DIAGNOSI RAPIDA DELLA RABBIA

Metodi per la rilevazione degli antigeni. In caso di rabbia per la diagnosi rapida possono essere utilizzati metodi di anticorpi fluorescenti (MFA), reazioni di precipitazione (RP) in gel di agar, metodi di dosaggio immunoenzimatico (ELISA), reazione a catena della polimerasi (PCR). Sono necessari diversi test per diagnosticare la rabbia negli esseri umani in vivo.

Determinazione degli anticorpi contro gli antigeni del virus della rabbia. Il rilevamento degli anticorpi nel siero del sangue o nel liquido cerebrospinale è un importante metodo diagnostico. I test sierologici degli anticorpi specifici per la rabbia vengono eseguiti nel siero del sangue per determinare la vaccinazione pre e post-esposizione e determinare i tempi dell'immunizzazione di richiamo al fine di aumentare la risposta immunitaria.

Isolamento del virus. Per l'isolamento e l'identificazione del virus viene utilizzato il metodo del biotest sui topi bianchi. Il materiale in esame viene sospeso in una soluzione fisiologica contenente antibiotici e siero fetale bovino. La sospensione viene somministrata per via intracerebrale a topi bianchi del peso di 5-6 g Per dimostrare lo sviluppo dell'infezione, i topi vengono osservati quotidianamente fino al 30 ° giorno dopo l'inoculazione. I topi che sviluppano la malattia durante questo periodo vengono immediatamente soppressi e i tessuti cerebrali vengono esaminati mediante MFA diretta.

Il vantaggio di questo approccio è la capacità di rilevare piccole quantità di virus della rabbia nel materiale. Lo svantaggio del metodo è la necessità di molti giorni (7-18 giorni) di attesa tra l'inoculazione e la comparsa dei primi segni della malattia. Per ridurre il periodo di incubazione vengono utilizzati topi allattati. I topi di età inferiore a 3 giorni possono essere utilizzati per la diagnostica rapida: nei topi macellati dopo 3 giorni, l'antigene del virus è già rilevato nel cervello, che può essere rilevato dall'MFA.

Questo metodo di isolamento del virus viene praticato come test diagnostico di conferma in caso di risultati negativi per la rilevazione dell'antigene e dei corpi di Babes-Negri e in caso di morso di una persona da parte di un animale sospettato di rabbia. Fornisce sensibilità e specificità adeguate, cioè è considerato al livello di significato diagnostico del metodo di immunofluorescenza diretta. Inoltre, questo metodo è il principale per l'identificazione delle varianti virali ed è promettente per lo sviluppo di reagenti diagnostici.

Isolamento e identificazione del virus in coltura cellulare. Il principale svantaggio dell'isolamento del virus durante l'infezione degli animali da laboratorio è la durata del metodo. Ciò può essere evitato utilizzando colture cellulari. Di solito, per questi scopi viene utilizzata una coltura di cellule di neuroblastoma di topo se è necessario esaminare i tessuti cerebrali. Il cervello viene sospeso in un mezzo nutriente di coltura, la sospensione viene applicata su un monostrato di coltura cellulare e incubata per uno o più giorni.

La sensibilità di una determinata coltura al virus può essere aumentata trattandola con destrano DEAE. Il monostrato cellulare viene quindi lavato, fissato a freddo con acetone o una miscela di formalina e metanolo ed esaminato mediante immunofluorescenza. Se l'animale è stato infettato dal virus della rabbia, nel monostrato della coltura cellulare vengono rilevate inclusioni citoplasmatiche dell'antigene del virus della rabbia.

È stato dimostrato che l'antigene del virus della rabbia può essere rilevato su cellule di neuroblastoma murino Na C1 300 in combinazione con MFA dopo 2 giorni. La sensibilità del metodo è paragonabile a quella dell'isolamento del virus nei topi.

Sebbene il virus della rabbia abbia neuropatogenicità obbligata in vivo, è in grado di infettare un'ampia gamma di cellule ospiti in vitro, che possono essere utilizzate per testare la presenza del virus della rabbia in altri tessuti e organi. È stato stabilito che il virus della rabbia si moltiplica nelle cellule BHK-21 e Vero, nelle cellule primarie di embrioni di pollo o di reni di criceto. È stato dimostrato che l'adsorbimento del virus e la sua introduzione nella cellula avvengono entro 7 ore. Dopo 24-48 ore all'interno della cellula si formano nuove particelle virali, dopo 72 ore germogliano dalla membrana cellulare nello spazio intercellulare.

Metodi di ricerca

Per diagnosi espressa della rabbia può essere utilizzata:

un metodo SE UN- rilevare l'antigene del virus della rabbia nelle impronte della cornea o della parte posteriore del collo di un paziente contenenti follicoli piliferi;
b) metodo PCR- per rilevare l'RNA del virus in campioni bioptici tissutali, saliva, liquido cerebrospinale o lacrimale;
c) metodo ELISA- per rilevare anticorpi specifici (antigene) in pazienti con decorso tipico o atipico.
d) metodo saggi biologici- per isolare il virus nelle fasi iniziali della malattia o per rilevare anticorpi nel sangue o nel liquido cerebrospinale nelle fasi successive della malattia. Per la diagnosi rapida viene utilizzato un metodo complesso (biotest + MFA), che consiste nell'infettare topi neonati di 2 giorni con il materiale del test ed esaminare il loro cervello nei giorni 3-4 in MFA.

La scelta dei metodi di diagnostica in vivo dipende in gran parte dallo stadio della malattia: un metodo basato sulla rilevazione degli antigeni, di norma, è altamente sensibile alla fine del periodo di incubazione, durante i primi giorni della malattia, mentre gli anticorpi neutralizzanti il ​​virus compaiono solitamente nel liquido cerebrospinale e nel sangue dopo 7-10 giorni dall'esordio della malattia.

Reazione di immunofluorescenza. Il metodo si basa sull'uso di anticorpi legati a un colorante, ad esempio l'isotiocianato di fluoresceina. Il RIF è ampiamente utilizzato per rilevare antigeni virali nel materiale dei pazienti e per una diagnosi rapida.

Il metodo ha il più alto grado di sensibilità; costituisce la base per la diagnostica rapida e consente di rilevare gli antigeni virali entro poche ore.

I principali vantaggi dell'MFA sono: velocità di esecuzione, elevata specificità (100%). Il tempo impiegato per diagnosticare la malattia con il suo aiuto è inferiore a un giorno. Vengono utilizzate versioni dirette e indirette dell'AMF.

Immunofluorescenza diretta rimane il metodo preferito per diagnosticare la rabbia. I vetrini contenenti impronte di tessuti cerebrali o vetri con un monostrato di coltura tissutale vengono fissati in acetone per 1-4 ore. Le preparazioni vengono poi essiccate e trattate con anticorpi policlonali fluorescenti anti-nucleocapsidi (reagente immunofluorescente).

Questo reagente è un coniugato preparato da anticorpi policlonali specifici della classe IgG contro l'antigene nucleocapside del virus e l'isocianato di fluoresceina (FITC). Gli anticorpi specifici si ottengono mediante iperimmunizzazione di animali (conigli, criceti o cavalli) con una miscela di epitopi del nucleocapside del virus.

Attualmente per questi scopi vengono sempre più utilizzati anticorpi monoclonali di topo contro il nucleocapside del virus della rabbia. Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37°C, le preparazioni diagnostiche vengono ripetutamente lavate con soluzione salina e acqua distillata.

Gli anticorpi marcati con FITC vengono fissati solo nei siti di localizzazione degli antigeni nucleoproteici virali. I preparati vengono poi essiccati all'aria ed esaminati al microscopio ottico utilizzando una lampada allo xeno e un filtro appropriato come sorgente luminosa.

A versione indiretta l'antigene viene prima combinato con il siero immunitario specifico non colorato. Quindi, i complessi antigene-anticorpo non fluorescenti formati vengono esposti a siero immunitario marcato con fluorocromo contenente anticorpi contro specifiche proteine ​​sieriche. La versione indiretta dell'MFA, insieme alla rilevazione dell'antigene, consente di quantificare gli anticorpi nel siero in esame diluendolo opportunamente.

Le formazioni marcate con FITC in cellule di diversi tessuti vengono rilevate come colorazione fluorescente giallo-verde su sfondo scuro (sotto forma di inclusioni intracitoplasmatiche rotonde o ovali).

Saggio immunoassorbente collegato. Il metodo si basa sul principio dell'assorbimento delle proteine ​​sulla fase solida seguito dalla formazione di complessi antigene-anticorpo rilevati da una soluzione substrato-indicatore. L'antigene aggiunto ai pozzetti si lega specificamente agli anticorpi. I sieri del test vengono applicati sullo strato antigenico nelle diluizioni richieste. In presenza di anticorpi specifici in essi, questi ultimi si legano all'antigene. Per rilevare il legame, allo strato di anticorpi viene applicata un'immunoglobulina contro le globuline sieriche umane coniugate con perossidasi di rafano. La quantità di coniugato assorbente è proporzionale alla quantità di siero umano legato all'antigene. Questo può essere determinato utilizzando una soluzione indicatrice (ortofenililendiammina + perossido di idrogeno), i cui componenti, a seguito dell'azione della perossidasi coniugata, colorano il liquido marrone-giallo. Quando si esaminano casi poco chiari, l'uso dell'ELISA in aggiunta ai metodi RP o RSK consente di aumentare l'affidabilità della diagnosi di laboratorio della rabbia, grazie all'elevata sensibilità di questo metodo. Il metodo consente di rilevare particelle infette e difettose.

Per determinare gli anticorpi antirabbici durante la vaccinazione, è possibile utilizzare un metodo ELISA indiretto, utilizzando un virus purificato come antigene, e per determinare gli anticorpi della classe IgG nel siero umano, la proteina A dello stafilococco associata alla perossidasi di rafano. I risultati dell'ELISA sono paragonabili a quelli ottenuti nei test di neutralizzazione virale nei topi. Il metodo consente di rilevare la presenza di IgM all'inizio del processo di immunizzazione.

I metodi immunoenzimatici sono molto promettenti per il rilevamento dell'antigene nucleocapside del virus durante la diagnosi post mortem nei tessuti cerebrali. Tra questi, ad esempio, c'è un metodo ELISA rapido per la diagnosi della rabbia, basato sulla preparazione di piastre sensibilizzate con anticorpi dell'isotipo IgG al nucleocapside del primo sierotipo, diluiti in tampone carbonato.

Il materiale da testare viene omogeneizzato in tampone o terreno di coltura, chiarificato mediante centrifugazione, aggiunto ai pozzetti e incubato in piastre. L'antigene nucleocapside fissato con anticorpi specifici viene identificato aggiungendo un coniugato di perossidasi con anticorpi antirabbici antinucleocapsidici di diversa specificità di specie e un substrato cromogenico. La sensibilità del metodo è 0,8–1,0 ng/ml.

Questo metodo può rilevare antigeni di virus di vari sierotipi. L'uso di coniugati di anticorpi specifici del nucleocapside marcati con biotina aumenta la sensibilità del metodo a 0,1–0,2 ng/ml.

L'antigene nucleocapside viene rilevato con successo mediante ELISA, ma il materiale, anche decomposto, non deve essere fissato con formalina.

Metodo della reazione a catena della polimerasi. Per una diagnosi rapida del virus della rabbia e l'identificazione dei lyssavirus, il metodo più conveniente è la reazione a catena della polimerasi (PCR). Il metodo PCR è il metodo più affidabile e veloce per isolare l'RNA virionico da qualsiasi campione contenente il virus a bassa concentrazione. Con esso, puoi creare molte copie del virus RNA. Questo metodo viene utilizzato per confermare i risultati dell'MFA e per rilevare il virus nella saliva, nei follicoli piliferi della parte posteriore del collo e della testa.

La PCR si basa sul principio della replicazione naturale del DNA. L'essenza del metodo è la ripetizione ripetuta di cicli di sintesi (amplificazione) di una sequenza di DNA specifica del virus utilizzando una polimerasi Taq DNA termostabile e due primer specifici, i cosiddetti primer.

Ogni ciclo è composto da tre fasi con diverse condizioni di temperatura. In ogni ciclo, il numero di copie della regione sintetizzata viene raddoppiato. I frammenti di DNA appena sintetizzati fungono da modello per la sintesi di nuovi filamenti nel successivo ciclo di amplificazione, il che consente di accumulare un numero sufficiente di copie della regione di DNA selezionata in 25-35 cicli per la sua determinazione, solitamente mediante gel di agarosio elettroforesi.

Sensibilità particolarmente elevata della PCR quando si utilizzano primer complementari al gene N, quando è possibile rilevare l'RNA del virus in campioni contenenti il ​​virus in un titolo di 10 MLD50. Il metodo PCR può rilevare l'RNA del virus anche nel materiale patologico decomposto.

Attualmente, sono stati sviluppati e sono ampiamente utilizzati nella pratica test di conferma (conferma), come la PCR con trascrittasi inversa (RT-PCR). Il metodo RT-PCR è altamente sensibile e più efficiente. L'RNA viene estratto dai tessuti dell'organo infetto dal virus, trascritto in cDNA, che viene poi amplificato mediante PCR. La RT-PCR richiede primer ottenuti per le regioni conservatrici del genoma del virus della rabbia. Tipicamente, vengono utilizzati geni che codificano per una nucleoproteina o una N-proteina.

Il metodo PCR è altamente specifico e molto sensibile. È uno dei test più accurati per la rilevazione dell'antigene della rabbia; consente di diagnosticare la rabbia anche se nel materiale è presente almeno un virione. Il test si basa sul completamento complementare dello stampo di RNA, effettuato in vitro utilizzando l'enzima RNA polimerasi. Negli ultimi anni, la PCR è stata sempre più utilizzata per diagnosticare e monitorare le infezioni virali. Tuttavia, la tecnica è complessa, costosa e non ancora sufficientemente unificata per l’uso di routine.

I metodi citologici hanno attualmente un valore diagnostico limitato, ma dovrebbero ancora essere utilizzati in una serie di infezioni. Vengono esaminati materiali autoptici, biopsie, strisci che, dopo un'adeguata lavorazione, vengono colorati e analizzati al microscopio. Nella rabbia si tratta della rilevazione di inclusioni nel citoplasma delle cellule (corpi di Babes-Negri).

Isolamento del virus. L'isolamento del virus può essere necessario per confermare i risultati dei test antigenici e per caratterizzare ulteriormente gli isolati. E sebbene questo metodo sia uno dei metodi diagnostici più antichi e dispendiosi in termini di tempo, oggi l'isolamento del virus con successiva identificazione utilizzando uno dei metodi moderni (ELISA con anticorpi monoclonali o PCR) è il metodo diagnostico più affidabile, il cosiddetto. "standard d'oro".

L'efficacia dei metodi diagnostici della rabbia può variare in base a una serie di fattori (stadio della malattia, tempi di campionamento del materiale, qualità dei campioni ottenuti, condizioni di conservazione, esperienza del personale, qualità dei reagenti, ecc.). Se un risultato positivo conferma la rabbia, un risultato negativo non indica sempre l'assenza della malattia. Pertanto, per la rabbia, gli esperti dell'OMS raccomandano l'uso di diversi test, in particolare l'MFA in combinazione con un test biologico su topi bianchi neonati (di 2-3 giorni).

Misure di prevenzione personale

Tutti i lavori con materiale sospettato di contenere il virus della rabbia, nonché con animali sospettati di avere la rabbia, devono essere eseguiti nel rispetto delle misure di sicurezza personale. Gli operatori sanitari e i veterinari devono lavorare indossando camici, guanti e maschere.

Alla fine del lavoro le scatole vengono trattate con una soluzione di perossido di idrogeno al 3%.

Fiale, fiale e strumenti, nonché i rimanenti materiali contenenti il ​​virus della rabbia e tutti gli utensili dopo il lavoro vengono disinfettati in autoclave per 1 ora a 1,5 atm (modalità kill).

I dispositivi di protezione individuale vengono disinfettati mediante bollitura o autoclavaggio. La superficie di lavoro del tavolo e delle mani viene disinfettata con una soluzione disinfettante (soluzione di cloramina allo 0,5%).

ISTRUZIONI METODOLOGICHE
DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLA RABIA

1. La diagnosi di rabbia viene effettuata sulla base di un complesso di dati epizootologici, clinici, patoanatomici e principalmente sulla base di test di laboratorio.

2. Per la ricerca, vengono inviati al laboratorio tramite corriere: un cadavere fresco o la testa di un cane (gatto, volpe, volpe artica, pecora, vitello, ecc.), di animali di grandi dimensioni - una testa o un cervello (fresco o in scatola in soluzione di glicerina al 30 - 50%). Solo i cervelli non conservati sono adatti per gli studi sierologici.

3. La diagnostica di laboratorio della rabbia consiste nell'esame microscopico del cervello (per rilevare i corpi di Babes-Negri), nell'esame sierologico (rilevamento di uno specifico antigene della rabbia), nonché nell'impostazione di un test biologico su topi bianchi o conigli .

Ordine di ricerca.

4. Dal cervello ricevuto per lo studio, vengono prima seminati su terreni nutritivi. Una parte del cervello viene immediatamente posta in frigorifero e conservata in caso di necessità di riesame. Il materiale viene prelevato dal resto del cervello per l'esame microscopico, le reazioni sierologiche e un campione biologico.

Nota. L'autopsia, la rimozione del cervello e altri lavori vengono eseguiti in condizioni sterili nel rigoroso rispetto delle misure di prevenzione personale (forte fissazione della testa dell'animale, protezione delle mani con due paia di guanti: chirurgico e anatomico; vengono indossati occhiali protettivi proteggere gli occhi e coprire il naso e la bocca con una benda di garza).

I. STUDI MICROSCOPICI

5. Per l'esame microscopico, vengono effettuate impronte e strisci da diverse parti del cervello.

6. Per preparare un'impronta, pezzi di cervello (corno di Ammon, corteccia cerebrale, cervelletto, midollo allungato) vengono posizionati su carta da filtro piegata in 4-6 strati. La superficie tagliata viene toccata più volte (3 - 4) di seguito con un vetrino pulito, premendo leggermente per lasciare una sottile impronta sul vetro.

7. Gli strisci vengono effettuati dalle stesse aree del cervello. Per fare questo, pezzi di cervello vengono macinati in un mortaio di porcellana con un pestello o in una provetta con una bacchetta di vetro fino a formare una massa omogenea, dalla quale vengono realizzati strisci grossolani su un vetrino di vetro sgrassato.

Puoi fare le sbavature in un altro modo. Per fare questo, un piccolo pezzo di cervello viene posto sul bordo di un vetrino, schiacciato con un altro vetro e spalmato da un bordo all'altro, in modo da ottenere una sottile macchia uniforme sulla superficie del vetrino. bicchiere.

8. Le macchie o le stampe risultanti vengono macchiate in uno dei seguenti modi:

a) colorazione secondo Muromtsev. Gli strisci o le stampe realizzate, ancora umide, vengono immediatamente fissate in alcool etilico o metilico o in una miscela di alcool a metà con etere o acetone (chimicamente puro) per 1-2 ore e poi lavate con acqua. Il contenitore del fissativo deve essere ben chiuso per evitare l'evaporazione del liquido fissativo. Dopo il lavaggio con acqua, gli strisci bagnati vengono posti per 5-10 minuti in una soluzione di vernice Munson, diluita con acqua 1:40. Successivamente si fa scolare la vernice e subito si immergono gli strisci in una soluzione acquosa di tannino al 10% per 8-10 minuti fino alla comparsa di un colore bluastro. Successivamente gli strisci vengono lavati con acqua, asciugati con carta da filtro, fatti passare attraverso una miscela di parti uguali di alcool con acetone (chimicamente puro) o alcool con xilene e nuovamente asciugati con carta da filtro. Lo striscio colorato dovrebbe avere uno sfondo azzurro, mentre i nuclei delle cellule nervose sono colorati di blu, e i corpi di Babesh-Negri sono viola pallido con inclusioni scure;

b) Macchia dei venditori. Sulla stampa bagnata o sullo striscio preparato, applicare per 4 - s una miscela di reagente "A" (blu di metilene - 2 g, alcool metilico senza acetone - 100 ml) e reagente "B" (fucsina basica - 0,5 g, alcool etilico senza tracce di acetone - 100 ml). La soluzione di lavoro del colorante è composta da 15 ml di reagente "A", 2 - 4 ml di reagente "B" e 25 ml di alcol metilico. Dopo la colorazione il preparato viene lavato con acqua corrente ed asciugato. Nello striscio colorato, il citoplasma dei neuroni è blu brillante, i nucleoli sono blu scuro, gli eritrociti sono rosso mattone, i corpi di Babesh-Negri sono rosso porpora con una struttura basofila dei corpi chiaramente visibile;

c) colorazione secondo Mikhin. Le macchie o le impronte vengono fissate in una miscela di alcool ed etere (ugualmente) per 5-10 minuti, dopodiché vengono asciugate con carta da filtro e colorate per 30-40 minuti con vernice Giemsa (1-2 gocce per 1 ml di acqua distillata ), lavato rapidamente con alcool acidificato (1 goccia di acido acetico glaciale per 30 ml di alcool a 96°), e poi con acqua, asciugato con carta da filtro e sottoposto a ricerca. Se il materiale era in glicerina, viene pre-sciacquato bene in acqua e asciugato con carta da filtro.

In una preparazione colorata, all'esame microscopico, lo sfondo principale dovrebbe essere rosso con una sfumatura viola. Con la predominanza del tono blu, lo striscio viene nuovamente lavato con alcool acidificato e lavato con acqua. Le cellule nervose piramidali hanno un colore bluastro con un nucleo intensamente nero, mentre i corpi di Babesh-Negri sono rosa-rossi con inclusioni punteggiate di blu scuro;

d) colorazione secondo Bormann-Gainullina. Strisci o impronte sottili vengono fissati per 5 minuti in una miscela della seguente composizione: alcool ed etere (ugualmente) - 98 ml, acido acetico glaciale - 2 ml; dopo il fissaggio vengono immersi per 5 minuti in una soluzione di soda cristallina al 10%, quindi lavati con acqua ed essiccati all'aria. Gli strisci fissati vengono colorati per 2 minuti con la vernice preparata prima dell'uso (soluzione acquosa satura di blu di metilene - 3 gocce, soluzione basica satura di fucsina - 2 gocce, acqua di rubinetto - 20 ml). La soluzione di vernice viene versata su uno striscio, fissato sulla fiamma di un bruciatore, quindi la vernice viene lasciata per un altro minuto, dopodiché viene lavata con acqua e asciugata con carta da filtro. In uno striscio colorato, lo sfondo principale dovrebbe essere rosso vivo, il protoplasma delle cellule nervose è colorato di blu-rossastro e i loro nuclei sono blu scuro, i corpi di Babes-Negri sono colorati di rosso fragola con una struttura tipicamente granulare. Gli eritrociti sembrano cerchi non colorati.

II. STUDI SIEROLOGICI

9. Reazione di precipitazione diffusa in gel di agar. La reazione viene utilizzata per rilevare un antigene specifico della rabbia nel cervello non conservato di animali morti di rabbia stradale, nonché negli animali su cui è stato eseguito un test biologico. Per la reazione, puoi utilizzare un cervello stantio (fino a 1 mese).

La reazione viene condotta su vetrini scremati, sui quali vengono applicati 2,5 ml di gel di agar sciolto e raffreddato a 60°C, preparato secondo la prescrizione: agar-agar secco - 12 - 15 g; cloruro di sodio chimicamente puro - 8,6 g; Soluzione all'1% (filtrata) di arancio metilico su alcool a 50° - 5 - 10 ml; mertiolato - 0,01 g; acqua distillata - 1 l.

Nota. Per impostare la reazione è meglio usare l'agar-agar Difko, si dissolve completamente, non è necessaria la filtrazione del mezzo. Altre varietà di agar-agar richiedono un'attenta filtrazione.

Dopo che l'agar si è solidificato, vengono praticati dei fori utilizzando un tubo di metallo o di vetro a pareti sottili con un diametro interno di 4-5 mm, disponendoli secondo lo stencil (vedere Fig. -).

Per la reazione negli animali di grandi dimensioni vengono utilizzati pezzi di cervello: il corno di ammonio, la corteccia degli emisferi, il cervelletto, il midollo allungato; nei ratti, roditori, porcellini d'India, criceti, ecc. - tre parti qualsiasi del cervello; i topi hanno l'intero cervello.

Schema di installazione della microprecipitazione:
UN - corteccia (emisfero sinistro); IN- corteccia (emisfero destro); CON- corno di ammonio (a sinistra);
D- corno di ammonio (a destra); E- cervelletto; E- midollo;
1 , 2 , 3 , 4 - diluizioni di globuline rispettivamente 1:2, 1:4, 1:8, 1:16.

RP positivo con tutte le diluizioni di globulina
(corteccia cerebrale di pecora, rabbia di strada)

RP positivo con diluizioni di globulina 1:4; 1:8, 1:16
(corno di cane ammon, rabbia di strada)

RP positivo con diluizioni di globulina 1:16,
non sono presenti linee di precipitazione con diluizioni 1:2, 1:4,
(cane midollo allungato, rabbia di strada)

Il cervello viene macinato in un mortaio di porcellana con un pestello o nel cranio stesso fino a formare una "pasta", che viene riempita di pozzetti per l'antigene. I restanti pozzetti vengono riempiti con globulina antirabbica precipitante ad una diluizione di 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. Il volume degli ingredienti utilizzati è 0,02 ml.

I controlli con antigeni positivi e negativi vengono posizionati contemporaneamente su un vetrino separato utilizzando lo stesso agar utilizzando lo stesso stencil.

Dopo aver posizionato gli ingredienti della reazione negli appositi pozzetti, i vetrini vengono trasferiti in una camera umida (piastre Petri con carta da filtro bagnata o cotone idrofilo) e posti in un termostato per 6 ore ad una temperatura di 37-38 °C. Le stoviglie vengono poi lasciate a temperatura ambiente per altre 18 ore.

La contabilizzazione della reazione viene effettuata 3, 6 e 24 ore dopo la sua presa. Per evitare che l'agar si secchi, i vetrini di reazione vengono posti nelle stesse piastre Petri contenenti cotone idrofilo inumidito dopo ogni osservazione.

Con una reazione di precipitazione su agar positiva, si possono formare una, due e molto raramente tre linee di precipitazione parallele tra i pozzetti con globulina e antigene. Le linee di precipitazione risultanti sono visivamente visibili quando gli occhiali sono illuminati con un illuminatore dal basso verso l'alto con un angolo di circa 45°.

Con indicazioni negative della reazione di precipitazione, viene effettuato un test biologico.

10. Reazione di immunofluorescenza. Si basa sulla rilevazione mediante microscopi speciali (ML-1, ML-2, ML-3, ecc.) di un antigene virale che ha reagito con uno specifico siero antirabbico marcato con un colorante fluorescente.

Per la reazione, vengono realizzate stampe sottili e a strati uguali su vetri accuratamente sgrassati di cervello fresco o appena congelato. Le impronte vengono preparate da pezzi di cervello (corno di Ammon, corteccia cerebrale, cervelletto, midollo allungato) allo stesso modo dell'esame microscopico. Da ogni pezzo di cervello vengono preparati almeno 4 preparati. Per il controllo, i farmaci vengono prodotti in modo simile dal cervello di un animale sano.

Dopo essiccamento all'aria, i preparati vengono fissati in acetone per 4 ore ad una temperatura non superiore a 4°C. Il contenitore del fissativo deve essere ben chiuso per evitare l'evaporazione del liquido fissativo. Dopo aver fissato con acetone, applicare sui preparati alcune gocce del coniugato (gammaglobuline antirabbica fluorescenti) in diluizione di lavoro. Successivamente vengono posti in una camera umida (piastra Petri o cuvetta smaltata chiusa con fondo inumidito) per 20 - 30 minuti ad una temperatura di 25 °C.

Successivamente, i preparati vengono lavati con acqua o soluzione tampone fosfato (pH 7,2 - 7,4) per 1 ora, quindi risciacquati con acqua distillata, essiccati all'aria e sottoposti a ricerca. Le preparazioni vengono visionate con il sistema ad immersione. Per l'immersione viene utilizzato olio non luminescente.

In una preparazione colorata, al microscopio a fluorescenza, il tessuto cerebrale diventa fluorescente (si illumina) con un colore giallo-grigiastro opaco. L'antigene del virus della rabbia viene rilevato nei preparati sotto forma di granuli di colore verde-giallastro o verde brillante di varie forme e dimensioni, da appena percettibili a con un diametro di 15-20 micron.

Nella preparazione di controllo non si osservano granuli giallo-verdi intensamente luminosi.

Nello studio con il metodo degli anticorpi fluorescenti, la diagnosi di rabbia è considerata stabilita se in diversi campi visivi del microscopio si trova un numero sufficiente (almeno 10) di granuli tipici con un bagliore verdastro brillante di varie dimensioni. Nel controllo di tali formazioni non dovrebbe essere.

In assenza di fluorescenza positiva, viene posizionato un campione biologico.

III. CAMPIONE BIOLOGICO

11. Un test biologico per la rabbia viene effettuato se si ottiene un risultato negativo durante l'esame microscopico (non vengono rilevati corpi di Babes-Negri), con reazioni sierologiche (non viene rilevato l'antigene specifico della rabbia), nonché quando vengono rilevate inclusioni atipiche. Il test biologico viene effettuato su topi bianchi o conigli.

12. Topi o conigli sperimentali vengono infettati con una sospensione al 10% del cervello testato in soluzione salina o brodo di carne e peptone con un pH compreso tra 7,2 e 7,4. Per preparare la sospensione vengono utilizzate le stesse parti del cervello da cui è stato prelevato il materiale per gli studi microscopici e sierologici.

Le aree escisse del cervello vengono raccolte in una provetta sterile e pesate, quindi macinate accuratamente in un mortaio con un pestello, dopodiché viene aggiunta soluzione salina fisiologica o brodo di carne e peptone per ottenere una sospensione al 10%. La sospensione risultante viene lasciata riposare per 10 minuti e il surnatante viene utilizzato per l'infezione.

Se il materiale patologico è stato contaminato, il surnatante viene versato in un altro recipiente (provetta) e vengono aggiunti 500-1000 UI di penicillina e streptomicina per 1 ml di liquido, dopo di che viene lasciato riposare per altri 30 minuti a temperatura ambiente e poi utilizzato per l'infezione. La sospensione deve essere preparata in condizioni sterili e nel rigoroso rispetto delle regole di prevenzione personale.

Test biologico su topi bianchi. Per l'infezione vengono utilizzati topi bianchi del peso di 8-10 g, per ogni studio vengono prelevati 6 topi, di cui 3 infetti nel cervello e 3 per via sottocutanea. Quando si infetta il cervello, l'ago viene inserito in un punto dietro la linea che collega gli angoli posteriori e leggermente lontano dalla linea che corre al centro della testa. Il sito dell'infezione viene pulito con alcol. La sospensione viene somministrata alla dose di 0,03 ml. Per impedire la penetrazione profonda dell'ago nel cervello, sulla punta viene posizionato un limitatore: un piccolo pezzo di tubo di gomma, che viene fissato a una distanza di 2-3 mm dall'estremità dell'ago. In caso di infezione sottocutanea, la sospensione viene iniettata nella regione della punta del naso (labbro superiore) alla dose di 0,05 ml. Si forma un piccolo gonfiore nel sito di iniezione. I topi infetti vengono posti in barattoli di vetro e osservati per 30 giorni. Con un risultato positivo di un test biologico sui topi, di solito tra il 7° e il 15° giorno dopo l'infezione, si sviluppa una clinica di rabbia paralitica.

Inizialmente si notano letargia, pelo arruffato e una sorta di gobba, oltre a una ridotta coordinazione dei movimenti. Poi arriva la paralisi degli arti posteriori e, successivamente, quella anteriore, che si trasforma in paralisi generale, che termina con la morte. La durata della malattia è di 2-3 giorni.

Con lo sviluppo della paralisi generale, i topi vengono sacrificati utilizzando l'anestesia con etere o cloroformio. Nei topi morti e uccisi, la cavità cranica viene aperta, il cervello viene inoculato su mezzi nutritivi, dopo di che il cervello viene rimosso, da cui vengono preparati i preparati per studi microscopici e immunobiologici.

In assenza di manifestazioni cliniche di rabbia nei topi infetti, vengono distrutti entro 30 giorni. I barattoli in cui erano conservati vengono accuratamente disinfettati.

Test biologico sui conigli. Per costituire un campione biologico vengono prelevati 4 conigli del peso di almeno 1,5 kg ciascuno. 2 conigli sono infetti al cervello e 2 per via intramuscolare nella zona della coscia. La sospensione viene somministrata per via intracerebrale alla dose di 0,2 ml e per via intramuscolare alla dose di 2 ml.

Con un risultato positivo del test biologico, i conigli si ammalano entro 16-21 giorni. La malattia della rabbia si manifesta nei conigli in forma paralitica silenziosa con esito fatale. Nei conigli morti, il cervello viene rimosso e vengono eseguite ulteriori ricerche allo stesso modo di quando si infettano i topi. I conigli vengono osservati per 45-50 giorni. Dopo il periodo specificato, i conigli vengono distrutti. Le gabbie in cui sono stati tenuti gli animali da esperimento vengono disinfettate.

IV. ESAME ISTOLOGICO 1

1 L'esame istologico viene utilizzato come metodo aggiuntivo

Per l'esame istologico, vengono prelevati pezzi di corno di Ammon, corteccia cerebrale, cervelletto, midollo allungato e fissati in una o due porzioni di acetone in modo che la durata della fissazione sia entro 6-18 ore.

È meglio lasciare il fissaggio in acetone durante la notte. Quindi il materiale patologico viene fatto passare attraverso due porzioni di xilene, trattenute per 30 minuti ciascuna, e attraverso due porzioni di paraffina - 1 ora ciascuna. Le sezioni pronte vengono deparaffinate con il metodo consueto e colorate secondo Lenz o Turevich:

La colorazione secondo Lenz. Le sezioni vengono colorate con una soluzione di eosina per 1-3 minuti (0,5 g di eosina vengono sciolti in 100 ml di alcol etilico al 60%). L'eosina viene rapidamente lavata via con acqua e colorata con blu di metilene di Lefleur per 1 minuto, lavata con acqua, asciugata accuratamente con carta da filtro e differenziata con una soluzione di unità. cui sodio in alcool assoluto (5 gocce di soda caustica per 30 ml di alcool) fino ad un colore rosa pallido. Sul preparato si versa una soluzione di acido acetico (1 goccia di acido acetico glaciale per 60 ml di alcool assoluto) e si mantiene fino alla comparsa di un tenue colore azzurro, si lava rapidamente con alcool e si chiarisce con xilene per 4-5 minuti. I corpi di Babesh-Negri sono colorati di rosso vivo con inclusioni blu, il citoplasma delle cellule gangliari è azzurro pallido;

Colorazione secondo Turevich. Le sezioni deparaffinate immediatamente dopo il passaggio attraverso alcoli e acqua distillata vengono colorate con ematossilina di Weigert o Ehrlich, lavate con acqua distillata. Quindi colorati con una soluzione acquosa all'1% di fucsina acida per 1 minuto e lavati accuratamente con acqua distillata fino alla comparsa di una tonalità rosa pallido. Dopo il lavaggio si tratta con una miscela (in parti uguali) di una soluzione acquosa satura di acido picrico (25-30 g di acido picrico per 1 litro di acqua distillata calda) e alcool al 96%. Durante la lavorazione si osserva la fuoriuscita di nuvole di vernice rossa e le sezioni acquisiscono una tinta gialla dopo 10-20 s. Le sezioni vengono sciacquate rapidamente in acqua e asciugate leggermente con carta da filtro. Poi, altrettanto velocemente, viene fatto passare attraverso alcol assoluto o 96°, carbol-xilene, xilene puro e posto in un balsamo. I corpi di Babesh-Negri sono rosso ciliegia, i nuclei delle cellule sono neri o blu, a seconda dell'ematossilina con cui sono colorati. La forma e le dimensioni dei corpi di Babesh-Negri sono molto diverse, si trovano nel citoplasma e nei processi delle cellule nervose sotto forma di numerose o singole copie. Più spesso, i corpi di Babes-Negri si trovano in grandi cellule gangliari e le cellule che li contengono non presentano segni pronunciati di degenerazione.

Spesso si trovano altre inclusioni che, a causa di una serie di caratteristiche simili, vengono talvolta scambiate per corpi di Negri. Va tenuto presente che il cervello dei gatti sani e dei topi bianchi talvolta contiene corpi inclusi acidofili non specifici. Questi corpi si differenziano dai corpi Negri per l'assenza di granuli interni e per l'omogeneità della sostanza principale.

La rabbia è caratterizzata anche da segni di encefalomielite acuta: prevalentemente intorno alle piccole vene si trovano infiltrati perivascolari, costituiti principalmente da cellule linfoidi che assomigliano a manicotti cellulari.

Nelle cellule gangliari del cervello possono verificarsi cromatolisi, vacuolizzazione e gonfiore acuto delle cellule, nonché la morte di singole cellule. Nell'area delle cellule nervose danneggiate, la reazione proliferativa della glia è abbastanza costante, assumendo la forma di una vera neuronofagia, seguita dalla sostituzione delle cellule nervose con elementi della glia moltiplicata. Un tale accumulo di cellule proliferanti nel sito di una cellula nervosa disintegrata è chiamato "nodulo della rabbia" - a volte il processo di sviluppo del nodulo può essere tracciato su un'area (1).

La rabbia è una malattia virale estremamente pericolosa caratterizzata da gravi danni al cervello e al midollo spinale. Spesso finisce con la morte.

La rabbia si manifesta in tutti i mammiferi e si trasmette attraverso i fluidi corporei, principalmente la saliva. Una persona di solito ne viene infettata a seguito del morso di un animale infetto, molto spesso un cane, gatto, coniglio, furetto, volpe, lupo, procione, pipistrello, ecc.

Nella fase iniziale, la malattia si manifesta con un aumento della salivazione e della paura dell'acqua, nonché uno stato depressivo, che viene sostituito da attacchi di aggressività e eccitazione.

Le persone a rischio di sviluppare la rabbia devono essere vaccinate.

Sfortunatamente, la comparsa dei sintomi della malattia termina inevitabilmente con la morte, quindi il trattamento consiste solo nell'alleviare le condizioni del paziente.

Sinonimi russi

Rabbia, idrofobia, rabbia.

Sinonimi inglesi

Rabbia, idrofobia, follia canina, Lyssa, follia.

Sintomi

La rabbia solitamente non provoca sintomi fino all’ultimo stadio della malattia, quando il trattamento non è più possibile. Il periodo di incubazione (dall'infezione alla comparsa dei sintomi) varia da 7 giorni a 1 anno, con una media di 20-90 giorni. I segni della malattia compaiono spesso pochi giorni prima della morte del paziente:

• prima della comparsa dei sintomi principali, possono verificarsi gonfiore, arrossamento, prurito nella sede del morso,
• febbre,
• mal di testa, malessere,
• perdita di appetito, nausea, vomito, diarrea,
• ansia, disturbi del sonno,
• depressione,
• maggiore sensibilità agli stimoli uditivi, visivi,
• lo stato di coscienza depresso, l'ansia, l'apatia sono sostituiti da attacchi di eccitazione, ansia, aggressività. Gli attacchi di eccitazione sono accompagnati da un aumento della respirazione e del battito cardiaco,
• disturbi della respirazione e della deglutizione,
• idrofobia - paura dell'acqua (quando ne parla o cerca di bere, il paziente sperimenta orrore, ha spasmi dolorosi della faringe e della laringe),
• salivazione eccessiva,
• allucinazioni,
• convulsioni,
• paralisi parziale.

Informazioni generali sulla malattia

La rabbia è una pericolosa malattia virale caratterizzata da gravi danni al sistema nervoso centrale (cervello e midollo spinale). Nella fase iniziale è asintomatico, i sintomi compaiono in una fase tardiva, quando il trattamento non è più possibile.

La prevalenza della rabbia dipende dal grado di vaccinazione degli animali domestici. È più comune nelle zone rurali e si verifica più spesso in estate.

La rabbia può colpire tutti i mammiferi e si trasmette attraverso i fluidi corporei, principalmente la saliva. Nell'uomo, l'infezione da rabbia, di regola, si verifica a seguito del morso di un animale infetto, del contatto con la saliva di un animale infetto sulla pelle danneggiata, sulle mucose della bocca, del naso e degli occhi. Molto meno spesso la rabbia viene trasmessa mangiando carne infetta. La malattia non si trasmette da persona a persona, l'infezione attraverso il trapianto di organi da donatori infetti può essere estremamente rara.

Molto spesso, una persona viene infettata da animali domestici - cani, gatti, conigli, cavalli, furetti, meno spesso da animali selvatici - volpi, cani procione, lupi, procioni, pipistrelli, ecc. Gli animali selvatici, a loro volta, infettano gli animali domestici con la rabbia.

Dopo che il virus è entrato nel corpo attraverso la pelle o la mucosa, raggiunge il midollo spinale e il cervello lungo le fibre nervose, dove si fissa e inizia a dividersi. Si verifica l'encefalite: infiammazione del cervello. Ciò porta ad un aumento dell'eccitabilità riflessa e allo sviluppo della paralisi. Quindi il virus si diffonde lungo le fibre nervose nella direzione opposta, penetrando nel fegato, nei reni, nelle ghiandole surrenali, nella pelle, nel cuore, nelle ghiandole salivari, nello scheletro, provocando l'interruzione del sistema nervoso e la disfunzione di vari organi.

La velocità di diffusione del virus dipende dalla posizione del morso (con morsi della testa, delle mani, sarà alto), dalla sua profondità, dal numero di agenti patogeni penetrati nella ferita, dall'attività dei microrganismi e sullo stato immunitario della persona infetta.

Il periodo di incubazione della malattia è in media di 20-90 giorni, ma può variare da una settimana a un anno. Quando compaiono i sintomi, la morte è solitamente inevitabile.

La morte di solito avviene a causa di un danno al centro respiratorio, che comporta l'arresto respiratorio.

Chi è a rischio?

• Morso da animali domestici o selvatici.
• Residenti in zone rurali che tengono in casa animali non vaccinati contro la rabbia.
• Viaggiatori nei paesi in via di sviluppo (Africa, Sud-Est asiatico).
• Viaggiare nella natura e entrare in contatto con animali selvatici (volpi, procioni, pipistrelli, ecc.)
• Cacciatori, cacciatori di trappole.
• Dipendenti di zoo, asili nido, rifugi per animali.
• Veterinari.
• Lavorare con il virus della rabbia in laboratorio.

Diagnostica

La diagnosi di "rabbia" si presume in presenza di sintomi della malattia dopo un morso di animale ed è confermata dall'esame di un campione di pelle prelevato dalla parte posteriore della testa, dalla liberazione del virus dalla saliva, dal liquido lacrimale e cerebrospinale.

Ricerca di laboratorio

• Emocromo completo (senza formula leucocitaria e VES). Il livello dei leucociti può essere elevato.
• Analisi generale delle urine. Nella rabbia può verificarsi un aumento significativo del numero di leucociti nelle urine in assenza di infiammazione batterica.
• Un esame del sangue volto a determinare gli anticorpi contro l'agente eziologico della rabbia. Durante l'analisi, mediante una speciale colorazione immunofluorescente, viene rilevata la presenza nel sangue di molecole prodotte dal sistema immunitario in risposta all'ingestione del virus della rabbia. La diagnosi è confermata da un aumento significativo (4 o più volte) del numero (titolo) degli anticorpi contro il virus della rabbia in pazienti che non sono stati vaccinati.

• Determinazione dell'agente eziologico della rabbia nei fluidi biologici e nei tessuti corporei.
  • Lo studio di campioni bioptici (frammenti di tessuto) della pelle della parte posteriore della testa, impronte della cornea. Al materiale risultante vengono aggiunti anticorpi marcati (molecole che si legano specificamente alla molecola del virus della rabbia). Sotto l'influenza della radiazione ultravioletta, il complesso di virus "incollati" con anticorpi conferisce un caratteristico bagliore verdastro, che indica la presenza del virus della rabbia nel materiale prelevato. Questa analisi è più affidabile durante la prima settimana di malattia.
  • Lo studio del materiale genetico del virus mediante reazione a catena della polimerasi (PCR). Possono essere utilizzati saliva, sangue, liquido cerebrospinale e tessuti interessati. L'affidabilità dei risultati si avvicina al 100%.
  • Lo studio del tessuto cerebrale durante la microscopia elettronica. Viene prelevato un pezzo di tessuto cerebrale (biopsia), che viene poi sottoposto a una colorazione speciale ed esaminato al microscopio elettronico, che consente di ottenere un grado di ingrandimento molto elevato. Allo stesso tempo, nelle cellule del tessuto nervoso colpito dal virus della rabbia vengono isolate inclusioni speciali o viene rilevato il virus stesso.

Altri metodi di ricerca

• L'elettroencefalografia (EEG) è un metodo che valuta i potenziali elettrici del cervello.

Trattamento

Non esiste un trattamento specifico per la rabbia. Di norma, la malattia è incurabile e porta alla morte.

Quando viene morso da un animale selvatico, vengono eseguiti il ​​lavaggio, un attento esame per la presenza di corpi estranei (come denti rotti) e lo sbrigliamento chirurgico. Quindi vengono introdotte con urgenza le immunoglobuline: cellule speciali del sistema immunitario. Quindi, entro due settimane, il paziente viene vaccinato (vengono utilizzati 5 vaccini in totale). Questo è l’unico modo per prevenire la malattia.

Dopo un morso, l'animale deve essere tenuto in osservazione per circa 10 giorni e se compaiono sintomi di rabbia, consultare immediatamente un medico per prendere misure per immunizzare il paziente. La fonte della rabbia - un animale malato - deve essere isolata.

Il trattamento della rabbia ha lo scopo di alleviare i suoi sintomi: alleviare le convulsioni, ridurre il dolore. Per questo vengono utilizzati rispettivamente farmaci anticonvulsivanti, analgesici e sedativi.

Per ridurre il contatto con potenziali sostanze irritanti, il paziente viene collocato in una stanza speciale.

Perdite di liquidi e minerali vengono reintegrati; viene effettuata la ventilazione artificiale.

Prevenzione

• Le persone a rischio di sviluppare la rabbia dovrebbero assolutamente vaccinarsi.
• Dopo il morso di un animale selvatico, lavare accuratamente la ferita con acqua e sapone e rivolgersi immediatamente a un medico per un ciclo di immunizzazione e vaccinazione contro la rabbia.
• Vaccinazione preventiva degli animali domestici.
• Gli animali domestici devono essere tenuti in casa e sorvegliati quando sono fuori. A questo scopo possono essere utilizzate gabbie e recinti chiusi. Ciò contribuirà ad evitare l'infezione degli animali domestici da quelli selvatici. Particolare attenzione dovrebbe essere prestata ai conigli, ai porcellini d'India, ai criceti e ad altri piccoli animali domestici poiché non possono essere vaccinati contro la rabbia. Spesso un animale domestico viene infettato fuori città, dove ha l'opportunità di entrare in contatto con animali selvatici, ad esempio gatti, cani possono scappare nella foresta ed entrare in contatto con roditori infetti, volpi.
• Dovresti seguire le regole di comunicazione quando incontri animali randagi: non toccarli, non accarezzarli per evitare di essere morsi.
• Evitare il contatto con animali selvatici (es. volpi, procioni). Gli animali selvatici sani evitano le persone stesse, quindi una bestia che non ha paura delle persone e non cerca di scappare dovrebbe destare sospetti.
• Il morso di un animale domestico può anche essere un motivo per consultare un medico, ad esempio, se non si sa se può essere infetto dalla rabbia, e ancor di più se l'animale muore entro pochi giorni dal morso.

• Analisi del sangue generale
• Analisi generale delle urine

Letteratura

• Dan L. Longo, Dennis L. Kasper, J. Larry Jameson, Anthony S. Fauci, I principi di medicina interna di Harrison (18a ed.), New York: McGraw-Hill Medical Publishing Division, 2011.
• Manning SE, Rupprecht CE, Fishbein D, et al. Prevenzione della rabbia umana – Stati Uniti, 2008: raccomandazioni del Comitato consultivo sulle pratiche di immunizzazione. MMWR Raccomand. 23 maggio 2008;57:1-28.
• Hemachudha T. Rabbia umana: aspetti clinici, patogenesi e potenziale terapia. Curr Top Microbiol Immunol. 1994;187:121-43.
• Gerald L. Mandell. Principi e pratica delle malattie infettive di Mandell, Douglas e Bennett: edizione premium di Expert Consult. Churchill Livingstone, 2009.

GOST26075-2013

STANDARD INTERSTATALE

ANIMALI

Metodi per la diagnosi di laboratorio della rabbia

Animali. Metodi di diagnostica di laboratorio della rabbia

Data di introduzione 2015-01-01

Prefazione

Gli obiettivi, i principi di base e la procedura di base per lo svolgimento dei lavori sulla standardizzazione interstatale sono stabiliti da GOST 1.0-92 "Sistema di standardizzazione interstatale. Disposizioni di base" e GOST 1.2-2009 "Sistema di standardizzazione interstatale. Standard, regole e raccomandazioni interstatali per la standardizzazione interstatale. Norme per lo sviluppo, l'adozione, la domanda, il rinnovo e la cancellazione

A proposito della norma

1 SVILUPPATO dall'Istituto federale di bilancio dello Stato "Centro statale panrusso per la qualità e la standardizzazione dei medicinali per animali e mangimi" (FGBU "VGNKI")

2 INTRODOTTO dall'Agenzia Federale per la Regolazione Tecnica e la Metrologia della Federazione Russa

3 ADOTTATO dal Consiglio interstatale per la standardizzazione, la metrologia e la certificazione (verbale del 27 giugno 2013 N 57-P)

Votato per accettare:

Nome abbreviato del paese secondo MK (ISO 3166) 004-97		Nome abbreviato dell'ente nazionale di normalizzazione
Armenia		Ministero dell'Economia della Repubblica d'Armenia
Bielorussia		Stendardo statale della Repubblica di Bielorussia
Kirghizistan		Standard kirghiso
Moldavia		Standard Moldavia
Russia		Rosstandart
Uzbekistan		Uzstandard

4 Con ordinanza dell'Agenzia federale per la regolamentazione tecnica e la metrologia del 30 settembre 2013 N 1127-st, la norma interstatale GOST 26075-2013 è entrata in vigore come norma nazionale della Federazione Russa dal 1 gennaio 2015

5 INVECE DI GOST 26075-84


Le informazioni sulle modifiche a questo standard sono pubblicate nell'indice informativo pubblicato annualmente "Norme nazionali" e il testo delle modifiche e degli emendamenti - nell'indice informativo pubblicato mensilmente "Norme nazionali". In caso di revisione (sostituzione) o cancellazione della presente norma, un avviso corrispondente sarà pubblicato nell'indice informativo pubblicato mensilmente "Norme nazionali". Informazioni, notifiche e testi rilevanti sono pubblicati anche nel sistema informativo pubblico - sul sito web ufficiale dell'Agenzia federale per la regolamentazione tecnica e la metrologia su Internet

1 zona di utilizzo

1 zona di utilizzo

La norma si applica a tutte le specie di mammiferi e stabilisce i seguenti metodi per la diagnosi di laboratorio della rabbia:

- metodo degli anticorpi fluorescenti (MFA);

- un metodo per isolare il virus della rabbia in una coltura cellulare di neuroblastoma di topo CCL-131 (o neurinoma del ganglio di Gasser del ratto - NGUK-1);

- saggio biologico su topi bianchi;

- metodo di dosaggio immunoenzimatico (ELISA);

- reazione di precipitazione per diffusione (RDP).

Appunti

1 Questi metodi sono applicabili a tutti i membri del genere Lyssavirus.

2 Il virus della rabbia di strada appartiene a microrganismi della 2a classe di patogenicità (rappresenta un pericolo mortale per l'uomo e gli animali).

3 Se è necessario genotipizzare il virus della rabbia utilizzando sistemi di test già pronti, viene utilizzato il metodo della reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa (RT-PCR).

2 Riferimenti normativi

Questo standard utilizza riferimenti normativi ai seguenti standard:

GOST ISO/IEC 17025-2009 Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e taratura

GOST 12.0.004-90 Sistema di standard di sicurezza sul lavoro. Organizzazione della formazione sulla sicurezza del lavoro. Disposizioni generali

GOST 12.1.005-88 Sistema di norme sulla sicurezza del lavoro. Requisiti sanitari e igienici generali per l'aria dell'area di lavoro

GOST 12.1.008-76 Sistema di standard di sicurezza sul lavoro. sicurezza biologica. Requisiti generali

GOST 12.4.011-89 Sistema di norme sulla sicurezza del lavoro. Mezzi di tutela per i lavoratori. Requisiti generali e classificazione

GOST 17.0.0.01-76 Sistema di standard nel campo della protezione della natura e del miglioramento dell'uso delle risorse naturali. Punti chiave

GOST 177-88 Perossido di idrogeno. Specifiche

Reagenti GOST 2603-79. Acetone. Specifiche

GOST 2768-84 Acetone tecnico. Specifiche

Reagenti GOST 4204-77. Acido solforico. Specifiche

GOST 6709-72 Acqua distillata. Specifiche.

GOST ISO 7218-2011 Microbiologia degli alimenti e dei mangimi. Requisiti generali e raccomandazioni per gli studi microbiologici

GOST 8074-82 Microscopi strumentali. Tipi, parametri di base e dimensioni. Requisiti tecnici.

GOST 9147-80 Vetreria e attrezzature in porcellana da laboratorio. Specifiche

GOST 9284-75 Vetrini per micropreparazioni. Specifiche

GOST 12026-76 Carta da filtro da laboratorio. Specifiche

GOST 13739-78 Olio da immersione per microscopia. Requisiti tecnici. Metodi di prova

GOST 16317-87 Apparecchi elettrici di refrigerazione domestici. Specifiche generali

GOST 21241-89 Pinzetta medica. Specifiche generali.

GOST 22967-90 Siringhe per iniezione medica riutilizzabili. Requisiti tecnici generali e metodi di prova

GOST 24861-91 (ISO 7886-84) Siringhe per iniezione monouso

GOST 25046-81 (ISO 7864-81) Aghi per iniezione monouso. Dimensioni principali. Requisiti tecnici. Metodi di prova

GOST 25336-82 Vetreria e attrezzature da laboratorio. Tipologie, parametri fondamentali e dimensioni

GOST 29230-91 (ISO 835-4-81) Vetreria da laboratorio. Pipette graduate. Parte 4. Pipette per soffiaggio

Nota - Quando si utilizza questo standard, è consigliabile verificare la validità degli standard di riferimento nel sistema di informazione pubblica - sul sito web ufficiale dell'Agenzia federale per la regolamentazione tecnica e la metrologia su Internet o secondo l'indice di informazione annuale "Norme nazionali" , che è stato pubblicato a partire dal 1 gennaio dell'anno in corso, e sulle questioni dell'indice informativo mensile "Norme nazionali" per l'anno in corso. Se lo standard di riferimento viene sostituito (modificato), quando si utilizza questo standard è necessario essere guidati dallo standard sostitutivo (modificato). Se la norma richiamata viene cancellata senza sostituzione, si applica la disposizione in cui è dato il riferimento alla stessa, nella misura in cui tale riferimento non viene pregiudicato.

3 Termini, definizioni e abbreviazioni

3.1 I seguenti termini sono utilizzati nel presente standard con le rispettive definizioni:

3.1.1 rabbia: Malattia infettiva dell'uomo e degli animali causata da membri della famiglia Rhabdoviridae Tipo Lyssavirus(rabdovirus), e portando alla morte nel 100% dei casi.

3.1.2 virus della rabbia: L'agente eziologico di una malattia infettiva nell'uomo e negli animali.

3.1.3 antigene del virus della rabbia: Strutture proteiche superficiali del virus della rabbia contro le quali vengono prodotti anticorpi.

3.1.2* metodo con anticorpi fluorescenti (MFA): Metodo per la rilevazione dell'antigene del virus della rabbia con anticorpi antirabbica marcati con isotiocianato di fluoresceina, con la formazione di caratteristici complessi di inclusioni luminose rilevati nel campo visivo di un microscopio a fluorescenza.
________________

3.1.3 metodo per isolare il virus della rabbia in coltura cellulare di neuroblastoma di topo CCL-131 (o neuroma del nodo di Gasser di ratto - NGUK-1): un metodo per isolare l'antigene del virus della rabbia basato sulla propagazione del virus in coltura cellulare e sulla sua identificazione mediante anticorpi fluorescenti .

3.1.3* saggio biologico: Metodo per isolare il virus della rabbia nei topi bianchi iniettando loro una sospensione di materiale patologico, seguita dall'identificazione del virus mediante il metodo degli anticorpi fluorescenti.
________________
*La numerazione corrisponde all'originale. - Nota del produttore del database.

3.1.4 test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA): Un metodo per rilevare l'antigene del virus della rabbia basato sulla sua interazione specifica con un anticorpo antirabbico immobilizzato su un supporto solido, seguita dal rilevamento dell'antigene legato utilizzando un secondo anticorpo marcato con un enzima mediante colorazione del prodotto della reazione con un cromogeno.

3.1.5 reazione di precipitazione per diffusione (RDP): Metodo per rilevare il virus della rabbia basato sulla capacità degli anticorpi e dell'antigene del virus della rabbia di diffondere in un gel di agar e, in seguito a specifica interazione, di formare un complesso antigene-anticorpo, visibile ad occhio nudo sotto forma di linea di precipitazione.

3.1.6 Reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa (RT-PCR): Metodo per rilevare il genoma del virus della rabbia traducendo una specifica sequenza di RNA del virus in DNA, seguita da ripetute copie del DNA risultante e rilevamento dei prodotti di reazione, effettuata in vitro.

3.2 Nella presente norma vengono utilizzate le seguenti abbreviazioni:

FAG - immunoglobulina antirabbica fluorescente;

AnG - globulina antirabbica;

CFG: controlla la globulina fluorescente;

PBS - soluzione tampone fosfato;

NGUK-1 - neurinoma nodo di Gasser del ratto;

FITC - isotiocinato di fluoresceina;

RNA - acido ribonucleico;

DNA - acido desossiribonucleico;

CCL-131 - coltura cellulare di neuroblastoma di topo;

OFD - ortofenildiammina;

TMB - tetrametilbenzidina.

4 Condizioni di ricerca e requisiti di sicurezza

4.1 Condizioni di ricerca

4.1.1 Requisiti generali per l'analisi microbiologica e il lavoro con microrganismi dei gruppi di patogenicità I-II - secondo GOST ISO 7218.

4.1.2 Requisiti generali per i locali - secondo GOST ISO 7218.

4.1.3 Requisiti per il personale - secondo GOST ISO 7218, GOST ISO / IEC 17025.

I dipendenti qualificati con esperienza nel lavoro con microrganismi dei gruppi di patogenicità I-II, che hanno studiato i metodi di lavoro microbiologico, vaccinati contro la rabbia, possono condurre ricerche.

4.2 Requisiti di sicurezza

4.2.1 Requisiti generali di sicurezza per il lavoro in conformità con GOST 12.1.008.

4.2.2 I dispositivi di protezione per i lavoratori devono essere conformi ai requisiti di GOST 12.4.011.

4.2.3 L'aria dell'area di lavoro deve essere conforme ai requisiti di GOST 12.1.005.

4.2.4 Formazione del personale addetto alla sicurezza sul lavoro in conformità con GOST 12.0.004.

4.2.5 Smaltimento del materiale ottenuto per lo studio, nonché dei dispositivi di protezione individuale utilizzati, degli strumenti, ecc. effettuata mediante ebollizione per 30 minuti o autoclavaggio per 15 minuti ad una pressione di (0,11 ± 0,20) MPa.

5 Strumenti di misura, attrezzature, materiali, reagenti e animali

5.1 Per uso di ricerca:

- spettrofotometro a scansione con un intervallo spettrale di lunghezze d'onda da 190 a 1100 nm con un errore non superiore a ±0,5 nm e un intervallo di misurazioni della densità ottica (OD) da 0,1 a 3,0;

- compresse per reazioni immunologiche a 96 fori;

- un termostato che mantiene la temperatura da 20 °C a 50 °C;

- frigorifero domestico, che garantisce il mantenimento della temperatura da 0 °С a 10 °С secondo GOST 16317;

- centrifuga da laboratorio;

- bagnomaria;

- microscopio luminescente invertito secondo GOST 8074;

- mortai in porcellana con pestello secondo GOST 9147 o omogeneizzatore secondo GOST ISO / IEC 17025;

- vetrini secondo GOST 9284;

- provette in vetro secondo GOST 25336;

- Piastre Petri secondo GOST 25336;

- cuvetta secondo GOST 25336;

- pipette con una capacità di 1,0; 2,0 e 10,0 cm secondo GOST 29230;

- pipette automatiche con capacità da 0,05 a 0,20 ml con puntali;

- pinzette mediche secondo GOST 21241;

- siringhe da insulina con una capacità di 1,0 cm3 secondo GOST 22967 o GOST 24861;

- aghi per iniezione secondo GOST 25046;

- bicchieri da coltura per otto fori;

- gabbie per topi;

- acetone secondo GOST 2603 o GOST 2768;

- immunoglobulina antirabbica fluorescente (FAG);

- globulina antirabbica (AnG);

- controllare la globulina fluorescente (CFG);

- olio per immersione non fluorescente secondo GOST 13739;

- acqua distillata secondo GOST 6709;

- una soluzione tampone fosfato con concentrazione molare di 0,01 mol/dm (PBS), pH 7,2-7,4;

- soluzione isotonica sterile di cloruro di sodio allo 0,9%;

- coltura cellulare di neuroblastoma murino CCL-131 o neurinoma del nodo di Gasser del ratto - NGUK-1;

- penicillina;

- streptomicina;

- Ago MEM medio con doppio corredo di aminoacidi e vitamine (DMEM), pH 7,2;

- soluzione di trypsin 0,25%;

- siero di sangue fetale di bovino per colture cellulari 10%;

-glutammina 3%:

- perossido di idrogeno 3% secondo GOST 177;

- una serie di farmaci per la diagnosi di laboratorio della rabbia animale mediante ELISA;

- una soluzione di acido solforico con concentrazione molare di 2 mol/dm secondo GOST 4204;

- carta da filtro secondo GOST 12026;

- un timbro per la preparazione dei fori;

- mertiolato;

- agar "Difko" o simili;

- una soluzione di arancio metilico all'1% in etanolo al 50%;

- antigeni positivi e negativi;

- siero o immunoglobulina antirabbica;

- topi bianchi clinicamente sani del peso di 6-8 g.

5.2 È consentito l'uso di altri strumenti di misura con caratteristiche metrologiche e apparecchiature con caratteristiche tecniche non peggiori, nonché reagenti e materiali di qualità non inferiore a quelli sopra indicati. Sono consentite stoviglie usa e getta.

6 Campionamento

6.1 Per condurre ricerche sulla presenza del virus della rabbia, al laboratorio viene inviato materiale patologico: un cadavere fresco o una testa di piccoli animali, la testa o il cervello di animali di grandi dimensioni.

6.2 Il materiale patologico selezionato per la ricerca viene confezionato in un contenitore resistente all'umidità e consegnato al laboratorio in contenitori metallici. Il materiale congelato viene posto in un criocontenitore.

6.3 Il materiale patologico è accompagnato da un documento contenente i seguenti dati: nome e indirizzo del mittente, tipologia di animale, dati anamnestici e clinici epizootologici.

6.4 Gli studi di laboratorio vengono eseguiti immediatamente dopo il ricevimento del materiale patologico.

6.5 Per la ricerca, vengono prelevati pezzi di tessuto da animali di grandi dimensioni da ciascuna parte del cervello (corna di Ammon, cervelletto, corteccia cerebrale, midollo allungato) di 0,5-1,0 cm di dimensione, il cervello di piccoli animali, come i topi, viene esaminato come un Totale.

Solo campioni di tessuto cerebrale freschi o appena congelati sono adatti per lo studio dell'MFA e per il metodo di isolamento del virus della rabbia in una coltura cellulare di neuroblastoma murino CCL-131 (o NGUK-1). I campioni di cervello animale in decomposizione (in fase di decadimento), conservati con glicerolo, fissati con alcol metilico, formalina o altri mezzi che promuovono la comparsa di fluorescenza aspecifica non sono ammessi alla ricerca.

Per l'impostazione di un test biologico è consentito utilizzare campioni di cervello conservati in una soluzione di glicerolo al 30%-50%. Non è consentito l'uso di altri conservanti. Per la conservazione, il materiale patologico può essere congelato a una temperatura non superiore a meno 10 °C.

7 Metodo con anticorpi fluorescenti (MFA)

7.1 Essenza del metodo

L'essenza del metodo degli anticorpi fluorescenti risiede nell'interazione specifica degli anticorpi antirabbici fluorescenti con l'antigene omologo del virus della rabbia. Il complesso risultante "antigene-anticorpo", marcato con FITC, viene rilevato visivamente da un caratteristico bagliore nel campo visivo quando osservato al microscopio a fluorescenza.

7.2 Preparazione allo studio

7.2.1 Preparazione del campione

7.2.1.1 Dai pezzi di tessuto selezionati secondo 6.5 su vetrini di vetro accuratamente sgrassati vengono preparati almeno tre preparati (impronte o strisci) da ciascuna parte del cervello. Se le condizioni del materiale patologico lo consentono, vengono preparate le stampe, in altri casi vengono realizzati degli strisci.

7.2.1.2 Preparazione delle stampe

Pezzi di tessuto selezionati secondo 6.5 vengono posti su carta da filtro piegata in quattro fino a sei strati. Il cervello di piccoli animali viene tagliato, catturando tutti i suoi dipartimenti, e posizionato con una pinzetta su carta da filtro piegata in quattro o sei strati. La superficie tagliata viene toccata con un vetrino, premendolo leggermente fino ad ottenere una sottile impronta sul vetro.

7.2.1.3 Preparazione degli strisci

Un pezzo di tessuto da ciascuna parte del cervello (nei piccoli animali l'intero cervello), prelevato secondo 6.5, viene macinato in un mortaio di porcellana con un pestello fino a formare una massa omogenea, dalla quale vengono realizzati strisci su vetrini.

7.2.1.4 Come controllo, si effettuano tamponi o impronte dal cervello di topi bianchi sani, esenti da rabbia e senza rabbia, come descritto ai punti 7.3.1.2 e 7.3.1.3.

7.2.1.5 Dopo la preparazione, gli strisci o le stampe vengono asciugati all'aria per 20-30 minuti, fissati in acetone refrigerato a una temperatura di 4 °C per 4-12 ore o a una temperatura di meno 20 °C per 1 ora, dopodiché vengono rimossi dall'acetone e asciugati all'aria per 10-15 minuti.

7.2.2 Preparazione dei reagenti

FAG, AnG e KFG vengono sciolti con acqua distillata al volume iniziale indicato sull'etichetta della fiala. La durata di conservazione di FAG, AnG e CPG disciolti a una temperatura di (5 ± 2) ° C non è superiore a due settimane.

Direttamente per lo studio, la quantità richiesta di FAG, Ang e CFG disciolti viene diluita con PBS alla diluizione di lavoro indicata sull'etichetta della fiala. Il giorno della preparazione vengono utilizzate diluizioni di lavoro di FAG, Ang e CPG disciolti.

7.3 Conduzione dello studio

I vetrini con preparati (strisci o impronte) secondo 7.2.1 vengono posti in una camera umida (piastra Petri o cuvetta con fondo inumidito). Quindi, una delle tre preparazioni preparate viene rivestita con FAG in una diluizione di lavoro uniformemente su tutta la superficie dello striscio o dell'impronta utilizzando una pipetta. Alla seconda preparazione viene applicata la diluizione di lavoro di KFG. La camera con i preparati viene chiusa, posta in un termostato ad una temperatura di (37 ± 1) °C e incubata per 30 minuti. Le preparazioni di controllo vengono colorate in parallelo. Al termine della colorazione, i preparati vengono lavati tre volte, immergendoli ogni volta per 10 minuti in un recipiente con PBS, risciacquati con acqua distillata ed essiccati all'aria per 20-30 minuti.

Alla terza preparazione viene applicata una diluizione di lavoro di Ang, posta in un termostato ad una temperatura di (37±1) °C e incubata per 30 minuti. Quindi il preparato viene lavato tre volte, immerso ogni volta per 10 minuti in un recipiente con PBS, risciacquato con acqua distillata, essiccato all'aria per 20–30 minuti e colorato con la diluizione di lavoro di FAG, come descritto sopra.

7.4 Gestione dei risultati

Nelle preparazioni colorate, il tessuto cerebrale non colpito dal virus della rabbia brilla di un colore giallo-grigiastro opaco.

L'antigene del virus della rabbia viene rilevato nei neuroni e nelle cellule esterne sotto forma di granuli verde brillante di varie forme e dimensioni, da appena percettibili a con un diametro di 15-20 micron. A volte c'è un gran numero di piccole particelle verde brillante (fino a 1 micron di dimensione) di forma rotonda e ovale.

La diagnosi di rabbia è considerata stabilita se nel preparato studiato si trovano tipici granuli verde-giallastri in diversi campi visivi del microscopio. Allo stesso tempo, nei preparati di controllo (in strisci o impronte del cervello di topi bianchi sani senza rabbia, colorati con FAG), così come nei preparati studiati, colorati con CFG e pretrattati con AnH e colorati con FAG, tali formazioni non dovrebbe essere.

I risultati dello studio vengono comunicati alle autorità competenti secondo la procedura vigente nel territorio dello Stato che ha adottato lo standard.

In caso di risultato negativo, gli studi vengono effettuati su 8 o 9.

8 Metodo per l'isolamento del virus della rabbia in colture cellulari di neuroblastoma murino CCL-131

8.1 Essenza del metodo

L'essenza del metodo è isolare il virus della rabbia in una coltura cellulare di neuroblastoma CCL31 o NGUK-1 di topo con la sua successiva identificazione mediante anticorpi fluorescenti.

Il metodo è un'alternativa al test biologico sui topi bianchi secondo 9.

8.2 Preparazione allo studio

8.2.1 Preparazione del campione

Pezzi di tessuto uguali, prelevati sterilmente da ciascuna parte del cervello di un piccolo animale (corna di Ammon, cervelletto, corteccia cerebrale, midollo allungato), o pezzi di tessuto da ciascuna parte del cervello di un animale di grandi dimensioni, prelevati secondo 6.5, vengono frantumati con le forbici e macinati in un mortaio o in un omogeneizzatore, aggiungendo gradualmente una soluzione isotonica sterile di cloruro di sodio allo 0,9% fino ad ottenere una sospensione al 10%. La penicillina e la streptomicina vengono aggiunte alla sospensione cerebrale rispettivamente a 100 U/cm e 1 mg/cm.

La sospensione risultante viene accuratamente miscelata e centrifugata per 5-10 minuti ad una velocità di 2000 giri al minuto. Il surnatante viene trasferito in una provetta sterile e conservato a una temperatura non superiore a 4°C fino al momento dell'uso.

8.2.2 Preparazione dei vetrini colturali

Una coltura giornaliera di cellule di neuroblastoma murino CCL-131 (o NGUK-1) viene rimossa dal matraccio di coltura utilizzando una soluzione di trypsin allo 0,25% e diluita con terreno DMEM con siero bovino fetale al 10% e glutammina al 3% fino ad una concentrazione di 210 cellule/cm . 0,1 cm3 della sospensione cellulare risultante vengono aggiunti ai pozzetti in vetro di coltura, coperti con un coperchio e posti in un incubatore umido con un contenuto del 5% ad una temperatura di (37 ± 1) ° C per 18-20 ore.

8.3 Conduzione dello studio

In due pozzetti di vetro di coltura secondo 8.2.2, vengono aggiunti 0,05 cm 3 di una sospensione da ciascuna parte del cervello. Su ciascun vetrino vengono lasciati due pozzetti per un controllo positivo e uno negativo. Come controllo positivo viene utilizzata una sospensione del cervello di un topo infetto dal virus della rabbia - ceppo CVS. Come controllo negativo viene introdotta una sospensione del cervello di un topo clinicamente sano. Il vetro di coltura viene posto in un incubatore umido con un contenuto del 5% ad una temperatura di (37 ± 1) °C per 42-48 ore.

Al termine dell'incubazione, il terreno viene rimosso dai pozzetti della vetro di coltura utilizzando una pipetta automatica, le cellule vengono lavate una volta con PBS (una soluzione da 0,2 cm viene aggiunta a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta automatica) ed essiccate in aria laminare flusso per 20-30 minuti. Successivamente, a ciascun pozzetto vengono aggiunti 0,1 cm 3 di acetone raffreddato a meno 20 °C e lasciati a temperatura ambiente per 30 minuti.

Dopo la fissazione delle cellule, il vetro di coltura viene capovolto e agitato per rimuovere l'acetone, quindi essiccato in un flusso d'aria laminare per 20–30 minuti. Utilizzando un bisturi e una pinzetta, rimuovere l'ugello di plastica e asciugare il vetro per altri 5-10 minuti. Aggiungere 0,05-0,10 cm FA a ciascun pozzetto in una diluizione di lavoro (selezionata sperimentalmente) preparata in PBS, posta in una piastra Petri bagnata e incubata a una temperatura di (37 ± 1) °C per 30 minuti.

Al termine della colorazione, i vetrini vengono lavati tre volte, immergendoli ogni volta per 10 minuti in un recipiente con PBS. Quindi i preparati vengono risciacquati con acqua distillata ed essiccati all'aria per 20-30 minuti.

L'olio da immersione non fluorescente viene applicato alle preparazioni colorate e osservato al microscopio a fluorescenza.

8.4 Gestione dei risultati

Nelle preparazioni colorate, la coltura cellulare non infettata dal virus della rabbia si illumina di un colore giallo-grigiastro opaco (controllo negativo). L'antigene del virus della rabbia viene rilevato nel citoplasma della coltura cellulare sotto forma di granuli verde brillante di varie forme e dimensioni con bordi chiari e definiti (controllo positivo).

La diagnosi di rabbia è considerata stabilita se nella preparazione del test si trovano tipici granuli giallo-verdi in diversi campi visivi del microscopio.

Se il virus della rabbia non viene rilevato nella coltura cellulare, viene fatta una diagnosi negativa.

I risultati dell'isolamento del virus della rabbia nella coltura cellulare sono definitivi, non vengono condotti ulteriori studi.

9 Test biologico su topi bianchi

9.1 Essenza del metodo

L'essenza del metodo risiede nell'isolamento del virus della rabbia mediante iniezione intracerebrale di materiale patologico in topi bianchi, seguito dall'identificazione del virus con il metodo degli anticorpi fluorescenti secondo 7.

9.2 Preparazione dei campioni per l'esame - secondo 8.2.1.

9.3 Conduzione dello studio

Da cinque a sei topi bianchi vengono infettati con una sospensione intracerebrale di materiale patologico al 10% in un volume di materiale di 0,02-0,03 cm. Gli animali vengono osservati per almeno 30 giorni. Nel diario viene registrato il numero di topi sani, malati e morti.

9.4 Gestione dei risultati

Nella valutazione dei risultati si tiene conto della presenza di segni clinici nei topi infetti (pelo arruffato, assunzione di cibo, compromissione della coordinazione dei movimenti, paralisi, tremore, prostrazione). La morte dei topi nei primi due giorni dopo l'infezione non viene presa in considerazione. I campioni di cervello di animali malati e morti, a partire dal terzo giorno, vengono esaminati dal MAE entro il 7.

Un test biologico è considerato positivo se, a partire dal terzo giorno dopo l'infezione, almeno un topo si è ammalato ed è morto e sono state rilevate inclusioni specifiche del virus della rabbia nel campione di cervello utilizzando l'MFA.

Una diagnosi negativa può essere data solo dopo 30 giorni di osservazione, a condizione che tutti gli animali infetti rimangano vivi e sani.

I risultati del test biologico sono considerati definitivi, non vengono effettuate ulteriori ricerche.

10 Metodo di dosaggio immunoenzimatico (ELISA)

10.1 Essenza del metodo

L'ELISA si basa sull'interazione specifica dell'antigene del virus della rabbia con un anticorpo immobilizzato su un supporto solido. L'antigene legato viene rilevato utilizzando un secondo anticorpo antirabbico marcato con perossidasi, il cui prodotto di reazione viene colorato quando viene aggiunto il cromogeno. L'intensità della colorazione del prodotto di reazione è direttamente proporzionale alla quantità di antigene.

10.2 Preparazione all'esame

10.2.1 Come materiale di prova (antigene) vengono utilizzati campioni di tessuto cerebrale di animali morti, uccisi forzatamente, sospettati di rabbia o infettati sperimentalmente dal virus della rabbia.

10.2.2 Preparazione dell'antigene del test

I campioni di tessuto cerebrale ottenuti secondo 6.5 vengono frantumati, macinati in un mortaio e le sospensioni al 10% vengono preparate in una soluzione isotonica di cloruro di sodio allo 0,9%, riscaldate a bagnomaria a una temperatura di 60 ° C per 15 minuti e centrifugate per 5-10 minimo a 2000 giri/min. Il surnatante viene utilizzato come antigene del test.

10.2.3 Preparazione dei reagenti

Tutte le soluzioni e i reagenti prima di avviare la reazione devono essere conservati per almeno 30 minuti ad una temperatura di (22 ± 1) °C.

La preparazione dei componenti del kit viene effettuata secondo le istruzioni per l'uso.

10.3 Conduzione dello studio

10.3.1 L'ELISA viene effettuato in versione sandwich utilizzando i componenti inclusi nel kit per la rilevazione dell'antigene patogeno della rabbia nel materiale patologico.

Per l'ELISA vengono utilizzate piastre per reazioni immunologiche con fondo piatto.

Il volume degli ingredienti introdotti gradualmente nei pozzetti della compressa è uguale tra loro ed è 0,1 cm3.

10.3.2 Sensibilizzazione della piastra

Nei pozzetti di una piastra di polistirolo aggiungere Ang alla diluizione di lavoro indicata in etichetta. La piastra con ANG viene coperta con un coperchio e incubata in un termostato a una temperatura di (37 ± 0,5) °C per 3 ore o a una temperatura di 4 °C per 18 ore Dopo l'incubazione, i pozzetti della piastra vengono lavati tre volte con soluzione tampone di lavaggio. Ad ogni lavaggio, il contenuto dei pozzetti viene scosso e la soluzione rimanente viene rimossa picchiettando sulla carta da filtro.

10.3.3 Applicazione degli antigeni

Nelle file della compressa A, B e C preparare il tampone di lavaggio. Gli antigeni di controllo positivi (pozzetto A1) e negativi (pozzetto A2) inclusi nel kit, nonché i campioni da testare (pozzetti A3, A4, ecc.) vengono aggiunti ai pozzetti della compressa e titolati verticalmente, ottenendo diluizioni da 1 :2 a 1:8. Con un numero elevato di campioni vengono riempite anche le altre righe della compressa. La piastra viene coperta con un coperchio e incubata per 1 ora in un termostato a una temperatura di (37 ± 0,5) ° C. Al termine dell'incubazione, i pozzetti della piastra vengono lavati tre volte dagli antigeni non legati all'immunoglobulina, come descritto in 10.3.2.

10.3.4 Applicazione del coniugato di perossidasi della rabbia

Ai pozzetti della piastra viene aggiunto un coniugato di perossidasi antirabbica nella diluizione di lavoro, dopo di che viene coperto con un coperchio e incubato in un termostato a una temperatura di (37 ± 0,5) ° C per 1 ora. della piastra vengono lavati tre volte come descritto in 10.3.2.

10.3.5 Stesura della miscela di substrato

Per la manifestazione della reazione, la miscela di substrato preparata viene aggiunta ai pozzetti della compressa. La reazione viene mostrata per 15-30 minuti ad una temperatura di (22 ± 0,5) °C al buio. La reazione viene bloccata aggiungendo una soluzione di acido solforico con concentrazione molare di 2 mol/dm.

10.4 Gestione dei risultati

La contabilità della reazione viene effettuata visivamente o su uno spettrofotometro a scansione secondo le istruzioni per l'uso del kit.

Se si utilizza OPD come cromogeno nella miscela di substrato, la densità ottica viene misurata a 490 nm, se si utilizza TMB, a 450 nm.

Una reazione viene conteggiata solo se non è presente alcuna colorazione specifica nei pozzetti con antigene di controllo negativo mentre è presente una colorazione intensa nei pozzetti con antigene di controllo positivo. Durante il conteggio visivo, il campione è considerato positivo se almeno una (prima) diluizione mostra una colorazione specifica.

Quando si tiene conto spettrofotometricamente del risultato dell'ELISA, viene calcolato il coefficiente di specificità, che è uguale al rapporto tra la densità ottica (OD) del prodotto di reazione nei pozzetti con l'antigene positivo di controllo o il materiale di prova (OD) e la densità ottica densità della miscela di substrato nei pozzetti con l'antigene di controllo negativo (OD). La reazione è considerata positiva se il coefficiente di specificità è superiore a 2,1 e negativa se è inferiore a 2,1.

Esempio

OPERAZIONE 0,641, OP 0,120, 5.34 - reazione positiva o OD 0,180, OP 0,120 1.5 - la reazione è negativa.

In caso di reazione positiva la diagnosi è considerata consolidata. Un risultato negativo deve essere confermato con altri metodi in 7-9.

11 Reazione di precipitazione diffusiva (RDP)

11.1 Essenza del metodo

L'essenza del metodo RDP risiede nella capacità degli anticorpi e dell'antigene virale di diffondersi in un gel di agar e, in seguito a un'interazione specifica, formare un complesso antigene-anticorpo, che viene osservato ad occhio nudo sotto forma di una linea di precipitazione.

11.2 Preparazione all'esame

11.2.1 Preparazione del campione

Preparazione dei campioni per la ricerca - secondo 8.2.1.

Sono ammessi per la ricerca campioni di cervello animale stantio contaminati da microflora batterica.

11.2.2 Preparazione dell'agar

Per preparare l'agar, mescolare 1,5 g di agar Difco, 1 cm3 di una soluzione di arancio metilico all'1% in etanolo al 50%, 0,01 g di mertiolato, 100 cm3 di soluzione isotonica di cloruro di sodio. La miscela risultante viene fatta bollire fino a completo scioglimento dell'agar, versata in provette, autoclavata ad una pressione di 0,5 atm per 30 minuti e conservata in frigorifero alla temperatura di 4°C.

11.2.3 Preparazione dei vetrini (piastre Petri)

La reazione viene posta su vetrini o su piastre Petri. Una goccia di agar fuso viene applicata sul vetro sgrassato, viene distribuita uniformemente sul vetro e lasciata a temperatura ambiente per 20-30 minuti per solidificare l'agar. Quindi sul vetro vengono applicati 2,5 cm di agar fuso, formando uno strato di circa 2 mm di spessore, e lasciato per 20-30 minuti. I fori vengono praticati nello strato di agar congelato utilizzando un timbro speciale o un tubo metallico a pareti sottili con un diametro di 4-5 mm. Le colonne di agar vengono rimosse con attenzione, senza danneggiare o consentire che un sottile strato di gel di agar si stacchi dal vetro, utilizzando una pinzetta per occhi o altro strumento.

Le piastre Petri vengono preparate in modo simile, aggiungendovi 10-15 cm di agar fuso per ottenere uno strato di 2-3 mm di spessore.

11.3 Conduzione dello studio

Immediatamente prima di impostare la reazione si preparano delle diluizioni di siero antirabbico (immunoglobuline) alle quali si aggiungono in quattro provette 1,0 ml di soluzione isotonica di cloruro di sodio. Aggiungere 1,0 ml di siero antirabbico nella prima provetta per ottenere una diluizione 1:2, mescolare e trasferire 1,0 ml della miscela nella seconda provetta, ecc. Procuratevi quindi quattro provette con diluizioni 1:2, 1:4, 1:8 e 1:16.

0,05-0,07 cm 3 di un campione di cervello (ciascun campione in un pozzetto separato) ottenuto secondo 8.2.1 e diluizioni di siero o immunoglobulina antirabbica (1:2; 1:4; 1:8; 1: 16) secondo la figura 1.

Figura 1 – Schema di applicazione del materiale

Ar - Corno di Ammon; Pm - midollo allungato; A+ - antigene di controllo positivo; M - cervelletto; K - corteccia cerebrale; A- - antigene di controllo negativo

È possibile utilizzare altri schemi per l'introduzione del materiale, ma l'uso di antigeni positivi e negativi è obbligatorio.

I vetrini con il materiale da testare vengono posti in piastre Petri con fondo inumidito o in un essiccatore bagnato, quindi in un termostato a una temperatura di (37 ± 1) °C per 48 ore (le piastre Petri vengono coperte con un coperchio e poste in un termostato).

La reazione viene presa in considerazione dopo 6, 24 e 48 ore.

11.4 Gestione dei risultati

La reazione è considerata positiva quando appare anche una sola linea di precipitazione di qualsiasi intensità tra i pozzetti contenenti il ​​materiale in esame e il siero antirabbico (immunoglobulina).

In questo caso si deve osservare una linea di precipitazione evidente tra l'antigene positivo e il siero antirabbico (immunoglobulina) e non deve esserci alcuna linea di precipitazione tra l'antigene negativo e il siero antirabbico (immunoglobulina).

In caso di reazione positiva la diagnosi è considerata consolidata. Un risultato negativo deve essere confermato con altri metodi in 7-10.

Bibliografia

Guida UE alle buone pratiche di fabbricazione dei medicinali per uso umano e veterinario



UDC 619:616.98:579.852.1:615371 MKS 11.220

Parole chiave: rabbia, diagnostica, metodo con anticorpi fluorescenti, test immunoenzimatico, test biologico, reazione di precipitazione per diffusione

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Testo elettronico del documento
preparato da CJSC "Kodeks" e confrontato con:
pubblicazione ufficiale
M.: Standardinform, 2014

Rabbia - una malattia infettiva acuta che si manifesta con gravi danni al sistema nervoso, solitamente con esito fatale. Gli esseri umani e tutti i mammiferi sono sensibili.

La rabbia è onnipresente. L'agente eziologico dell'infezione viene trasmesso da cani, gatti, roditori selvatici e predatori, nonché da pipistrelli vampiri succhiatori di sangue.

La durata del periodo di incubazione dipende dalla posizione e dalla forza del morso, dalla quantità e dalla virulenza del virus entrato nella ferita e dalla resistenza dell'animale morso. Il periodo di incubazione dura da 1-3 settimane a un anno o anche di più.

La malattia sta correndo acutamente. I suoi segni clinici sono sostanzialmente gli stessi in tutti gli animali, ma sono più tipici nei cani, nei quali si può osservare un decorso della malattia sia violento che silenzioso (paralitico). Nei bovini la rabbia può manifestarsi in modo atipico (perdita dell'appetito, atonia del rumine, paralisi della faringe, salivazione). Potrebbe non esserci alcuno stadio di eccitazione.

Cambiamenti patologici non specifico. Nei mangiatori di carne (soprattutto cani), nello stomaco possono essere trovati corpi estranei.

Il virus della rabbia ha una neuroprobasia pronunciata. Penetrando dalla periferia (sito del morso) lungo i tronchi nervosi nel sistema nervoso centrale in modo centripeto, si diffonde nel corpo in modo centrifugo lungo i nervi periferici ed entra in vari organi, comprese le ghiandole salivari.

Si applica il virus alla famiglia Rhabdoviridae, Tipo Lyssavirus. I virioni sono a forma di bastoncello con l'estremità troncata. Virus virione - contenente RNA con una simmetria di tipo spirale, ha un guscio lipoproteico. Le basse temperature preservano il virus. Una temperatura di 60 ° C lo uccide in 5-10 minuti, la luce solare - in 5-7 giorni. Soluzioni di formalina, fenolo, acido cloridrico (5%) inattivano il virus in 5-10 minuti.

Il virione del virus della rabbia contiene antigeni glicoproteici (esterni) e nucleocapside (interni). L'antigene glicoproteico induce la formazione di anticorpi neutralizzanti il ​​virus e l'antigene nucleocapside induce la formazione di anticorpi che fissano il complemento e precipitano.

Nel corpo, il virus è localizzato principalmente nel sistema nervoso centrale, così come nelle ghiandole salivari e nella saliva.

coltivato su topi, conigli, porcellini d'India e altri animali, nonché in colture cellulari primarie (reni di criceto, embrioni di pecora, vitelli, ecc.) e cellule trapiantate. La riproduzione del virus nelle colture cellulari non si manifesta sempre con la CPD. Anche gli embrioni di pollo sono sensibili al virus della rabbia dopo l'adattamento preliminare. Il virus induce la formazione di corpi inclusi citoplasmatici, che si trovano più spesso nelle cellule del corno di ammonio, del cervelletto e della corteccia cerebrale.

fonte di infezione sono animali malati. Trasmettono il virus quando mordono. I carnivori possono infettarsi mangiando il cervello e il midollo spinale di animali morti di rabbia. È stata dimostrata la possibilità di infezione da rabbia per via aerogena (in luoghi dove sono presenti pipistrelli). Fino agli anni '60, cani e gatti erano la principale fonte di rabbia, poi volpi, lupi, corsacchi e altri animali selvatici.

Diagnosi la rabbia viene valutata sulla base di dati epizootologici, clinici e dei risultati di studi di laboratorio, che sono di importanza decisiva.

Quando si lavora con animali malati e materiale infetto, è necessario osservare rigorosamente le misure di sicurezza personale: indossare guanti di gomma, camici con maniche lunghe, grembiule di gomma o polietilene, stivali di gomma, occhiali protettivi e una maschera facciale.

È vietato aprire sul campo animali sospettati di rabbia.

Ottenere materiale patologico. Per la ricerca sulla rabbia, vengono inviati al laboratorio cadaveri freschi di piccoli animali nel loro insieme e di animali di taglia grande e media: la testa con le prime due vertebre cervicali. I cadaveri di piccoli animali vengono trattati con insetticidi prima di essere inviati alla ricerca.

Il materiale patologico è confezionato in sacchetti di plastica, posti in scatole ermeticamente chiuse con un tampone assorbente imbevuto di disinfettante. Materiale e lettera di accompagnamento indicante il mittente e il suo indirizzo, tipologia di animale, dati anamnestici e giustificazione del sospetto che l'animale abbia la rabbia, data e firma del medico.

Diagnostica di laboratorio. Comprende: rilevamento dell'antigene virale in RIF e RDP, corpi di Babes-Negri e test biologici su topi bianchi.

Barriera corallina. Per questa reazione, la bioindustria produce una gammaglobulina antirabbica fluorescente.

Tecnica di impostazione del RIF . Su vetrini sgrassati vengono preparate impronte o strisci sottili provenienti da varie parti del cervello sui lati sinistro e destro (corno di Ammon, corteccia cerebrale, cervelletto, midollo allungato). Preparare almeno due preparati di ciascuna parte del cervello. Puoi anche esaminare il midollo spinale, le ghiandole sottomandibolari e salivari. Per il controllo, i preparati vengono preparati dal cervello di un animale sano (di solito un topo bianco).

I preparati vengono essiccati all'aria, fissati in acetone refrigerato (meno 20 °C da 4 a 12 ore), essiccati all'aria, viene applicata gammaglobulina fluorescente, posta in una camera umida a 37 °C per 25-30 minuti, quindi accuratamente lavato con soluzione salina o tampone fosfato a pH 7,4, risciacquato con acqua distillata, asciugato all'aria, applicato con un olio da immersione non fluorescente e osservato al microscopio a fluorescenza.

Nei preparati contenenti l'antigene del virus della rabbia appaiono in diverse dimensioni e forme granuli giallo-verdi fluorescenti nei neuroni ma più spesso fuori dalle celle.

Non dovrebbe esserci tale bagliore nel controllo, il tessuto nervoso di solito si illumina di un colore grigiastro o verdastro opaco. L'intensità del bagliore viene valutata in croci.

Il risultato è considerato negativo in assenza di fluorescenza specifica.

Il materiale proveniente da animali vaccinati contro la rabbia non può essere esaminato nel RIF per 3 mesi. dopo la vaccinazione, poiché potrebbe verificarsi fluorescenza dell'antigene del virus vaccinale.

Nel RIF, i tessuti conservati con glicerina, formalina, alcool e

ecc., nonché materiale che presenti segni di degrado anche lieve.

RDP in gel di agar . Il metodo si basa sulla capacità degli anticorpi e degli antigeni di diffondere in un gel di agar e, una volta incontrati, formare linee di precipitazione visivamente visibili (complesso antigene + anticorpo). Viene utilizzato per rilevare l'antigene nel cervello di animali morti a causa del virus della rabbia di strada o durante un'infezione sperimentale (test biologico).