Metodi per la determinazione qualitativa e quantitativa delle vitamine. Biochimica della vitamina C e metodi per la sua determinazione quantitativa

GOST R54635-2011

Gruppo H59

STANDARD NAZIONALE DELLA FEDERAZIONE RUSSA

PRODOTTI ALIMENTARI FUNZIONALI

Metodo per la determinazione della vitamina A

prodotti alimentari funzionali. Metodo di determinazione della vitamina A

OKS 67.050
OKSTU9109

Data di introduzione 2013-01-01

Prefazione

Gli obiettivi e i principi della standardizzazione nella Federazione Russa sono stabiliti dalla legge federale N 184-FZ "Sulla regolamentazione tecnica" del 27 dicembre 2002 e dalle regole per l'applicazione delle norme nazionali della Federazione Russa - GOST R 1.0-2004 " Standardizzazione nella Federazione Russa. Disposizioni fondamentali"

A proposito della norma

1 SVILUPPATO dall'Istituto di ricerca sulla nutrizione dell'Accademia russa delle scienze mediche

2 INTRODOTTO dal Comitato Tecnico per la Normazione TC 36 “Alimenti Funzionali”

3 APPROVATO ED ATTIVO con ordinanza dell'Agenzia federale per la regolamentazione tecnica e la metrologia del 12 dicembre 2011 N 784-st

4 INTRODOTTO PER LA PRIMA VOLTA

Le informazioni sulle modifiche a questo standard sono pubblicate nell'indice informativo pubblicato annualmente "Standard nazionali" e il testo delle modifiche e degli emendamenti - negli indici informativi pubblicati mensilmente "Standard nazionali". In caso di revisione (sostituzione) o cancellazione di questo standard, un avviso corrispondente sarà pubblicato nell'indice informativo pubblicato mensilmente "Norme nazionali". Informazioni, notifiche e testi pertinenti sono anche pubblicati nel sistema di informazione pubblica - sul sito Web ufficiale dell'Agenzia federale per la regolamentazione tecnica e la metrologia su Internet

1 area di utilizzo

Questo standard si applica agli alimenti funzionali e stabilisce un metodo per determinare la frazione di massa della vitamina A sotto forma di retinolo, retinolo acetato, retinolo palmitato utilizzando la cromatografia liquida ad alta prestazione (di seguito denominata HPLC).

L'intervallo di misurazione della frazione di massa della vitamina A va da 0,5 a 10,0 ppm.

NOTA Questo standard può essere applicato ai prodotti alimentari soggetti all'intervallo di misurazione.

2 Riferimenti normativi

Questo standard utilizza riferimenti normativi ai seguenti standard:

GOST R 8.563-2009 Sistema statale per garantire l'uniformità delle misurazioni. Tecniche (metodi) di misurazione

GOST R 12.1.019-2009 Sistema di standard di sicurezza sul lavoro. Sicurezza elettrica. Requisiti generali e nomenclatura dei tipi di protezione

GOST R ISO 5725-6-2002 Accuratezza (correttezza e precisione) dei metodi e dei risultati di misurazione. Parte 6. Utilizzo dei valori di precisione nella pratica

GOST R ISO/IEC 17025-2006 * Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e taratura
________________
GOST ISO/IEC 17025-2009

GOST R 51652-2000 Alcool etilico rettificato da materie prime alimentari. Specifiche

GOST R 52062-2003 Oli vegetali. Regole di accettazione e metodi di campionamento

GOST R 52179-2003 Margarine, grassi per l'industria della cucina, dolciaria, della panificazione e lattiero-casearia. Regole di accettazione e metodi di controllo

GOST R 52349-2005 Prodotti alimentari. Prodotti alimentari funzionali. Termini e definizioni

GOST R 53228-2008 Scale di azione non automatica. Parte 1. Requisiti metrologici e tecnici. Test

GOST 12.1.004-91 Sistema di standard di sicurezza sul lavoro. Sicurezza antincendio. Requisiti generali

GOST 12.1.005-88 Sistema di norme sulla sicurezza del lavoro. Requisiti sanitari e igienici generali per l'aria dell'area di lavoro

GOST 12.1.007-76 Sistema di standard di sicurezza sul lavoro. Sostanze nocive. Classificazione e requisiti generali di sicurezza

GOST 427-75 Misurazione dei righelli metallici. Specifiche

GOST 1770-74 (ISO 1042-83, ISO 4788-80) Misurazione della vetreria da laboratorio. Cilindri, bicchieri, beute, provette. Specifiche generali

Reagenti GOST 4166-76. Solfato di sodio. Specifiche

Reagenti GOST 4517-87. Metodi per la preparazione dei reagenti ausiliari e delle soluzioni utilizzate nell'analisi

GOST 6709-72 Acqua distillata. Specifiche

GOST 9293-74 Azoto gassoso e liquido. Specifiche

GOST 12026-76 Carta da filtro da laboratorio. Specifiche

GOST 13496.0-80 * Mangimi composti, materie prime. Metodi di campionamento
________________
* Il documento non è valido sul territorio della Federazione Russa. È valida la norma GOST R ISO 6497-2011, di seguito nel testo. - Nota del produttore del database.

GOST 14919-83 Stufe elettriche domestiche, stufe e forni elettrici. Specifiche generali

GOST 16317-87 Apparecchi elettrici di refrigerazione domestici. Specifiche generali

GOST 18300-87 Alcool etilico tecnico rettificato. Specifiche

GOST 19627-74 Idrochinone (paradiossibenzene). Specifiche

Reagenti GOST 24363-80. idrossido di potassio. Specifiche

GOST 25336-82 Vetreria e attrezzature da laboratorio. Tipi, parametri di base e dimensioni

GOST 26809-86 Latte e prodotti lattiero-caseari. Regole di accettazione, metodi di campionamento e preparazione dei campioni di fognature

Reagenti GOST 27025-86. Linee guida generali per i test

GOST 28498-90 Termometri in vetro liquido. Requisiti tecnici generali. Metodi di prova

GOST 29227-91 (ISO 835-1-81) Vetreria da laboratorio. Pipette graduate. Parte 1. Requisiti generali

Nota - Quando si utilizza questo standard, è consigliabile verificare la validità degli standard di riferimento nel sistema informativo pubblico - sul sito Web ufficiale dell'Agenzia federale per la regolamentazione tecnica e la metrologia su Internet o secondo l'indice informativo pubblicato annualmente "Standard nazionali ", che è stato pubblicato a partire dal 1 gennaio dell'anno in corso , e secondo i corrispondenti cartelli informativi pubblicati mensilmente pubblicati nell'anno in corso. Se lo standard di riferimento viene sostituito (modificato), quando si utilizza questo standard, dovresti essere guidato dallo standard sostitutivo (modificato). Se la norma di riferimento viene cancellata senza sostituzione, la disposizione in cui è dato il riferimento ad essa si applica nella misura in cui tale riferimento non è influenzato.

3 Termini e definizioni

Questo standard utilizza i termini secondo GOST R 52349, nonché il seguente termine con la definizione corrispondente:

4 Essenza del metodo

La determinazione della vitamina A nell'estratto ottenuto dal campione analizzato viene effettuata mediante separazione HPLC seguita da rilevazione fotometrica o fluorimetrica. Se necessario, l'estratto viene ottenuto dopo idrolisi alcalina del campione analizzato.

L'analisi quantitativa viene effettuata mediante il metodo di uno standard esterno utilizzando l'area o l'altezza dei picchi di retinolo, retinolo acetato, retinolo palmitato.

5 Requisiti di sicurezza

5.1 Condizioni per un lavoro sicuro

Quando si eseguono i test, è necessario rispettare i requisiti di sicurezza antincendio stabiliti da GOST 12.1.004, sicurezza elettrica - GOST R 12.1.019, precauzioni di sicurezza quando si lavora con reagenti - GOST 12.1.007, nonché i requisiti stabiliti in la documentazione tecnica per lo spettrofotometro, il cromatografo e altri dispositivi e apparecchiature.

Il locale in cui vengono effettuate le prove deve essere dotato di ventilazione di mandata e di scarico. Il controllo sul contenuto di sostanze nocive nell'aria dell'area di lavoro deve essere effettuato in conformità con i requisiti di GOST 12.1.005.

Quando lavori con le bombole di gas, devi essere guidato.

5.2 Requisiti di qualificazione dell'operatore

Sono autorizzate a eseguire test ed elaborare i risultati persone con formazione professionale superiore o secondaria specializzata: chimico, ingegnere chimico, tecnico, assistente di laboratorio, con esperienza in un laboratorio chimico. Il primo utilizzo del metodo in laboratorio deve essere effettuato sotto la supervisione di un tecnico HPLC qualificato.

6 Condizioni di prova

6.1 Condizioni generali

I test vengono eseguiti in normali condizioni di laboratorio: temperatura ambiente - (25±5) °C; umidità relativa - (65±15)%; Frequenza CA - (50±5) Hz; tensione di rete - (220±10) V.

Durante la preparazione e la conservazione delle soluzioni, è necessario seguire i requisiti di GOST 27025, GOST 4517.

Per prevenire la distruzione della vitamina A, l'analisi del materiale di prova e degli standard viene effettuata in presenza di un antiossidante (acido ascorbico, idrochinone, pirogallolo), proteggendo i campioni dalla luce solare diretta.

6.2 Condizioni per le misurazioni fotometriche

Le condizioni per le misurazioni fotometriche sono riportate nella Tabella 1.

Tabella 1 - Condizioni per le misurazioni fotometriche


Vitamina A	Solvente	Lunghezza d'onda, nm	Coefficiente di assorbimento specifico
Retinolo
Acetato di retinolo
Palmitato di retinolo	2-propanolo

6.3 Condizioni per l'analisi cromatografica

Temperatura della colonna cromatografica: 25 °C o temperatura ambiente.

Portata della fase mobile: 0,7 cm/min (valore indicativo).

Il volume del campione iniettato: 50 10 cm.

Fase mobile: miscela di acetonitrile, alcool metilico, cloruro di metilene in rapporto in volume 50:45:5.

Il controllo delle condizioni ottimali per la separazione cromatografica viene effettuato mediante analisi cromatografica di una soluzione mista di retinolo, retinolo acetato, retinolo palmitato con una concentrazione in massa di ciascuna sostanza di almeno 0,4 µg/cm. Questa soluzione mista viene preparata da soluzioni madre di retinolo, retinolo acetato, retinolo palmitato analogamente alla procedura per la preparazione delle soluzioni di lavoro secondo 8.1.2. L'efficienza della separazione cromatografica è considerata soddisfacente se il coefficiente di separazione dei picchi adiacenti di retinolo, retinolo acetato, retinolo palmitato è almeno 1,3. Altrimenti, per ottenere l'efficienza di separazione richiesta, la portata della fase mobile viene selezionata sperimentalmente o vengono testate altre colonne.

7 Strumenti di misura, dispositivi ausiliari, reagenti e materiali

7.1 Per determinare il contenuto della frazione di massa della vitamina A, vengono utilizzati i seguenti strumenti di misurazione, apparecchiature ausiliarie e materiali:

- bilance conformi a GOST R 53228, che forniscono precisione di pesatura con i limiti dell'errore assoluto consentito di ± 0,1 mg;

- uno spettrofotometro con un intervallo spettrale compreso tra 190 e 1100 nm, l'errore principale nelle misurazioni della trasmittanza non è superiore all'1%;

- cuvette in quarzo con cammino ottico di 1 cm;

- cromatografo liquido ad alta prestazione, comprendente i seguenti elementi: pompa; dispositivo di campionamento; rilevatore fluorimetrico (lunghezze d'onda, nm: eccitazione - 325 nm, emissione - 470 nm) o rilevatore spettrofotometrico (lunghezza d'onda di rilevamento - 325 nm) con un livello di rumore non superiore a 10 unità di densità ottica e un relativo errore di misurazione non superiore a 10 %; una colonna analitica per HPLC del diametro di 0,30-0,46 cm, della lunghezza di 10-25 cm, riempita con gel di silice ottadecile con granulometria di 5 μm; un dispositivo di registrazione - un integratore o un registratore che consente di misurare l'area (o l'altezza) di un picco con un errore non superiore all'1%; Software per l'elaborazione dei risultati di misurazione ottenuti;

- filtri per filtrare la fase mobile e le soluzioni analizzate (ad esempio, con una dimensione dei pori di 0,45 μm);

- microsiringa tipo "Hamilton" con una capacità di 0,1 cm3 per l'introduzione di campioni in un cromatografo liquido;

- pipette graduate 1(2.3)-1(2)-1-0.5(1.2.5.10.25) conformi a GOST 29227 o distributori automatici con volumi di dosaggio simili o variabili con un errore di dosaggio relativo non superiore a ± 1%;

- cilindri 1-50(100.250)-1(2) secondo GOST 1770;

- matracci tarati 2-50(100,250,500,1000)-2 secondo GOST 1770;

- tubi di misura con tappi smerigliati P-2-5(10.15.20.25)-0.1(0.2)XC secondo GOST 1770;

- vetri В(Н)-1-50(100,150,250)ТХС secondo GOST 25336;

- palloni a fondo tondo K-1-100(250.500)-29/32TS secondo GOST 25336;

- imbuti V-36(56)-80XC, V-75-110(140)XC, V-100-150XC secondo GOST 25336;

- un righello di metallo con un prezzo di divisione di 1 mm secondo GOST 427;

- un agitatore per palloni e provette con una gamma di frequenza di vibrazioni della piattaforma di 100-150 vibrazioni al minuto;

- centrifuga, fornendo 4-6 mila giri al minuto;

- un bagnomaria con regolatore di riscaldamento, mantenendo la temperatura da 40° a 100°C;

- un bagno da laboratorio ad ultrasuoni con un volume di lavoro di almeno 2 dm3;

- evaporatore rotante con range di pressione di esercizio da 7 mm Hg. fino a 760 mmHg (da 9 10 Pa a 10 10 Pa) o pompa a getto d'acqua secondo GOST 25336;

- frigoriferi da laboratorio in vetro secondo GOST 25336;

- termometro liquido da laboratorio con intervallo di temperatura da 0 °C a 100 °C, con divisione della scala di 1 °C secondo GOST 28498;

- una bombola con azoto gassoso conforme a GOST 9293, grado di purezza speciale e secondo;

- carta da filtro da laboratorio secondo GOST 12026;

- stufa elettrica di tipo chiuso secondo GOST 14919;

- mulino elettrico da laboratorio;

- frigorifero domestico secondo GOST 16317.

7.2 Quando si eseguono misurazioni, vengono utilizzati i seguenti reagenti e materiali:

- alcol etilico assoluto () con una frazione di massa della sostanza principale pari ad almeno il 99,9%;

- alcol etilico rettificato () con una frazione di massa della sostanza principale pari ad almeno il 96% o secondo GOST R 51652, GOST 18300;

- alcol metilico () con una frazione di massa della sostanza principale pari ad almeno il 99,9%;

- la frazione di massa dell'acetonitrile () della sostanza principale non è inferiore al 99,8%;

- la frazione di massa del cloruro di metilene () della sostanza principale non è inferiore al 99,8%;

- la frazione di massa n-esano () della sostanza principale non è inferiore al 99%;

- la frazione di massa dell'etilacetano () della sostanza principale non è inferiore al 99% o secondo GOST 8981;

- la frazione di massa del propanolo-2 () della sostanza principale non è inferiore al 99%;

- etere di petrolio, distillato alla temperatura di (50 ± 10) °C, purificato dai perossidi;

- etere etilico, purificato dai perossidi, contenente 0,1% pirogallolo, secondo;

- idrossido di potassio (KOH) secondo GOST 24363, chimicamente puro o grado analitico, soluzione KOH, frazione in massa 50%;

- la frazione di massa anidra del solfato di sodio () della sostanza principale non è inferiore al 99,5% o secondo GOST 4166, chimicamente pura;

- acqua distillata secondo GOST 6709;

- acido ascorbico () secondo o, chimicamente puro;

- idrochinone () con una frazione di massa della sostanza principale pari ad almeno il 99% o secondo GOST 19627;

- la frazione di massa del pirogallolo () della sostanza principale non è inferiore al 99%;

- la frazione di massa del butilidrossitoluene () della sostanza principale non è inferiore al 99%;

- retinolo ()=286,5 g/mol, la frazione in massa della sostanza principale non è inferiore al 90%;

- retinolo acetato () = 328,5 g / mol, la frazione di massa della sostanza principale non è inferiore al 90% o ;

- retinolo palmitato () = 524,9 g / mol, la frazione in massa della sostanza principale non è inferiore al 90% o .

7.3 È consentito utilizzare altri strumenti di misurazione, apparecchiature ausiliarie che non siano inferiori a quanto sopra in termini di caratteristiche metrologiche e tecniche e forniscano la necessaria precisione di misurazione, nonché reagenti e materiali di qualità non peggiore di quanto sopra.

8 Preparazione per effettuare le misurazioni

8.1 Preparazione delle soluzioni

8.1.1 Soluzioni standard di base

Sciogliere circa 50 mg di retinolo (o retinolo acetato, o retinolo palmitato) in 50 ml di alcool etilico assoluto. La concentrazione in massa di retinolo (o retinolo acetato o retinolo palmitato) in soluzione è di circa 1,0 mg/cm. Successivamente, 2 ml di una soluzione di retinolo (o retinolo acetato, o retinolo palmitato) vengono posti con una pipetta in un matraccio tarato da 50 ml e portati a volume con alcool etilico assoluto. La concentrazione in massa dei composti nelle soluzioni standard basiche ottenute è di circa 40 µg/cm.

8.1.2 Soluzioni di calibrazione

Dalle principali soluzioni standard, vengono preparate almeno quattro soluzioni di calibrazione di retinolo (o acetato di retinolo, o palmitato di retinolo) nell'intervallo di concentrazione in massa di 0,4-4,0 µg/cm mediante diluizione esatta delle principali soluzioni standard con alcol etilico assoluto in un matraccio tarato con una capacità di 50 cm3.

La determinazione della concentrazione in massa di retinolo (o acetato di retinolo o palmitato di retinolo) (μg/cm) viene effettuata dopo aver misurato la densità ottica delle soluzioni di calibrazione in una cuvetta di quarzo con uno strato assorbente dello spessore di 1 cm su uno spettrofotometro alla lunghezza d'onda ottimale ed è calcolata dalla formula

dov'è il valore della densità ottica della soluzione di calibrazione;

- il valore della densità ottica della soluzione di calibrazione in concentrazione di massa di etanolo assoluto o 2-propanolo di 1 g in 100 cm con uno spessore dello strato assorbente di 1 cm, riportato nella tabella 1;

10 - fattore di conversione;

- coefficiente che tiene conto dell'assorbimento dei componenti correlati durante la misurazione, calcolato dalla formula

dov'è l'area del picco della sostanza standard durante l'analisi HPLC, mAU·s (AU·s);

- la somma delle aree dei picchi dei componenti associati durante l'analisi HPLC della sostanza standard, mAU·s (AU·s).

Tutte le soluzioni sono accuratamente protette dalle radiazioni ultraviolette durante la preparazione e l'analisi. Le soluzioni di retinolo vengono conservate a temperature inferiori a 4 °C per 2 mesi. Per le misurazioni vengono utilizzate soluzioni appena preparate di retinolo acetato o retinolo palmitato per 2-3 ore a temperatura ambiente.

8.2 Campionamento e preparazione

8.2.1 Il campionamento viene effettuato secondo GOST 13496.0, GOST 26809, GOST R 52062, GOST R 52179.

8.2.2 Le particelle grossolane di un campione medio isolate mediante quartizzazione da un campione di laboratorio vengono macinate utilizzando un'attrezzatura adeguata (ad esempio un mulino da laboratorio) in uno stato tale che tutto il prodotto passa attraverso un setaccio con fori di 1 mm di diametro. Il campione macinato viene accuratamente miscelato.

I campioni analizzati vengono omogeneizzati, evitando l'esposizione a temperature elevate.

8.2.3 Alimenti a base di grassi con un contenuto di acqua pari o inferiore all'1%, arricchiti con retinolo acetato o retinolo palmitato

2-5 g del campione analizzato vengono trasferiti in un matraccio tarato della capacità di 25 ml, sciolti in 10-15 ml di n-esano, utilizzando un bagno ad ultrasuoni per accelerare la dissoluzione. La soluzione è stata portata a volume con n-esano. Se necessario, la soluzione può essere utilizzata per la successiva diluizione con n-esano. Quindi un'aliquota della soluzione esana è stata evaporata in una corrente di azoto, ed il residuo secco è stato ridisciolto nell'eluente.

8.2.4 Prodotti alimentari a base di grassi con non più del 20% di acqua, in massa, arricchiti con retinolo acetato o retinolo palmitato

2-5 g del campione analizzato vengono sciolti sotto vigorosa agitazione in 10-15 ml di n-esano, utilizzando un bagno ad ultrasuoni per accelerare la dissoluzione. Rimuovere l'acqua in eccesso aggiungendo solfato di sodio anidro. Il contenuto del pallone viene filtrato su filtro di carta per separare il precipitato insolubile. Il pallone viene lavato due volte con 5 ml di n-esano. Si raccolgono i filtrati in un matraccio tarato da 25 ml e si porta a volume la soluzione con n-esano. Quindi un'aliquota della soluzione esana è stata evaporata in una corrente di azoto, ed il residuo secco è stato ridisciolto nell'eluente.

8.2.5 Altri alimenti arricchiti con retinolo acetato o retinolo palmitato

Per effettuare l'idrolisi alcalina, 1-30 g del campione analizzato di materiale secco o liquido vengono posti in un pallone a fondo tondo con una capacità di 100-500 ml entro 5 minuti. Aggiungere quindi 50-150 cm 3 di alcool etilico rettificato (o alcool metilico), 0,2-1,0 g di un antiossidante (acido ascorbico, idrochinone, butilidrossitoluene), 4-40 cm 3 di una soluzione di idrossido di potassio al 50% e scaldare per 15- 45 minuti a bagnomaria a riflusso ad una temperatura di 80 °C-100 °C.

I rapporti consigliati tra materiale di prova e reagenti sono riportati nella Tabella 2.

Tabella 2 – Rapporti consigliati tra materiale di prova e reagenti


Frazione di massa della vitamina A, milioni	Campione del materiale testato, g	Il volume di etanolo, cm	Volume della soluzione di KOH al 50%, cm
Da 0.1-1.0 compreso
St. 1.0-5.0 incl.
St. 5.0-10.0 incl.

Quando l'idrolisi alcalina viene effettuata a temperatura ambiente per almeno 16 ore, vengono utilizzati i rapporti di materiale e reagenti sopra indicati.

Se, dopo il raffreddamento, sulla superficie della miscela rimane uno strato di olio o grasso, il volume della soluzione KOH aggiunta e il tempo di idrolisi alcalina vengono aumentati.

Una volta completata l'idrolisi, il contenuto del pallone viene rapidamente raffreddato a (20 ± 5) °C e trasferito quantitativamente in un imbuto separatore. Si risciacqua il pallone con acqua, il cui volume è pari al volume di alcol etilico (o metilico) aggiunto, e si versa l'acqua nello stesso imbuto. La vitamina A viene estratta con etere etilico (o di petrolio), n-esano, n-esano con l'aggiunta di etere dietilico (o di petrolio) in rapporto in volume 1:1 per due minuti. Per tenere conto della possibile estrazione incompleta della vitamina A, dovrebbe essere utilizzato il metodo di aggiunta standard.

L'estrazione viene ripetuta tre o quattro volte con porzioni estraenti di 50-100 cm.

Per eliminare l'acqua, l'estratto viene filtrato su un filtro con 2-5 g di solfato di sodio anidro. Successivamente, l'estratto viene evaporato a secchezza utilizzando un evaporatore rotante ad una temperatura non superiore a 50 °C e quindi ridisciolto nell'eluente. Se necessario, la soluzione può essere utilizzata per la successiva diluizione.

La soluzione ottenuta secondo 8.2.3 (8.2.4, 8.2.5) viene analizzata mediante HPLC. La massa del campione analizzato e il volume del solvente sono selezionati in modo tale che la concentrazione degli analiti nella soluzione analizzata sia compresa tra 0,4 e 4,0 µg/cm.

8.3 Preparazione del cromatografo liquido

La preparazione del cromatografo liquido per il funzionamento viene eseguita in conformità con il manuale di istruzioni dell'apparecchiatura. Prima di iniziare il lavoro, la colonna viene lavata con l'eluente.

8.4 Costruire una curva di calibrazione

Le procedure per costruire la dipendenza dalla calibrazione vengono eseguite in conformità con il manuale operativo dell'apparecchiatura. Effettuare un'analisi cromatografica di tutte le soluzioni di calibrazione preparate secondo 8.1.2.

Il grafico di calibrazione è costruito nelle coordinate "segnale analitico" - "concentrazione di massa di vitamina nella soluzione di calibrazione, µg/cm". Per ciascuna soluzione di calibrazione analizzata vengono effettuate due misurazioni parallele e viene ricavato il valore medio aritmetico. La differenza tra i valori misurati dei segnali analitici e i valori del tempo di ritenzione non deve superare il 5% dei valori medi. I segmenti lineari della curva di calibrazione devono corrispondere all'intero intervallo di concentrazioni di massa determinate di vitamina A.

Il coefficiente della curva di calibrazione, μg/cm/(mAU s) o μg/cm/(AU s) è determinato come media aritmetica dei coefficienti calcolati dalla formula

dove è la concentrazione in massa delle sostanze standard nella esima soluzione di calibrazione, µg/cm;

- area (altezza) del segnale analitico nell'analisi della soluzione di calibrazione, mAU s (AU s) o altezza del picco, mm.

La correttezza della costruzione della dipendenza dalla calibrazione è controllata dal valore di un'approssimazione affidabile di 0,997.

La calibrazione viene eseguita nei seguenti casi: nella fase di padronanza del metodo, quando cambiano le condizioni dell'analisi cromatografica o quando i risultati del controllo operativo o dell'audit interno non soddisfano i requisiti metrologici.

9 Effettuare le misurazioni

Volumi uguali di soluzioni di test e di calibrazione vengono iniettati in sequenza nella colonna del cromatografo. Come soluzione di calibrazione viene selezionata una soluzione la cui altezza del picco è la meno diversa dall'altezza del picco della soluzione di prova. La concentrazione di vitamina A () nella soluzione utilizzata per la calibrazione è specificata il giorno del suo utilizzo secondo 8.1.2.

Per identificare i picchi, confrontare il tempo di ritenzione del retinolo (o acetato di retinolo o palmitato di retinolo) della soluzione di prova e della soluzione standard e aggiungere anche una soluzione standard con un contenuto simile di vitamina A alla soluzione di prova.

10 Elaborazione e presentazione dei risultati

La frazione di massa della vitamina A, milioni, è calcolata con le formule:

dove è il coefficiente della curva di calibrazione secondo 8.4;

- volume di diluizione, cm;

- massa del campione analizzato, g.

Utilizzando una soluzione di calibrazione

dove è la concentrazione in massa della soluzione di calibrazione, µg/cm;

- volume di diluizione, cm;

- media aritmetica dei risultati della misurazione dell'area (altezza) del picco del componente analizzato per due analisi cromatografiche parallele della soluzione in esame, mAU·s (AU·s) o altezza del picco, mm;

- massa del campione analizzato, g;

- media aritmetica dei risultati delle misurazioni dell'area (altezza) del picco del componente analizzato per due analisi cromatografiche parallele della soluzione di calibrazione, mAU·s (AU·s) o altezza del picco, mm.

Il risultato viene calcolato alla terza cifra decimale e arrotondato alla seconda cifra decimale.

Quando si analizza ciascun campione, vengono eseguite due determinazioni parallele, iniziando con il prelievo di un campione del campione da analizzare.

La discrepanza tra i risultati di due misurazioni replicate (come percentuale del valore medio), eseguite da un operatore utilizzando reagenti e apparecchiature identiche e nel più breve periodo di tempo possibile, non deve superare (il limite di ripetibilità è riportato nella tabella 3 ) con un livello di confidenza del 95%.

Se questa condizione è soddisfatta, come risultato finale del test viene preso il valore della media aritmetica.

I limiti dell'errore relativo nel determinare la frazione di massa della vitamina A (), come percentuale del risultato del test e con un livello di confidenza del 95% non devono superare i valori specificati nella Tabella 3.

Il risultato della determinazione della vitamina A è presentato nella seguente forma:

Milioni al 95%, (6)

dove è la media aritmetica dei risultati di due determinazioni parallele, milioni;

- il valore del limite dell'errore assoluto delle definizioni, milioni, calcolato dalla formula

I risultati del test sono registrati nel protocollo, che indica:

- un riferimento a tale norma;

- tipologia, origine e nome del campione;

- modalità e data del campionamento;

- data di ricevimento e analisi del campione;

- risultati della ricerca;

- ragioni degli scostamenti nella procedura di determinazione dalle condizioni stabilite.

Introduzione……………………………2

1. Panoramica generale dei metodi per la determinazione delle vitamine…………………3

2. Metodi cromatografici per la determinazione delle vitamine…………5

3. Metodi elettrochimici per la determinazione delle vitamine…………10

4. Metodo voltammetrico di stripping per la determinazione

vitamine idrosolubili B 1 B 2 negli alimenti………..13

Conclusione…………………...................................18

introduzione

Attualmente sul mercato è apparso un numero enorme di prodotti alimentari arricchiti per l'uomo e l'alimentazione animale, che sono miscele secche multicomponenti. La gamma di tali prodotti è presentata abbastanza ampiamente. Si tratta innanzitutto di integratori alimentari biologicamente attivi, premiscele, mangimi composti per animali e uccelli, preparati multivitaminici. Il criterio per la qualità di tali prodotti può essere la loro analisi del contenuto di vitamine e, soprattutto, di quelle vitali come le vitamine idrosolubili e liposolubili, la cui quantità è regolata da documenti normativi e standard di qualità sanitaria.

Per determinare le vitamine vengono utilizzati vari metodi. I metodi ottici di analisi ampiamente utilizzati sono laboriosi, richiedono molto tempo e richiedono reagenti costosi; l’uso dei metodi cromatografici è complicato dall’uso di apparecchiature costose. Ogni anno l'assortimento si amplia e aumenta la produzione di prodotti alimentari, la ricetta delle pappe viene migliorata. Ciò, a sua volta, pone maggiori esigenze sul controllo della qualità dei prodotti e sul miglioramento dei metodi per la determinazione delle vitamine. I requisiti biomedici e gli standard sanitari per la qualità delle materie prime alimentari e dei prodotti alimentari caratterizzano il valore nutrizionale della maggior parte dei tipi e gruppi di alimenti per l'infanzia per vari scopi.

1. Panoramica generale dei metodi per determinare le vitamine

Quasi tutte le vitamine vengono facilmente ossidate, isomerizzate e distrutte sotto l'influenza di alte temperature, luce, ossigeno atmosferico, umidità e altri fattori.

Tra i metodi esistenti per determinare la vitamina C (acido ascorbico), il metodo più utilizzato è la titolazione visiva e potenziometrica con una soluzione di 2,6-diclorofenolindofenolo secondo GOST 24556-81, basata sulle proprietà riducenti dell'acido ascorbico e sulla sua capacità ridurre il 2,6-DCPIP. Il colore blu scuro di questo indicatore diventa incolore quando viene aggiunto acido ascorbico. La preparazione di un estratto del prodotto in esame è importante. Il miglior estraente è una soluzione al 6% di acido metafosforico, che inattiva l'ascorbato ossidasi e fa precipitare le proteine.

Il carotene nelle materie prime vegetali, nei concentrati e nelle bevande analcoliche è controllato con il metodo fisico-chimico secondo GOST 8756.22-80. Il metodo si basa sulla determinazione fotometrica della frazione massica di carotene in una soluzione ottenuta nel processo di estrazione da prodotti con un solvente organico. La soluzione viene preliminarmente purificata dalle sostanze coloranti associate mediante cromatografia su colonna. Il carotene si dissolve facilmente nei solventi organici (etere, benzina, ecc.) E conferisce loro un colore giallo. Per la determinazione quantitativa del carotene si utilizza la cromatografia ad adsorbimento su colonne con ossido di alluminio e ossido di magnesio. Tale determinazione dei pigmenti su una colonna dipende dall'attività dell'adsorbente, dalla quantità di pigmenti e dalla presenza di altri componenti nella miscela da separare. Una miscela secca di ossido di alluminio trattiene il carotene, mentre una miscela umida consente ad altri coloranti di passare nella soluzione.

La tiamina si trova principalmente allo stato legato sotto forma di estere difosforico - cocarbossilasi, che è il gruppo attivo di numerosi enzimi. Con l'aiuto dell'idrolisi acida e sotto l'influenza degli enzimi, la tiamina viene rilasciata dallo stato legato. Questo metodo determina la quantità di tiamina. Per calcolare il contenuto di vitamina B1, viene utilizzato il metodo fluorimetrico, utilizzato per determinare la tiamina nei prodotti alimentari. Si basa sulla capacità della tiamina di formare tiocromo in un mezzo alcalino con ferricianuro di calcio, che conferisce un'intensa fluorescenza nell'alcol butilico. L'intensità del processo è controllata sul fluorimetro EF-ZM.

Negli alimenti e nelle bevande la riboflavina è presente allo stato legato, cioè sotto forma di esteri del fosforo associati ad una proteina. Per determinare la quantità di riboflavina nei prodotti, è necessario liberarla dallo stato legato mediante idrolisi acida e trattamento con preparati enzimatici. La vitamina B1 nelle bevande analcoliche viene calcolata utilizzando un metodo chimico per determinare la quantità di forme di riboflavina facilmente idrolizzabili e strettamente legate nei tessuti. Il metodo si basa sulla capacità della riboflavina di fluorescenza prima e dopo la sua riduzione con iposolfito di sodio. Determinazione del contenuto totale di composti fenolici. Per questo viene utilizzato il metodo colorimetrico Folin-Denis, che si basa sulla formazione di complessi blu durante la riduzione dell'acido tungstico sotto l'azione dei polifenoli con un reagente in un mezzo alcalino. I composti fenolici vengono determinati mediante acido clorogenico mediante fotometria di fiamma su uno strumento EKF-2.

2. Metodi cromatografici per la determinazione delle vitamine

Recentemente, il metodo della cromatografia liquida ad alte prestazioni si è sviluppato rapidamente all'estero. Ciò è dovuto, innanzitutto, all'avvento dei cromatografi liquidi di precisione e al miglioramento delle tecniche di analisi. L'uso diffuso del metodo HPLC nella determinazione delle vitamine si riflette anche nel numero di pubblicazioni. Ad oggi, più della metà di tutti i lavori pubblicati sull'analisi delle vitamine idrosolubili e liposolubili sono dedicati all'uso di questo metodo e vari tipi di cromatografia si sono diffusi nella determinazione delle vitamine.

Per purificare il tocoferolo dalle impurità, viene utilizzata la cromatografia su strato sottile. In combinazione con metodi spettrofotometrici e fluorimetrici, questo metodo viene determinato quantitativamente anche la vitamina E. Durante la separazione, vengono utilizzate piastre con silufol, kieselgel

L'analisi degli isomeri del tocoferolo nell'olio di oliva viene effettuata mediante cromatografia gas-liquido. I metodi di analisi GC e GLC richiedono la preparazione di derivati volatili, cosa estremamente difficile nell'analisi delle vitamine liposolubili. Per questo motivo questi metodi di determinazione non sono ampiamente utilizzati. La determinazione della vitamina E in prodotti alimentari, prodotti farmaceutici e oggetti biologici viene effettuata in modalità gradiente e isocratica, sia in condizioni di fase normale che di fase inversa. Come adsorbenti vengono utilizzati gel di silice (SG), farina fossile, silasorb, ODS-Hypersil e altri veicoli. Per monitorare continuamente la composizione dell'eluato in cromatografia liquida nell'analisi delle vitamine e aumentare la sensibilità della determinazione, spettrofotometria UV (A, = 292 nm), fluorescente (X, = 280/325 nm) ), rivelatori elettrochimici, PMR e spettroscopici di massa.

La maggior parte dei ricercatori preferisce utilizzare la cromatografia ad adsorbimento per separare le miscele di tutti gli otto isomeri dei tocoferoli e dei loro acetati. In questi casi, la fase mobile è solitamente costituita da idrocarburi contenenti quantità minori di qualsiasi etere semplice. I metodi elencati per determinare la vitamina E, di norma, non prevedono la saponificazione preliminare dei campioni, il che riduce significativamente i tempi di analisi.

La separazione con contemporanea determinazione quantitativa del contenuto delle vitamine liposolubili (A, D, E, K) nella loro presenza congiunta nei preparati multivitaminici viene effettuata sia in fase diretta che inversa. In questo caso, la maggior parte dei ricercatori preferisce utilizzare la versione in fase inversa dell'HPLC. Il metodo HPLC consente di analizzare le vitamine idrosolubili B1 e B2 sia simultaneamente che separatamente. Per separare le vitamine, vengono utilizzate le versioni HPLC a fase inversa, a coppia ionica e a scambio ionico. Applicare sia la modalità isocratica che quella gradiente della cromatografia. La separazione preliminare degli analiti dalla matrice viene effettuata mediante idrolisi enzimatica e acida del campione.

Vantaggi del metodo della cromatografia liquida:

Definizione di più componenti contemporaneamente

Eliminazione dell'influenza dei componenti interferenti

Il complesso può essere rapidamente riconfigurato per eseguire altre analisi.

Composizione e caratteristiche dell'apparecchiatura e del software per cromatografo liquido "Chromos ZhKh-301":

Tabella 1

Vantaggi del cromatografo "Chromos ZhKh-301":

L'elevata stabilità e precisione nel mantenimento della portata dell'eluente sono garantite dalla progettazione delle pompe ad alta pressione.

Il facile accesso alle colonne è garantito dal design del dispositivo.

L'efficienza della separazione è garantita dall'uso di colonne cromatografiche ad alte prestazioni.

Un'ampia gamma lineare del segnale di misurazione dei rilevatori senza modificare il limite di misurazione, che consente di misurare picchi di concentrazioni sia alte che basse con elevata precisione.

Analisi cromatografica delle vitamine idrosolubili:

1 acido ascorbico (C),
2 acido nicotinico (niacina),
3 piridossina (B6),
4 tiamina (B1),
5 nicotinammide (B3),
6 acido folico (M),
7 cianocobalamina (B12),
8 riboflavina (B2).

Le sostanze alimentari essenziali, riunite sotto il nome generico di "vitamine", appartengono a diverse classi di composti chimici, il che di per sé esclude la possibilità di utilizzare un unico metodo per la loro determinazione quantitativa. Tutti i metodi analitici noti per le vitamine si basano o sulla determinazione delle proprietà biologiche specifiche di queste sostanze (biologiche, microbiologiche, enzimatiche), o sull'uso delle loro caratteristiche fisico-chimiche (metodi fluorescenti, cromatografici e spettrofotometrici), o sulla capacità di alcune vitamine a reagire con alcuni reagenti per formare composti colorati (metodi colorimetrici).

Nonostante i progressi compiuti nel campo della chimica analitica e applicata, i metodi per determinare le vitamine nei prodotti alimentari richiedono ancora molto tempo e manodopera. Ciò è dovuto a una serie di ragioni oggettive, le principali delle quali sono le seguenti.

1. La determinazione di un certo numero di vitamine è spesso complicata dal fatto che molte di esse si trovano in natura allo stato legato sotto forma di complessi con proteine o peptidi, nonché sotto forma di esteri del fosforo. Per la determinazione quantitativa è necessario distruggere questi complessi e isolare le vitamine in forma libera, disponibili per l'analisi fisico-chimica o microbiologica. Ciò si ottiene solitamente utilizzando condizioni di lavorazione speciali (idrolisi acida, alcalina o enzimatica, autoclavaggio).

2. Quasi tutte le vitamine sono composti altamente instabili, facilmente soggetti a ossidazione, isomerizzazione e completa distruzione sotto l'influenza di alte temperature, ossigeno atmosferico, luce e altri fattori. È necessario osservare le precauzioni: ridurre al minimo il tempo per la preparazione preliminare del prodotto, evitare forte calore ed esposizione alla luce, utilizzare antiossidanti, ecc.

3. Nei prodotti alimentari, di norma, si ha a che fare con un gruppo di composti che hanno una grande somiglianza chimica e allo stesso tempo differiscono nell'attività biologica. Ad esempio, la vitamina E comprende 8 tocoferoli che sono simili nelle proprietà chimiche ma differiscono nell'azione biologica; Il gruppo dei caroteni e dei pigmenti carotenoidi comprende fino a 80 composti, di cui solo 10 hanno proprietà vitaminiche in un modo o nell'altro.

4.Le vitamine appartengono a diverse classi di composti organici. Pertanto, non possono esserci reazioni di gruppo comuni e metodi di ricerca comuni per loro.

5. Inoltre, l'analisi rende difficile la presenza di sostanze concomitanti nel campione di prova, la cui quantità può superare molte volte il contenuto della vitamina determinata (ad esempio steroli e vitamina D). Per eliminare possibili errori nella determinazione delle vitamine nei prodotti alimentari, gli estratti vengono solitamente accuratamente purificati dai composti correlati e la vitamina viene concentrata. A tale scopo vengono utilizzati vari metodi: precipitazione di sostanze che interferiscono con l'analisi, metodi di adsorbimento, cromatografia a scambio ionico o di partizione, estrazione selettiva dell'analita, ecc.

Negli ultimi anni, l'HPLC è stata utilizzata con successo per determinare le vitamine nei prodotti alimentari. Questo metodo è il più promettente, poiché consente di separare, identificare e quantificare simultaneamente varie vitamine e le loro forme biologicamente attive, riducendo i tempi di analisi.

Metodi fisico-chimici per lo studio delle vitamine. I metodi si basano sull'utilizzo delle caratteristiche fisico-chimiche delle vitamine (la loro capacità di fluorescenza, assorbimento della luce, reazioni redox, ecc.). Grazie allo sviluppo della chimica analitica e della strumentazione, i metodi fisico-chimici hanno quasi completamente soppiantato i metodi biologici, lunghi e costosi.

Determinazione della vitamina C. La vitamina C (acido ascorbico) può essere presente negli alimenti sia in forma ridotta che ossidata. L'acido deidroascorbico (DAC) può formarsi durante la lavorazione e la conservazione dei prodotti alimentari a seguito dell'ossidazione, il che rende necessaria la sua determinazione. Quando si determina la vitamina C nei prodotti alimentari, vengono utilizzati vari metodi: metodi di analisi colorimetrica, fluorescente, volumetrica basati sulle proprietà redox dell'AA e HPLC.

Il punto cruciale nella determinazione quantitativa dell'AA è la preparazione dell'estratto del campione. L'estrazione deve essere completa. Il miglior estraente è una soluzione al 6% di acido metafosforico, che ha la capacità di precipitare le proteine. Vengono utilizzati anche acidi acetico, ossalico e cloridrico, nonché loro miscele.

1. Per la determinazione totale e separata delle forme ossidate e ridotte di AA, viene spesso utilizzato il metodo Rohe utilizzando un reagente 2,4-dinitrofenilidrazina. L'AA (acido gulonico) sotto l'azione di agenti ossidanti passa nel DAK, e poi nell'acido 2,3-dichetogulonico, che forma composti di colore arancione con 2,4-dinitrofenilidrazina. La stessa 2,4-dinitrofenilidrazina è una base che non può esistere nella forma aci. Tuttavia, i corrispondenti idrazoni sotto l'influenza degli alcali vengono convertiti in sali aci intensamente colorati. Quando si determina la vitamina C, questo metodo interferisce con la presenza di agenti riducenti (glucosio, fruttosio, ecc.). Pertanto, con un elevato contenuto di zucchero nel prodotto in esame, viene utilizzata la cromatografia, che complica la determinazione.

Acidoformio nitroformio

2. Recentemente è stato riconosciuto un metodo fluorescente molto sensibile e accurato per determinare il contenuto totale di vitamina C (la somma di AA e DAA). DAK, condensando con o-fenilendiammina, forma un composto fluorescente, la chinossalina, che ha la massima fluorescenza ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 350 nm.

o-fenilendiammina DAC chinossalina

L'intensità della fluorescenza della chinossalina in un mezzo neutro a temperatura ambiente è direttamente proporzionale alla concentrazione di DAA. Per la determinazione quantitativa dell'AA, questo viene ossidato preliminarmente in DAA. Lo svantaggio di questo metodo è l'attrezzatura piuttosto costosa.

Metodi basati sulle proprietà redox dell'AA.

3. Tra i metodi basati sulle proprietà redox dell'AA, il metodo di titolazione con una soluzione di 2,6-diclorofenolindofenolo, che ha un colore blu, ha trovato la maggiore applicazione. Il prodotto dell'interazione dell'AA con il reagente è incolore. Il metodo può essere utilizzato nell'analisi di tutti i tipi di prodotti. Quando si analizzano prodotti che non contengono pigmenti naturali nelle patate, nel latte, viene utilizzata la titolazione visiva. In caso di presenza di coloranti naturali, utilizzare la titolazione potenziometrica o il metodo di estrazione con indofenolo-xilene. Quest'ultimo metodo si basa sulla decolorazione quantitativa del 2,6-diclorofenolindofenolo con acido ascorbico. Il colorante in eccesso viene estratto con xilene e la densità ottica dell'estratto viene misurata a 500 nm.

Solo AK reagisce. DAK è preridotto con cisteina. Per separare l'AA dagli agenti riducenti presenti negli alimenti trattati termicamente o negli estratti conservati a lungo termine, questi vengono trattati con formaldeide. La formaldeide, a seconda del pH del mezzo, interagisce selettivamente con AA e impurità estranee degli agenti riducenti (pH = 0). Il metodo specificato determina la quantità di AK e DAK.

Il 2,6-diclorofenolindofenolo può essere utilizzato anche per la determinazione fotometrica dell'AA. La soluzione reagente ha un colore blu e il prodotto dell'interazione con AA è incolore, ad es. a seguito della reazione l'intensità del colore blu diminuisce. La densità ottica è misurata a 605 nm (pH = 3,6).

4. Un altro metodo basato sulle proprietà riducenti dell'AA è il metodo colorimetrico, che sfrutta la capacità dell'AA di ridurre Fe(3+) a Fe(2+) e la capacità di quest'ultimo di formare sali di colore rosso intenso con 2,2'- dipiridile. La reazione viene condotta a pH 3,6 e ad una temperatura di 70ºС. L'assorbanza della soluzione viene misurata a 510 nm.

5. Metodo fotometrico basato sull'interazione dell'AA con il reagente di Folin. Il reagente di Folin è una miscela di acidi fosfomolibdici e fosfotungstici, cioè questo è un metodo noto basato sulla formazione di blu di molibdeno che assorbono a 640–700 nm.

6. Il metodo HPLC altamente sensibile e specifico può essere utilizzato con successo per la determinazione della vitamina C in tutti i prodotti alimentari. L'analisi è abbastanza semplice, solo che quando si analizzano prodotti ricchi di proteine è necessario prima rimuoverle. La rilevazione viene effettuata mediante fluorescenza.

Oltre ai metodi sopra descritti per determinare la vitamina C, esistono numerosi metodi, ad esempio l'ossidazione con cloruro d'oro e la formazione di acidi idrossamici, ma questi metodi non hanno alcuna importanza pratica.

Determinazione della tiamina (B 1 ). Nella maggior parte dei prodotti naturali, la tiamina si presenta sotto forma di estere difosforico - cocarbossilasi. Quest'ultimo, essendo il gruppo attivo di numerosi enzimi del metabolismo dei carboidrati, è in determinati legami con le proteine. Per la determinazione quantitativa della tiamina è necessario distruggere i complessi e isolare la vitamina studiata in forma libera, disponibile per l'analisi fisico-chimica. A tale scopo viene effettuata l'idrolisi acida o l'idrolisi sotto l'influenza di enzimi. Gli oggetti ricchi di proteine vengono trattati con enzimi proteolitici (pepsina) in un mezzo di acido cloridrico. Gli oggetti ad alto contenuto di grasso (carne di maiale, formaggi) vengono trattati con etere per rimuoverlo (la tiamina è praticamente insolubile nell'etere).

1. Per determinare la tiamina nei prodotti alimentari, di norma, viene utilizzato un metodo fluorescente, basato sull'ossidazione della tiamina in un mezzo alcalino con esacianoferrato di potassio (3+) per formare un composto tiocromico altamente fluorescente alla luce ultravioletta. L'intensità della sua fluorescenza è direttamente proporzionale al contenuto di tiamina (la lunghezza d'onda della luce eccitante è 365 nm, la lunghezza d'onda della luce emessa è 460–470 nm (fluorescenza blu)). Quando si utilizza questo metodo, sorgono difficoltà a causa della presenza di composti fluorescenti in numerosi oggetti. Vengono rimossi mediante purificazione su colonne con resine a scambio ionico. Quando si analizzano carne, latte, patate, pane integrale e alcune verdure, non è necessaria alcuna purificazione.

Tiamina Tiocromo

2. La tiamina è caratterizzata dal proprio assorbimento nella regione UV (240 nm in soluzione acquosa, 235 nm in etanolo), il che significa che può essere determinata mediante spettrofotometria diretta.

3. Per la determinazione simultanea di tiamina e riboflavina viene utilizzata l'HPLC.

Determinazione della riboflavina (B 2 ). Negli alimenti la riboflavina è presente principalmente come esteri del fosforo legati alle proteine e pertanto non può essere determinata senza una precedente digestione proteolitica. La riboflavina libera si trova in quantità significative nel latte.

Quando si determina la riboflavina, i metodi di analisi microbiologici e fisico-chimici (fluorescenti) sono i più utilizzati. Il metodo microbiologico è specifico, altamente sensibile e accurato; applicabile a tutti i prodotti, ma è lungo e richiede condizioni speciali.

Il metodo fisico-chimico è stato sviluppato in due versioni, che differiscono nel metodo di valutazione delle sostanze fluorescenti:

variante della fluorescenza diretta (determinazione dell'intensità della fluorescenza della riboflavina) e

Variante lumiflavina.

1. La riboflavina libera e i suoi esteri fosforici mostrano una caratteristica fluorescenza giallo-verde ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 440–500 nm. Questa proprietà è alla base del metodo fluorescente più utilizzato per la determinazione della riboflavina. La riboflavina e i suoi esteri danno spettri di fluorescenza molto simili con un massimo a 530 nm. La posizione del massimo non dipende dal pH. L'intensità della fluorescenza dipende in modo significativo dal pH e dal solvente (diverso per la riboflavina ed i suoi esteri), quindi gli esteri vengono preliminarmente distrutti e si analizza la riboflavina libera. Per questo vengono utilizzati l'idrolisi con acido cloridrico e tricloroacetico, l'autoclavaggio e il trattamento con preparati enzimatici.

L'intensità della fluorescenza giallo-verde della riboflavina alla luce UV dipende non solo dalla sua concentrazione, ma anche dal valore del pH della soluzione. L'intensità massima viene raggiunta a pH=6-7. Tuttavia, la misurazione viene effettuata a pH compreso tra 3 e 5, poiché in questo intervallo l'intensità della fluorescenza è determinata solo dalla concentrazione di riboflavina e non dipende da altri fattori: valore del pH, concentrazione di sali, ferro, impurità organiche , eccetera.

La riboflavina viene facilmente distrutta alla luce, la determinazione viene effettuata in luogo protetto dalla luce e ad un pH non superiore a 7. Si tenga presente che il metodo della fluorescenza diretta non è applicabile ai prodotti a basso contenuto di riboflavina.

2. La variante luminflavina si basa sullo sfruttamento della proprietà della riboflavina, dopo irradiazione in un mezzo alcalino, di trasformarsi in lumiflavina, la cui intensità di fluorescenza viene misurata dopo la sua estrazione con cloroformio (fluorescenza blu, 460–470 nm). Poiché in determinate condizioni il 60–70% della riboflavina totale passa in lumiflavina, durante l'analisi è necessario osservare condizioni di irradiazione costanti, le stesse per la soluzione test e standard.

Riboflavina Lumiflavina

Determinazione della vitamina B6 . Per determinare la vitamina possono essere utilizzati i seguenti metodi:

1. Spettrofotometria diretta. La piridossina cloridrato è caratterizzata dal proprio assorbimento a 292 nm (e = 4,4·10·3) a pH = 5.

2. Metodo Kjeldahl. La determinazione viene effettuata mediante l'ammoniaca, che si forma durante l'ossidazione della vitamina.

3. Metodo fotometrico basato sulla reazione con 2,6-diclorochinone clorimina (reattivo di Gibbs) a pH 8-10, che dà luogo alla formazione di indofenoli blu. Gli indofenoli vengono estratti con metiletilchetone e la densità ottica dell'estratto viene misurata a 660–690 nm (la reazione di Gibbs fornisce fenoli con una posizione para libera).

indofenolo

4. Un metodo fluorescente basato sul fatto che quando irradiato con piridossina e piridossamina si osserva una fluorescenza blu e con piridossale una fluorescenza blu.

Determinazione della vitamina B 9 . La determinazione dei folati negli alimenti nei tessuti e nei fluidi corporei presenta notevoli difficoltà, perché in questi oggetti sono solitamente presenti in forma legata (come poliglutammati); inoltre, la maggior parte delle forme è sensibile agli effetti dell'ossigeno atmosferico, della luce e della temperatura. Per proteggere i folati dall'idrolisi, si raccomanda l'idrolisi in presenza di acido ascorbico.

Negli alimenti, i folati possono essere determinati con metodi fisici, chimici e microbiologici. Il metodo colorimetrico si basa sulla scissione dell'acido pteroilglutammico con formazione di acido p-aminobenzoico e sostanze correlate e loro ulteriore trasformazione in composti colorati. Tuttavia, a causa della mancanza di specificità, questo metodo viene utilizzato principalmente per l'analisi dei prodotti farmaceutici.

Per la separazione, purificazione e identificazione dei folati sono stati sviluppati anche metodi cromatografici su colonne, carta e in uno strato sottile di adsorbente.

Determinazione della vitamina PP. Nei prodotti alimentari l'acido nicotinico e la sua ammide si trovano sia in forma libera che legata, facendo parte dei coenzimi. I metodi chimici e microbiologici per la determinazione quantitativa della niacina comportano l'isolamento e la conversione più completi delle sue forme legate, che fanno parte della complessa materia organica delle cellule, in acido nicotinico libero. Forme legate di niacina vengono rilasciate mediante esposizione a soluzioni acide o idrossido di calcio quando riscaldate. L'idrolisi con una soluzione di acido solforico 1 M in un'autoclave per 30 minuti ad una pressione di 0,1 MPa porta al rilascio completo delle forme legate di niacina e alla conversione della nicotinamide in acido nicotinico. È stato stabilito che questo metodo di lavorazione fornisce idrolizzati meno colorati e può essere utilizzato nell'analisi di prodotti a base di carne e pesce. L'idrolisi con idrossido di calcio è preferibile nella determinazione della niacina in farina, cereali, prodotti da forno, formaggi, concentrati alimentari, verdure, bacche e frutta. Ca(OH) 2 forma composti con zuccheri e polisaccaridi, peptidi e glicopeptidi che sono quasi completamente insolubili in soluzioni raffreddate. Di conseguenza, l'idrolizzato ottenuto dal trattamento con Ca(OH) 2 contiene meno sostanze che interferiscono con la determinazione chimica rispetto all'idrolizzato acido.

1. La base del metodo chimico per la determinazione della niacina è la reazione di Koenig, che procede in due fasi. Il primo stadio è la reazione dell'interazione dell'anello piridinico dell'acido nicotinico con il bromuro di cianogeno, il secondo è la formazione di un derivato colorato dell'aldeide glutaconica a seguito dell'interazione con le ammine aromatiche. (Immediatamente dopo l'aggiunta del bromuro di cianogeno all'acido nicotinico, appare il colore giallo della glutaconaldeide. Come risultato della sua interazione con le ammine aromatiche introdotte nella miscela di reazione, si formano dianili, che sono intensamente colorati di giallo, arancione o rosso, a seconda l'ammina (benzidina - rosso, acido solfanilico - giallo). La reazione di Koenig viene utilizzata per la determinazione fotometrica della piridina e dei suoi derivati con posizione A libera. Lo svantaggio del metodo è la sua durata, poiché la velocità di reazione è bassa.

Introduzione……………………………2

1. Panoramica generale dei metodi per la determinazione delle vitamine…………………3

2. Metodi cromatografici per la determinazione delle vitamine…………5

3. Metodi elettrochimici per la determinazione delle vitamine…………10

4. Metodo voltammetrico di stripping per la determinazione

vitamine idrosolubili B 1 B 2 negli alimenti………..13

Conclusione…………………...................................18

introduzione

1. Panoramica generale dei metodi per determinare le vitamine

Quasi tutte le vitamine vengono facilmente ossidate, isomerizzate e distrutte sotto l'influenza di alte temperature, luce, ossigeno atmosferico, umidità e altri fattori.

2. Metodi cromatografici per la determinazione delle vitamine

Vantaggi del metodo della cromatografia liquida:

Definizione di più componenti contemporaneamente

Eliminazione dell'influenza dei componenti interferenti

Il complesso può essere rapidamente riconfigurato per eseguire altre analisi.

Composizione e caratteristiche dell'apparecchiatura e del software per cromatografo liquido "Chromos ZhKh-301":

Tabella 1

Pompa SSI Serie III	La pompa dell'eluente ha una bassa pulsazione
Rivelatore spettrofotometrico SPF-1	Rilevatore di assorbimento (lunghezza d'onda 254 - 455 nm)
Rubinetto dosatore	Viene utilizzato un dispenser ad anello bidirezionale a sei porte. L'aumento del ciclo di dosaggio aumenta la sensibilità del test.
Pompa SSI Serie III	È possibile utilizzare una pompa aggiuntiva per creare un gradiente (opzionale)
Colonne cromatografiche	Colonna analitica Vydac 201SP54 250x4 mm o equivalente.
Attrezzatura ausiliaria per laboratorio di cromatografia liquida	Pompa a vuoto per degasare l'eluente.
Il programma per la raccolta e l'elaborazione delle informazioni cromatografiche "Chromos 2.3."	Funzionamento di un computer con diversi cromatografi (il numero dipende dalla configurazione del computer). Metodi di calcolo del cromatogramma: calibrazione assoluta, standard interno.
Computer IBM-PC/AT con stampante	Celeron-366 (e versioni successive), 32 MB di RAM. HDD-10G. FDD 1.44 (o CD-ROM). tastiera, mouse. monitor 15" SVGA, stampante.

Vantaggi del cromatografo "Chromos ZhKh-301":

L'elevata stabilità e precisione nel mantenimento della portata dell'eluente sono garantite dalla progettazione delle pompe ad alta pressione.

Il facile accesso alle colonne è garantito dal design del dispositivo.

L'efficienza della separazione è garantita dall'uso di colonne cromatografiche ad alte prestazioni.

Analisi cromatografica delle vitamine idrosolubili:

1 acido ascorbico (C),
2 acido nicotinico (niacina),
3 piridossina (B6),
4 tiamina (B1),
5 nicotinammide (B3),
6 acido folico (M),
7 cianocobalamina (B12),
8 riboflavina (B2).

Analisi cromatografica delle vitamine liposolubili:

1. Vitamina A
2. tokol
3. y-tocoferolo
4. a-tocoferolo (vitamina E)
5. luteina
6. zeaxantina
7. criptoxantina

8. a-carotene

Nonostante l'elevata sensibilità del metodo HPLC, l'alto costo degli strumenti, nonché la durata dell'analisi, tenendo conto del tempo di preparazione del campione, ne limitano significativamente l'utilizzo nei laboratori di analisi del nostro Paese.

introduzione

Determinazione della vitamina B 1(articolo di letteratura)

1 Cenni storici

2 Classificazione delle vitamine

4 Sintesi della vitamina B1

Metodi per determinare le vitamine

1 Metodi biologici

2 Metodi chimici

3 Metodi fisici

4 Metodi fisici e chimici

Determinazione analitica della vitamina B 1(parte sperimentale)

1 Determinazione potenziometrica della vitamina B1

2 Determinazione argentometrica della vitamina B1

Conclusione

introduzione

Attualmente sul mercato è apparso un numero enorme di prodotti alimentari arricchiti per l'uomo e l'alimentazione animale, che sono miscele secche multicomponenti. La gamma di tali prodotti è presentata abbastanza ampiamente. Si tratta innanzitutto di integratori alimentari biologicamente attivi, mangimi composti per animali e uccelli, preparati multivitaminici. Il criterio per la qualità di tali prodotti può essere la loro analisi del contenuto di vitamine e, soprattutto, di quelle vitali come le vitamine idrosolubili e liposolubili, la cui quantità è regolata da documenti normativi e standard di qualità sanitaria.

Le vitamine appartengono a diverse classi di composti organici. Pertanto per loro non possono esistere reazioni di gruppo comuni; ciascuna delle vitamine richiede un approccio analitico specifico.

Struttura chimica della vitamina B 1(vitamina antineuritica, aneurina, vitamina beriberi, vitamina anti-beriberi), consente di applicare diversi metodi di determinazione quantitativa chimica e fisico-chimica:

titolazione acido-base, titolazione per precipitazione (argentometria), metodi fisico-chimici (spettrofotometria), gravimetria.

Lo scopo di questo corso è la determinazione quantitativa della vitamina B 1. Sono stati scelti due metodi di determinazione quantitativa: metodi chimici e fisico-chimici.

Gli obiettivi del corso sono: Analizzare la letteratura, eseguire due determinazioni quantitative della tiamina - titolazione potenziometrica e metodo argentometrico.

1. Determinazione della vitamina B1 (revisione della letteratura)

1 Cenni storici

La famosa parola "vitamina" deriva dal latino "vita" - vita. Questi vari composti organici non hanno ricevuto questo nome per caso: il ruolo delle vitamine nella vita del corpo è estremamente alto.

Le vitamine sono un gruppo di sostanze chimiche strutturalmente diverse che prendono parte a molte reazioni del metabolismo cellulare. Non sono componenti strutturali della materia vivente e non vengono utilizzati come fonti di energia. La maggior parte delle vitamine non sono sintetizzate nel corpo umano e animale, ma alcune sono sintetizzate dalla microflora e dai tessuti intestinali in quantità minime, quindi la fonte principale di queste sostanze è il cibo.

Nella seconda metà del XIX secolo fu rivelato che il valore nutrizionale dei prodotti alimentari è determinato dal contenuto delle seguenti sostanze in essi contenuti: proteine, grassi, carboidrati, sali minerali e acqua.

Tuttavia, la pratica non ha sempre confermato la correttezza delle idee radicate sull'utilità biologica del cibo.

La fondatezza sperimentale e la generalizzazione scientifica e teorica di questa esperienza pratica secolare sono diventate possibili per la prima volta grazie alla ricerca dello scienziato russo Nikolai Ivanovich Lunin.

Ha condotto un esperimento con i topi, dividendoli in 2 gruppi. Ha nutrito un gruppo con latte intero naturale e l'altro ha mantenuto una dieta artificiale composta da proteine della caseina, zucchero, grassi, sali minerali e acqua.

Dopo 3 mesi, i topi del secondo gruppo morirono, mentre il primo gruppo rimase sano. Questa esperienza ha dimostrato che oltre ai nutrienti, sono necessari altri componenti per il normale funzionamento del corpo. Questa è stata un'importante scoperta scientifica, che confutava la posizione consolidata nella scienza della nutrizione.

Una brillante conferma della correttezza della conclusione di N. I. Lunin stabilendo la causa della malattia del beriberi.

Nel 1896, il medico inglese Aikman notò che i polli nutriti con riso brillato soffrivano di una malattia nervosa che somigliava al beriberi negli esseri umani. Dopo aver dato ai polli riso integrale, la malattia si fermò. Ha concluso che la vitamina è contenuta nel guscio dei chicchi. Nel 1911, lo scienziato polacco Casimir Funk isolò la vitamina in forma cristallina. La struttura finale della vitamina B 1è stato installato nel 1973.

Secondo le sue proprietà chimiche, questa sostanza apparteneva ai composti organici e conteneva un gruppo amminico. Funk, ritenendo che tutte queste sostanze dovessero necessariamente contenere gruppi amminici, suggerì di chiamare queste sostanze sconosciute vitamine, ad es. ammine della vita. Successivamente si è scoperto che molti di essi non contengono gruppi amminici, ma il termine "vitamina" ha messo radici nella scienza e nella pratica.

Secondo la definizione classica, le vitamine sono sostanze organiche a basso peso molecolare necessarie per la vita normale che non sono sintetizzate da un organismo di una determinata specie o sono sintetizzate in quantità insufficiente per garantire la vita dell'organismo. Le vitamine sono necessarie per il normale corso di quasi tutti i processi biochimici nel nostro corpo.

2 Classificazione delle vitamine

La moderna classificazione delle vitamine non è perfetta. Si basa sulle proprietà fisico-chimiche (in particolare la solubilità) o sulla natura chimica. A seconda della solubilità in solventi organici non polari o in un mezzo acquoso, si distinguono le vitamine liposolubili e idrosolubili. Nella classificazione delle vitamine, oltre alla designazione della lettera, l'effetto biologico principale è indicato tra parentesi, a volte con il prefisso "anti", che indica la capacità di questa vitamina di prevenire o eliminare lo sviluppo della malattia corrispondente.

vitamine liposolubili

Vitamina L (antixerofgalmico); retinolo

Vitamina D (antirachitica); calciferoli

Vitamina E (vitamina antisterile, riproduttiva); tocoferoli

Vitamina K (antiemorragico); naftochinoni

Vitamine idrosolubili

.Vitamina B 1(antineuritico); tiamina

.Vitamina B 2(Vitamina della crescita); riboflavina

.Vitamina B 6(antidermatite, adermin); piridossina

.Vitamina B 12(antianemico); cianocobalamy; cobalamina

.Vitamina PP (antipelgrico, niacina); nicotinammide

.Vitamina H (antiseborroico, fattore di crescita batterico, di lieviti e funghi); biotina

.Vitamina C (antiscorbutico): acido ascorbico

3 La struttura e le proprietà della vitamina B1

Vitamina B 1-tiamina è il sale cloridrato di 4-metil-5- ?-l'idrossietil-N-(2-metil-4-ammino-5-metilpirimidil)-tiazolio cloruro, è ottenuto sinteticamente, solitamente sotto forma di sale cloridrato o bromidrato. La sua struttura include sistemi eterociclici come pirimidile e tiazolo.

La vitamina B1 è una polvere cristallina bianca di sapore amaro, con odore caratteristico, facilmente solubile in acqua (1 g in 1 mg), acido acetico glaciale e alcol etilico. In un ambiente acquoso fortemente acido, la tiamina è altamente stabile e non viene distrutta da agenti ossidanti energetici come il perossido di idrogeno, il permanganato di potassio e l'ozono. A pH=3,5, la tiamina può essere riscaldata ad una temperatura di 120 º Senza segni visibili di decomposizione.

La vitamina B1 è in grado di ossidarsi. In un ambiente alcalino, sotto l'azione del sale rosso del sangue, la tiamina viene convertita in tiocromo. La conversione della tiamina in tiocromo è un processo quantitativo irreversibile.

Questa reazione è la base di uno dei metodi quantitativi per determinare la vitamina B1. La conversione della tiamina in tiocromo è accompagnata da una perdita di capacità vitaminica.

1.4 Sintesi

Considerando le caratteristiche strutturali della vitamina B 1, la sua sintesi può essere effettuata in tre modi: per condensazione delle componenti pirimidiniche e tiazoliche, in base alla componente pirimidinica e in base alla componente tiazolica.

Consideriamo la prima opzione. Entrambi i componenti vengono sintetizzati in parallelo e quindi combinati in una molecola di tiamina. Nello specifico, la 2-metil-4-ammino-5-clorometilpirimidina reagisce con 4-metil-5-idrossietiazolo per formare un sale quaternario tiazolico:

La condensazione avviene ad una temperatura di 120 0C in toluene o alcool butilico. Successivamente, la tiamina risultante viene isolata dalla miscela di reazione mediante precipitazione con acetone e purificata mediante ricristallizzazione da metanolo.

5 Distribuzione per natura e applicazione

La tiamina è onnipresente e si trova in vari rappresentanti della fauna selvatica. Di norma, la sua quantità nelle piante e nei microrganismi raggiunge valori molto più alti che negli animali. Inoltre, nel primo caso, la vitamina si presenta principalmente in forma libera e nel secondo in forma fosforilata. Il contenuto di tiamina nei principali prodotti alimentari varia in un intervallo abbastanza ampio, a seconda del luogo e del metodo di ottenimento della materia prima, della natura del trattamento tecnologico dei prodotti intermedi, ecc.

Nei semi di cereali delle piante, la tiamina, come la maggior parte delle vitamine idrosolubili, è contenuta nel guscio e nel germe. La lavorazione delle materie prime vegetali (rimozione della crusca) è sempre accompagnata da una forte diminuzione del livello della vitamina nel prodotto risultante. Il riso brillato, ad esempio, non contiene affatto questa vitamina.

La vitamina B1 è ampiamente utilizzata nella pratica medica per il trattamento di varie malattie nervose (nevrosi, polineurite), disturbi cardiovascolari (ipertensione), ecc.

Vitaminizzazione di prodotti da forno e mangimi negli allevamenti di bestiame e pollame.

Il fabbisogno medio giornaliero di un adulto è di 2-3 mg di vitamina B 1. Ma la sua necessità dipende in larga misura dalla composizione e dal contenuto calorico totale del cibo, dall'intensità del metabolismo e dall'intensità del lavoro. La predominanza dei carboidrati negli alimenti aumenta il bisogno di vitamine da parte dell'organismo; i grassi, al contrario, riducono drasticamente questo fabbisogno.

2. Metodi per determinare le vitamine

Tutti i metodi per lo studio delle vitamine sono suddivisi in biologici (microbiologici), fisici, chimici e fisico-chimici.

1 Metodi biologici

Nonostante i metodi biologici per la determinazione di alcune vitamine siano altamente sensibili e possano essere utilizzati per studiare campioni con un basso contenuto di questi composti, attualmente sono principalmente di interesse storico. L'accuratezza di questi metodi non è elevata, inoltre i metodi biologici richiedono molto tempo, sono costosi e scomodi per le analisi seriali.

I metodi microbiologici si basano sulla misurazione del tasso di crescita dei batteri, che è proporzionale alla concentrazione della vitamina nell'oggetto in esame.

2.2 Metodi chimici

La specificità delle proprietà delle vitamine è dovuta alla presenza di gruppi funzionali nelle loro molecole. Questa proprietà è ampiamente utilizzata nelle analisi chimiche quantitative e qualitative.

Metodi chimici di analisi:

) Fotometrico;

) Titrimetrico (consiste nel fatto che tutte le sostanze reagiscono tra loro in quantità equivalenti di C*V = c *V );

3) Gravimetrico (consiste nell'isolamento di una sostanza nella sua forma pura e nella sua pesatura. Molto spesso, tale isolamento viene effettuato mediante precipitazione. Un componente meno comunemente determinato viene isolato sotto forma di composto volatile (metodo di distillazione). Analitico massa-segnale);

) Ottico (basato sull'assorbimento di una certa quantità di energia radiante da parte degli atomi da parte del sistema. La quantità di energia di assorbimento dipende direttamente dalla concentrazione della sostanza nella soluzione).

3 Metodi fisici

L'uso di metodi fisici nell'analisi delle vitamine (ad esempio VMR) è limitato dall'elevato costo degli strumenti.

Conduttometrico - basato sulla misurazione della conduttività elettrica di una soluzione.

Potenziometrico (il metodo si basa sulla misurazione della dipendenza del potenziale di equilibrio dell'elettrodo dall'attività (concentrazione) dello ione determinato dello ione determinato. Per le misurazioni, è necessario confrontare l'elemento da un elettrodo indicatore adatto e un riferimento elettrodo).

Spettro di massa: viene utilizzato con l'aiuto di elementi forti e campi magnetici, le miscele di gas vengono separate in componenti in base agli atomi o ai pesi molecolari dei componenti. Viene utilizzato nello studio di miscele di isotopi, gas inerti, miscele di sostanze organiche.

4 Metodi fisici e chimici

Attualmente, nella pratica dell'analisi farmaceutica, vengono sempre più utilizzati metodi di analisi fisici e chimici, in quanto i più accurati ed espressivi nella loro esecuzione. Questi includono metodi di analisi ottici, elettrochimici e cromatografici.

Tra i metodi ottici, i più diffusi sono i metodi spettrofotometrici e fotocolorimetrici basati sul principio generale: l'esistenza, entro limiti di concentrazione noti, di una relazione proporzionale diretta tra l'assorbimento della luce di una soluzione e la concentrazione di un soluto. L'analisi spettrofotometrica mediante misurazione diretta della densità ottica può essere effettuata per sostanze con determinate caratteristiche strutturali: la struttura deve contenere gruppi cromofori e auxocromici (ad esempio eteroatomi, sistemi di legami coniugati).

I vantaggi dei metodi colorimetrici (fotometrici) includono la disponibilità di attrezzature e strumenti di misurazione, la rapidità. Lo svantaggio principale è la bassa selettività, che impedisce l'applicazione di questi metodi ad oggetti con composizione complessa. L'influenza dei componenti associati colpisce: provitamine, antiossidanti, derivati delle vitamine, prodotti di distruzione delle vitamine, capaci, come le vitamine, di produrre prodotti colorati. Esistono difficoltà nella scelta di un reagente specifico per l'interazione con una particolare vitamina.

Nonostante i limiti di questo metodo, per molte vitamine sono stati sviluppati metodi di determinazione fotometrica.

Nonostante la varietà di metodi per la determinazione fotometrica delle vitamine, gli scienziati sono ancora interessati a questo metodo, unificando vecchi metodi e creandone di nuovi.

I metodi di analisi cromatografici sono molto comuni nella pratica farmaceutica. Questi metodi sono promettenti nell'analisi di sostanze contenenti vitamine e aventi una struttura complessa.

Fino a tempi relativamente recenti, la cromatografia gas-liquido (GLC) era la tecnica cromatografica più comunemente utilizzata.

Attualmente, un metodo alternativo per la determinazione rapida delle vitamine in una varietà di oggetti è la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).

La determinazione delle vitamine mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni non richiede la preparazione del campione a lungo termine, la sensibilità del metodo è piuttosto elevata, ma l'alto costo delle apparecchiature limita significativamente l'uso di questo metodo.

I metodi di analisi elettrochimica si basano sull'uso di processi di scambio ionico o elettroscambio che si verificano sulla superficie dell'elettrodo o nello spazio dell'elettrodo. Un segnale analitico è qualsiasi parametro elettrico (potenziale, intensità di corrente, resistenza, conduttività elettrica, ecc.) che è funzionalmente correlato alla composizione e alla concentrazione della soluzione.

I metodi di analisi elettrochimici svolgono un ruolo importante nei moderni prodotti farmaceutici, poiché sono caratterizzati da elevata sensibilità, bassi limiti di rilevamento e un'ampia gamma di contenuti determinati. I metodi più comuni sono la polarografia e la voltammetria. I dati di letteratura sullo studio polarografico delle vitamine sono i più numerosi. Polarograficamente è possibile determinare il contenuto quantitativo di ciascuna vitamina nelle preparazioni farmaceutiche singole e complesse.

Il metodo è abbastanza sensibile, ma l'uso della polarografia è limitato dall'uso di un elettrodo di mercurio tossico.

Allo stesso tempo, il metodo della titolazione potenziometrica è rapido, facile da eseguire e non richiede apparecchiature e reagenti costosi.

3. Parte sperimentale

1 Determinazione potenziometrica della vitamina B1

Nella struttura della vitamina B 1comprende il cloro mobile (C 12H 18ON4 Cl 2S):

titolazione potenziometrica della vitamina tiamina

Ciò ha reso possibile utilizzare la titolazione potenziometrica della precipitazione per la determinazione della tiamina. Come elettrodo indicatore è stato utilizzato un elettrodo d'argento. Il titolante era una soluzione di nitrato d'argento con una concentrazione di 0,05 mol/l.

Per l'analisi, sono state preparate soluzioni con una concentrazione di vitamina B 10,02968mol/l. A tale scopo il contenuto di 10 fiale è stato trasferito quantitativamente in un pallone da 50 ml e portato a volume con acqua distillata. Il volume delle fiale è di 1 ml, il contenuto di vitamina B 1 - 50 mg (Produttore: OJSC "Moskhimfarmpreparaty" dal nome N.A. Semashko). Sono state prelevate aliquote, 5 ml ciascuna, ed è stata eseguita la titolazione potenziometrica. Il volume equivalente di una soluzione di nitrato d'argento titolata con 5 ml di una soluzione vitaminica è 6 ml. Sono state effettuate 8 misurazioni potenziometriche.

Esempi di curve di titolazione sono mostrati nelle Figure 1, 2, 3, 4, 5. Le curve di titolazione sono costruite in coordinate - curve integrali V, ml - E, W e curve differenziali in coordinate -? V-

Fig.1 Curva di titolazione potenziometrica della vitamina B 1(v al =5ml)

Fig.2 Curva di titolazione potenziometrica della vitamina B 1(v al =5ml)

Fig.3 Curva di titolazione potenziometrica della vitamina B 1(v al =5ml)

Fig.4 Curva di titolazione potenziometrica della vitamina B 1(v al =5ml)

Fig.5 Curva di titolazione potenziometrica della vitamina B 1(v al =5ml)

dove TAgNO3/vit.B1.= (0,05*337)/1000=0,01685 g/ml; Ve è il volume di nitrato d'argento utilizzato per la titolazione.

dove v boccette = 50 ml, t AgNO3/vit.B1 =0,008425 g/ml, V uh - volume di nitrato d'argento utilizzato per la titolazione, V al = 5 ml, N - numero di fiale (10 pezzi).

I risultati dell’analisi sono presentati nella tabella 1.

Tabella 1. Risultati dell'analisi della titolazione potenziometrica.

N. V, ml, mgm, g 0110.05055<среднее>6,06250,102150,051076

dove x - valore "sospetto" (probabile errore) è il valore massimo o minimo del campione, x più vicino - più vicino al valore sospetto, x min e x max - i valori massimi e minimi del campione. Il valore Q viene confrontato con il valore della tabella (Tabella 2). Il livello di confidenza è considerato pari a 0,90 o 0,95. Se Q > Q tavolo - un risultato sospetto è considerato mancato ed è escluso da ulteriori considerazioni; Q< Qtavolo - un risultato sospetto non è un errore.

Tabella 2. Valori critici del criterio Q per diversa probabilità di confidenza p e numero di misurazioni n.

np0.900.950.9930.9410.9700.99440.7650.8290.92650.6420.7100.82160.5600.6250.74070.5070.5680.68080.4680.5260.63490.4370.493 0.598100.4120.4660.568

Calcoli: n=8; p=0,90;= =1.0>0.468 il criterio indica che il risultato è mancato e non ne teniamo conto.

Escludendo la mancanza, otteniamo m = 0,05055 g, secondo i documenti normativi, il contenuto di vitamina B 1 dovrebbe essere pari a 0,05 g.

L'errore è:

X \u003d 0,05055-0,05 \u003d 0,00055 g

1,1%

.La deviazione standard che caratterizza lo spread dei risultati CCA:

Tabella 3. Tabella ausiliaria per il calcolo dell'RMS.

M io M io - (M io - )2S0.050550.050550000.050550.050550000.050550.050550000.050550.050550000.050550.050550000.050550.050550000.050550.05055000

.Intervallo di confidenza:

0,05055

3.2 Determinazione argentometrica della vitamina B1

Determinazione argentometrica con il metodo di Faience. Il metodo Fajans è un metodo di titolazione diretta degli alogenuri con una soluzione di AgNO30.1M in un mezzo leggermente acido utilizzando indicatori di adsorbimento che mostrano un cambiamento di colore non nelle soluzioni, ma sulla superficie del precipitato. Abbiamo utilizzato la soluzione preparata per il primo metodo per la determinazione quantitativa della tiamina con una concentrazione vitaminica di 0,02968 mol/l. Val= 5 ml. Si aggiungono goccia a goccia 2-3 gocce di soluzione di blu bromofenolo e acido acetico diluito fino ad ottenere una colorazione giallo-verdastra. La soluzione risultante è stata titolata con una soluzione 0,1 M di nitrato d'argento fino al colore viola.

La titolazione procede secondo l'equazione:

(CON 12H 17N 4OS)Cl - .HCl+2AgNO 3= 2AgCl + (C 12H 17N 4OS)NO3 - .HNO 3

Tabella 4. Risultati della determinazione argentometrica della vitamina B1

№V , mlm, g11.50.0505521.50.0505531.50.0505541.50.0505551.40.0471861.50.0505571.50.0505581.50.0505591.40.04718101.50.05055<среднее>1,480,04988

I risultati di cui sopra indicano la presenza di valori anomali. La definizione degli errori viene effettuata secondo il criterio Q: le statistiche del test del criterio Q vengono calcolate con la formula:

Calcoli: n=10; p=0,90;

> 0,412, il criterio indica che il risultato è un errore e non ne teniamo conto nei calcoli successivi.

1.Determinazione del titolo AgNO 3 0,1 N in soluzione NaCl 0,1 N

= ;

Volume V di AgNO 3, è andato per la titolazione, ml.

2.L'errore è:

X \u003d 0,05055 -0,05 \u003d 0,00055 g

1,1%

Elaborazione matematica dei risultati della QCA (analisi chimica quantitativa)

.Deviazione standard che caratterizza la diffusione dei risultati del CCA

Tabella 5. Tabella ausiliaria per il calcolo dell'RMS.

M io M io - (M io - )2S0.050550.050550000.050550.050550000.050550.050550000.050550.050550000.050550.050550000.050550.050550000.050550.050550000, 050550,05055000

.Intervallo di confidenza:

I limiti superiore e inferiore dell'intervallo in cui si trova l'errore dei risultati CCA con una probabilità di confidenza di 0,95 sono stati determinati come segue:

0,05055

Conclusione

In questo corso il compito era quantificare la vitamina B 1. Per determinare le vitamine vengono utilizzati vari metodi. È inoltre necessario tenere conto della struttura chimica di ciascuna vitamina. I metodi ottici di analisi ampiamente utilizzati sono laboriosi, richiedono molto tempo e richiedono reagenti costosi; l’uso dei metodi cromatografici è complicato dall’uso di apparecchiature costose. Sono stati scelti due metodi per la determinazione della tiamina:

.Titolazione potenziometrica, che presenta numerosi vantaggi rispetto ai metodi esistenti per l'analisi dei prodotti farmaceutici, per il contenuto di vitamine in essi contenuti: il metodo è semplice, rapido, non richiede attrezzature costose, il consumo di reagenti è minimo e l'influenza dei fattori soggettivi è escluso.

Con questo metodo, l'errore è dell'1,1%.

.La titolazione consiste nel fatto che tutte le sostanze reagiscono tra loro in quantità equivalenti di C * V = c *V

In questo metodo per la determinazione della tiamina l'errore è dell'1,1%.

Intervallo di confidenza: 0,05055.

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GOST 29138-91

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