obbligatoria del complemento. Per la reazione di cui hai bisogno:

1. Antigene microbi, eritrociti o altre cellule.

2. Anticorpo(lisina) - siero immunitario, raramente il siero del paziente. Il siero batteriolitico contiene anticorpi coinvolti nella lisi dei batteri; emolitico: emolisina che contribuisce alla lisi dei globuli rossi; per la lisi delle spirochete sono necessarie spirochetolizine, cellule - itolizine, ecc.

3. Complemento. La maggior parte del complemento nel siero delle cavie. Questo siero (miscela di diversi animali) viene solitamente utilizzato come complemento.

4. Soluzione isotonica.

Reazione di precipitazione (RP)

Il fenomeno della precipitazione consiste nell'interazione di antigeni fini (precipitinogeni) con i corrispondenti anticorpi (precipitine) e nella formazione di un precipitato (Fig. 1). La formulazione di RP viene effettuata mediante due metodi: in un mezzo liquido - a seconda del tipo di reazione di flocculazione, precipitazione ad anello o in un mezzo denso in agar (gel). L'RP viene utilizzato per due scopi: rilevamento di antigeni utilizzando siero immunoprecipitante noto o anticorpi utilizzando antigeni noti. Esistono molte opzioni per impostare la reazione, ma i metodi più spesso utilizzati sono i seguenti: reazione di precipitazione del gel di Ouchterlony, reazione di immunodiffusione radiale di Mancini, reazione di immunoelettroforesi, reazione di flocculazione, precipitazione dell'anello.

Riso. 1. Reazione di precipitazione: 1 - antigene; 2 - anticorpo.

Reazione di precipitazione del gel secondo Ouchterlony. Per impostare la reazione viene utilizzato agar Difco all'1%, che viene versato in uno strato spesso 0,5 cm fuso su vetrini o piastre Petri.Nell'agar congelato vengono praticati dei fori di 5 mm di diametro con un apposito dispositivo. Una sospensione contenente l'antigene da testare viene posta in un pozzetto e il siero immune nell'altro. L'antigene e gli anticorpi si diffondono nel mezzo nutritivo, entrano in una reazione immunitaria e formano bande di precipitazione. La contabilità della reazione viene effettuata prima dopo 4 ore, infine - dopo 24-48 ore. La reazione di Ouchterlony può essere utilizzata per determinare la tossicità dei batteri, il titolo anticorpale, l'attività dei diagnostici standard o dei sieri immunospecifici (Fig. 2).

Riso. 2. Reazione di precipitazione: A - reazione di precipitazione ad anello; B - Reazione di precipitazione di Ouchterlony.

Reazione di precipitazione dell'anello

Questa reazione viene utilizzata per rilevare gli antigeni utilizzando siero precipitante immunitario contenente anticorpi specifici. Questo è un metodo di ricerca qualitativo. La reazione viene effettuata stratificando sul siero immune un terreno contenente un antigene specifico. La reazione viene posta in provette strette con un volume di 0,1-0,5 ml. Se l'antigene e l'anticorpo coincidono, entro 3-5 minuti si forma un anello di precipitazione al confine tra loro (Fig. 2). Una condizione necessaria per la formazione di un complesso immunitario insolubile è un rapporto equivalente tra antigeni e anticorpi.

Immunodiffusione radiale secondo Mancini

L'immunodiffusione radiale secondo Mancini consente l'utilizzo di antisieri monospecifici e di uno standard a contenuto antigenico noto. L'antigene in esame e le diluizioni delle soluzioni testate per la presenza di questo antigene vengono posti in pozzetti tagliati in file in una piastra di gel, dove è stato precedentemente aggiunto il corrispondente antisiero monospecifico. L'antigene diffonde nel gel e, combinandosi con anticorpi specifici, forma anelli di precipitazione, il cui diametro dipende dalla concentrazione dell'antigene nei pozzetti. I risultati ottenuti vengono utilizzati per costruire una curva di calibrazione che esprime la dipendenza dei diametri dei precipitati dalla concentrazione dell'antigene nelle soluzioni in esame (Fig. 3). Il principio della diffusione radiale è alla base del metodo utilizzato per studiare la tossigenicità delle colture batteriche e per selezionare cloni con elevato grado di tossicità da una popolazione batterica. In questo caso, le colture studiate vengono inoculate in piastre di agar contenenti siero antitossico. Attorno alle singole colonie si formano anelli di precipitazione il cui diametro è direttamente proporzionale al grado di tossicità del ceppo (Fig. 3).

Riso. 3. Immunodiffusione radiale semplice: a - anelli di precipitazione b - curva di calibrazione.

Reazione di immunoelettroforesi (IEF)

La reazione si basa sul principio della precipitazione. L'IEF viene solitamente utilizzato per studiare la struttura antigenica dei microrganismi. La reazione viene effettuata in due fasi. Innanzitutto viene effettuata una separazione elettroforetica dell'antigene in un gel di agar tamponato. Il complesso antigenico viene posto nel pozzetto, che si trova al centro del gel, versato su una lastra di vetro. Successivamente, una corrente elettrica viene fatta passare attraverso il gel, di conseguenza gli antigeni si muovono a distanze disuguali a seconda della loro mobilità elettroforetica. Successivamente, uno specifico siero immunitario viene introdotto nella scanalatura, che si trova lungo il bordo della piastra, e posto in una camera umida. Gli antigeni e gli anticorpi si diffondono nel gel gli uni verso gli altri. Al posto del loro contatto si formano linee arcuate di precipitazione. Con l'aiuto dell'IEF vengono analizzate la composizione e la quantità di proteine ​​nel siero del sangue, nel liquido cerebrospinale e nelle proteine ​​microbiche (Fig. 4).

PRECIPITAZIONE(lat. praecipitatio caduta rapida) - una reazione immunologica di precipitazione da una soluzione di un complesso antigene-anticorpo, che si forma come risultato della combinazione di un antigene solubile (precipitinogeno) con anticorpi specifici (precipitine).

La reazione di P. è ampiamente utilizzata per l'identificazione e la definizione quantitativa dei più diversi antigeni e anticorpi (vedi Immunodiagnostica), nella sierodiagnosi inf. malattie (vedi studi sierologici), per rilevare impurità negli alimenti, nello studio delle relazioni evolutive nel mondo animale e vegetale, nello studio della struttura di vari bioli, composti, in medicina legale per determinare le specie di macchie di sangue e altri bioli, liquidi.

P. fu scoperto nel 1897 da R. Kraus, che osservò la precipitazione (precipitato) mescolando filtrati trasparenti privi di cellule di colture in brodo di batteri della peste, del colera e del tifo con sieri immunitari omologhi. Nel 1899 F. Ya. Chistovich, immunizzando conigli con siero di anguilla, ottenne anticorpi precipitanti e dimostrò così per la prima volta la specificità della specie delle proteine ​​del siero del sangue. Domanda di P. in tribunale - medico. l'esame per determinare le specie del sangue fu proposto nel 1901 da P. Ulengut. La reazione fu chiamata reazione Chistovich-Ulengut. Successivamente, è stato dimostrato che in rappresentanti di varie specie di vertebrati si formano anticorpi precipitanti (vedi) contro qualsiasi sostanza macromolecolare estranea (vedi). Antigeni). Gli anticorpi precipitanti appartengono alle classi G e M delle immunoglobuline (vedi Immunoglobuline). La velocità e l'intensità della biosintesi degli anticorpi precipitanti sono determinate da una serie di fattori: la dose e la via di somministrazione dell'antigene, lo schema di immunizzazione e le caratteristiche della sostanza chimica. la struttura dell'antigene e le caratteristiche genetiche dell'organismo immunizzato.

Per ottenere sieri precipitanti vengono utilizzati vari schemi di immunizzazione. Diversi cicli di immunizzazione, ciascuno con diverse iniezioni endovenose o intramuscolari dell'antigene in quantità crescenti, danno buoni risultati. Nel 1915, MI Raysky propose uno schema consistente nell'immunizzazione primaria e nella reimmunizzazione a distanza. Questo principio si basa sull'ottenimento di sieri precipitanti ad alto titolo. L'immunizzazione primaria viene solitamente effettuata con un antigene miscelato con qualche sostanza di deposito (lanolina, olio minerale, allume di potassio, ecc.), che potenzia la risposta immunitaria, mentre la reimmunizzazione a distanza viene effettuata solo con un antigene. L'adiuvante (amplificatore) di Freund è ampiamente utilizzato come sostanza depositante, costituito da una miscela di oli minerali e Mycobacterium tuberculosis ucciso (vedi Adiuvanti).

Una soluzione antigenica emulsionata in un uguale volume di adiuvante di Freund viene somministrata per via sottocutanea o intramuscolare ad animali da esperimento in diversi punti sul dorso o nei cuscinetti delle zampe posteriori o nei linfonodi poplitei. nodi degli arti posteriori. Alcuni regimi utilizzano combinazioni delle vie di somministrazione sopra indicate. Un mese dopo, agli animali viene iniettata la soluzione antigenica per via endovenosa o intramuscolare. Se necessario, prima della reimmunizzazione, viene effettuata l'iposensibilizzazione secondo Bezredka (vedi metodi Bezredk). Con un consumo insignificante dell'antigene (1-3 mg per gli antigeni proteici per ciclo di immunizzazione), la quantità di anticorpi formati raggiunge diversi milligrammi per 1 ml di siero immunitario.

La reazione di precipitazione è caratterizzata da elevata specificità. In una serie di lavori di K. Landsteiner con antisieri per antigeni coniugati, i cui gruppi determinanti erano vari radicali organici, è stato dimostrato che nella reazione di P. si possono differenziare gli stereoisomeri dei composti organici. La forza delle reazioni incrociate osservate è determinata dalla vicinanza della sostanza chimica. strutture di gruppi determinanti di immunoantigeni e antigeni di test. La composizione del precipitato comprende antigeni e anticorpi specifici per essi e praticamente non include altre proteine ​​del siero del sangue, ad eccezione del complemento.

P. è una reazione altamente sensibile. Con il suo aiuto è possibile rilevare decine di microgrammi di antigene. Quando si determinano gli anticorpi, la soglia di sensibilità della reazione è di ca. 20 microgrammi di proteine. La sensibilità della reazione aumenta significativamente se si utilizzano antigeni o anticorpi marcati con isotopi radioattivi (vedi).

Dichiarazione della reazione

Quando si imposta la reazione di precipitazione, è necessario tener conto della sua natura zonale, che si esprime nel fatto che la composizione molecolare e la quantità del precipitato risultante sono determinate dal rapporto tra antigene e anticorpi introdotti nella reazione (vedi Reazione antigene-anticorpo). Quando si utilizza una quantità costante di antisiero e quantità crescenti di antigene, la quantità di precipitato in una serie di provette prima aumenta, raggiunge il massimo e poi diminuisce fino a scomparire completamente. Gli anticorpi liberi vengono rilevati nel surnatante delle prime provette (zona di eccesso di anticorpi), nel liquido sopra il precipitato massimo (zona di equivalenza) non si trovano né anticorpi liberi né antigene libero, nel surnatante delle provette si trovano immunocomplessi solubili e antigene libero ultimi tubi (zona in eccesso di antigene) . La formazione di immunocomplessi solubili con un piccolo peso molecolare nella zona in eccesso dell'antigene è caratteristica di tutti i sistemi precipitanti in cui gli anticorpi appartengono alle IgG. Questa zona di reazione è quindi chiamata zona di ritardo o zona post. Va notato che gli immunocomplessi di antigeni con anticorpi IgM sono insolubili in un eccesso molto elevato dell'antigene, dieci volte maggiore della sua quantità sufficiente per formare immunocomplessi solubili con anticorpi IgG.

I sieri antiproteici equini sono caratterizzati dalla formazione di complessi immunitari solubili nella zona degli anticorpi in eccesso, cioè dalla formazione di una prozona (vedi fenomeno di Neisser-Veksberg). Questa caratteristica della reazione fu scoperta per la prima volta da G. Ramon nel sistema tossina difterica - siero di cavallo antitossico (vedi Flocculazione). La dissoluzione degli immunocomplessi nella zona degli anticorpi in eccesso è stata successivamente osservata durante P. con sieri di sangue di coniglio e cane contro albumina sierica bovina, con siero di sangue umano contro tireoglobulina e antisiero di pecora contro polipeptidi sintetici.

Anche la composizione molecolare del precipitato è determinata dal molo. peso (massa) dell'antigene. Per l'albumina d'uovo, dicono. peso a-rogo 42.000 dalton, in una zona di equivalenza su una molecola di antigene cadono in media 2,5 molecole di anticorpi. Con un aumento di mol. peso dell'antigene, aumenta il numero di molecole di anticorpi legate da una molecola di antigene.

Gli articoli vengono utilizzati per la determinazione qualitativa e quantitativa di antigeni e anticorpi. Metodo qualitativo rapido, semplice e sensibile P. - precipitazione ad anello, proposto nel 1902 da Ascoli. La precipitazione ad anello viene utilizzata per identificare gli antigeni solubili dei microrganismi. La reazione viene effettuata in provette strette o capillari, stratificando attentamente la soluzione dell'antigene sul siero immunitario. Con una reazione positiva, all'interfaccia di due liquidi appare un anello di precipitazione. Il risultato della reazione non è influenzato da un eccesso di antigene dovuto alla diffusione graduale dei reagenti al confine dei liquidi. Se come antigeni si utilizzano estratti acquosi bolliti e filtrati di organi o tessuti, la reazione viene chiamata "termoprecipitazione" (vedi reazione di Ascoli). Con l'aiuto della termoprecipitazione, gli antigeni batterici termostabili (coctoantigeni) vengono rilevati nei tessuti e negli organi di animali morti nella diagnosi di peste, colera, antrace. La precipitazione ad anello e la termoprecipitazione vengono eseguite con antisieri ad alto titolo.

I metodi per valutare la forza dei sieri e la quantità di antigeni in base alla loro diluizione massima, che dà ancora P. visibile con un antigene o antisiero standard, e metodi con proporzioni ottimali possono essere attribuiti a metodi semiquantitativi di P..

Quando si titolano i sieri secondo la diluizione limite, è necessario selezionare una quantità di antigene tale da non cadere nella zona di ritardo. Pertanto, viene determinata preliminarmente la più piccola diluizione dell'antigene del test, alla quale avviene una reazione con un siero noto positivo. Questa diluizione di lavoro (dose) dell'antigene viene utilizzata per determinare la diluizione limite (titolo) dei sieri del test. La titolazione comparativa dell'antigene con il metodo delle diluizioni limitanti può essere effettuata senza selezione preliminare della dose di lavoro di siero se contiene anticorpi di tipo precipitante ma non flocculante.

Il metodo delle proporzioni ottimali si basa sulla determinazione del punto di equivalenza sierolo. sistemi sull'E iniziale e su quella supervisione che un punto di equivalenza in ciascun sierolo. Il sistema si verifica con un certo rapporto tra anticorpo e antigene. Pertanto, quando si titola il siero, dopo aver determinato la quantità di antigene standard corrispondente al punto di equivalenza mediante la velocità di P., è possibile esprimere la sua attività in qualsiasi biolo condizionale. unità, se nella titolazione preliminare con siero di concentrazione nota si stabilisce quante delle sue unità sono equivalenti all'antigene standard. Calcoli simili vengono eseguiti quando si titola l'antigene con siero standard. Il metodo delle proporzioni ottimali può essere eseguito nella variante a proposta da Dean e Webb (H. Dean, R. Webb, 1928), con volume di siero costante e diluizioni crescenti dell'antigene, e nella variante ß proposta da G. Ramon (1922), - con un volume costante di antigene e diluizioni sieriche crescenti.

Il metodo quantitativo per determinare gli anticorpi in unità di peso, proposto nel 1933 da M. Heidelberger e F. E. Kendall, si basa sul fatto che nella zona di equivalenza quasi l'intero antigene e tutti gli anticorpi precipitano dalla soluzione. Dopo aver determinato qualsiasi chimica. utilizzando il metodo della quantità di precipitato proteico a questo punto e sottraendo da esso la quantità di antigene aggiunto al campione, viene calcolata la quantità di proteine ​​nel precipitato, che è rappresentata dalla proporzione di anticorpi.

Secondo P. con uno qualsiasi dei metodi descritti è necessario lavorare con soluzioni ben centrifugate di antigeni e sieri. La reazione deve essere accompagnata dal controllo: siero immune + soluzione isotonica di cloruro di sodio, siero normale + antigene, siero eterologo + antigene. La possibilità di contaminazione batterica dovrebbe essere prevenuta eseguendo P. in condizioni sterili o utilizzando conservanti come mertiolato, sodio ammide. La reazione è effettuata a fiziol. concentrazione di sale (soluzione di cloruro di sodio 0,15 M), nell'intervallo di pH compreso tra 6,5 ​​e 8,0.

La determinazione dei singoli antigeni mescolati con altre sostanze è possibile nella reazione di P. solo quando si utilizzano sieri monospecifici. Gli anticorpi specifici nei sieri possono essere identificati se P. viene effettuato con antigeni individuali. Per l'analisi, la caratteristica e il confronto dei sistemi multicomponente antigene - un anticorpo senza il loro frazionamento preliminare si utilizzano i metodi basati sulla realizzazione di P. in gel, in particolare un metodo di doppia immunodiffusione attraverso Ouchterlon (vedi Immunodiffusione).

P. è una reazione a due fasi. Le fasi della reazione differiscono nel meccanismo e nella velocità (vedi Reazione antigene-anticorpo). Va tenuto presente che la seconda fase della reazione - la formazione vera e propria del precipitato - è influenzata da una serie di fattori non specifici: la concentrazione di sali e ioni idrogeno nella soluzione, la temperatura e il volume dei reagenti . All'aumentare della concentrazione di sali sopra i valori di fiziol (0,15 M) la quantità del precipitato formato diminuisce. Nella soluzione al 15% di cloruro di sodio, i precipitati formati dagli antigeni polisaccaridici si dissociano. Variazione della concentrazione degli ioni idrogeno nel fiziol. L'intervallo di pH (da 6,5 ​​a 8,0) non influenza sensibilmente la formazione del precipitato. Quando il pH della soluzione diminuisce a 5,0 o aumenta a 9,0, la quantità di precipitato formato diminuisce in modo significativo e a pH inferiore a 3,0 e superiore a 11,0 i precipitati formati in precedenza si dissociano. La proprietà dei precipitati di dissociarsi in soluzioni saline forti e a valori di pH estremi è la base per metodi per isolare anticorpi e antigeni puri da precipitati specifici. Gli agenti dissocianti più comunemente utilizzati sono soluzioni concentrate di sali neutri, diluiti ed alcali, soluzioni concentrate di ammidi, polianioni.

Precipitazioni forensi

In medicina legale, il P. viene utilizzato per differenziare il sangue umano e quello animale (vedi Sangue). La più diffusa è la precipitazione ad anello, ma non è adatta per lo studio di soluzioni torbide dell'antigene ed è soggetta a effetti aspecifici di contaminazione dell'oggetto in esame. P. in gel di agar è privato di queste mancanze, comunque esige periodi lunghi di supervisione e è meno sensibile. Introdurre nella pratica l'elettroprecipitazione, o contro immunoelettroforesi (vedi), combinando i vantaggi di P. in agar con un'elevata sensibilità e velocità della reazione. Tutte le varianti di P. vengono effettuate con sieri immunitari (vedi), proteine ​​precipitanti umane, di cane, di cavallo, ecc.. Essi devono essere attivi e specifici, cioè provocare P. di un antigene omologo (ad esempio, il corrispondente sangue normale siero di una persona o di un animale) e non formare un precipitato con antigeni eterologhi (estranei).

Gli estratti vengono preparati dalle macchie di sangue studiate e diluiti alla concentrazione proteica richiesta. Per P. in agar è possibile prelevare ritagli (estratti) da macchie ed effettuare una reazione con diversi sieri precipitanti. Allo stesso tempo vengono testate le aree di controllo dell'oggetto, portatrici di macchie che non dovrebbero causare P. Se il risultato è positivo con una macchia di sangue e siero precipitante, si giunge ad esempio al tipo di sangue. il sangue di una persona, un cane, ecc. In questo caso, è impossibile determinare con precisione l'origine del sangue se appartiene ad animali strettamente imparentati (ad esempio, il sangue di un cane o di un lupo). Un risultato negativo in presenza di proteine ​​nell'estratto indica che il sangue appartiene a un animale, la proteina to-rogo non viene rilevata utilizzando il consueto set di sieri precipitanti. Se nell'estratto non viene trovata alcuna proteina, viene preso in considerazione solo un risultato positivo, poiché l'assenza di precipitato può essere spiegata da una quantità insufficiente di proteine ​​nell'estratto.

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I. A. Tarkhanova; V. I. Charny (corte.).