La corrispondente del canale televisivo MIR 24 Olga Klimkina parla degli ultimi sviluppi della medicina russa. Stiamo parlando di uno speciale biochip che permetterà di diagnosticare il cancro in tempi record. Il sistema dovrà essere approvato da Roszdrav, dopodiché inizieranno gli studi clinici.
Gli scienziati russi hanno sviluppato uno speciale biochip che consentirà di diagnosticare il cancro in tempi record. Il sistema dovrebbe essere incoraggiato da Roszdrav, dopodiché inizieranno gli studi clinici. Il nuovo metodo è stato valutato dalla corrispondente del canale televisivo MIR 24 Olga Klimkina.
Due anni di ricerca, prove ed errori. Il risultato è nel laboratorio del Blokhin Cancer Center. Questo è l'aspetto del biochip e questo è l'aspetto del mezzo di trasporto e dei nutrienti. Viene loro portato uno scanner speciale. Tutti insieme, un unico complesso che può aiutare a sconfiggere il cancro. Per Marina Savostikova, una delle autrici dello sviluppo, questa non è solo una lotta professionale, ma anche personale. Lei stessa è sopravvissuta due volte a una terribile malattia. Sa che l'esito dipende dalla diagnosi tempestiva.
“Possiamo dire: mio Dio, hai l’adenocarcinoma. E hai l'adenocarcinoma del polmone. Oppure, diciamo, collega, devi escludere il cancro del colon-retto ", ha spiegato il Ph.D. N.N. Blokhina Marina Savostikova.
Per determinare la diagnosi con tanta facilità, gli scienziati hanno lavorato a Mosca presso il Blokhin Cancer Center e l'Istituto di microbiologia ed epidemiologia e a Nizhny Novgorod presso l'Accademia medica. Di conseguenza, è stato creato un biochip: una piastra con 15 celle. Ciascuno contiene anticorpi diversi. Reagiscono a un certo tipo di cancro nelle cellule. Inoltre coloranti speciali che mostrano la reazione.
“Al momento abbiamo liquido pleurico di una donna nata nel 1929 e di un'altra donna affetta da carcinoma ovarico. Condurremo le loro ricerche sui biochip”, sottolinea il medico.
Per fare una diagnosi, non è necessario il sangue, ma il liquido versato che si accumula in un corpo malato. Da esso si prelevano dei campioni, si mescolano, si mettono in una centrifuga e si preleva il precipitato.
"Noi vartexiamo, mescoliamo, in modo che la sospensione cellulare che applichiamo al biochip abbia una distribuzione uniforme in tutte le cellule", ha detto un ricercatore del Centro russo per la ricerca sul cancro. N.N. Blokhina Elena Furminskaya.
Dopo scaldarlo fino a 37 gradi e a giudizio del medico al microscopio a fluorescenza. Sullo schermo sono presenti punti rossi e verdi. Per uno specialista, il cancro appare così.
Il cancro non è così grave come si dice.
“Si tratta di un complesso di cancro ovarico sieroso. Qui ci sono singole cellule, dovevamo confermarle e le abbiamo confermate ", ha detto Marina Savostikova.
Finora questa non è una diagnosi ufficiale, ma solo il risultato della ricerca. Gli sviluppatori stanno aspettando l'approvazione di Roszdravnadzor e prevedono di iniziare gli studi clinici ad aprile. Successivamente, i biochip possono apparire in qualsiasi clinica russa.
Ogni anno in Russia muoiono di cancro più di 300.000 persone. Si scopre che quasi mille pazienti muoiono ogni giorno nel Paese. Se a un paziente viene diagnosticata la prima fase, con una probabilità del 93% sopravviverà, scrive il Russian Cancer Portal.
Piano.
INTRODUZIONE
1.BIOCHIP IN BIOLOGIA E MEDICINA DEL XXI SECOLO.
1.2. Definizione di biochip.
1.3. Tipi, proprietà e funzioni dei biochip.
2. La parte principale.
2.1. Biochip gel, loro proprietà, produzione e analisi.
2.2. Oligonucleotidi e microarray di DNA.
2.3. Microarray cellulari.
CONCLUSIONE.
ELENCO DELLA LETTERATURA USATA.
BIOCHIP IN BIOLOGIA E
MEDICINA DEL XXI SECOLO.
I microchip biologici sono una delle aree sperimentali in più rapido sviluppo della biologia moderna. Esistono due tipi principali di biochip. La prima tipologia presa in considerazione sono le micromatrici di vari composti, principalmente biopolimeri, immobilizzati sulla superficie del vetro, in microgocce di gel, in microcapillari. Un altro tipo di biochip sono i "microlaboratori" miniaturizzati. L'efficienza dei biochip è dovuta alla possibilità di eseguire in parallelo un gran numero di reazioni e interazioni specifiche di molecole di biopolimeri, come DNA, proteine, polisaccaridi, tra loro e con ligandi a basso peso molecolare. È possibile raccogliere ed elaborare un'enorme quantità di informazioni biologiche sui singoli elementi del biochip in esperimenti paralleli abbastanza semplici. Questa è la fondamentale somiglianza informativa dei biochip con i microchip elettronici. Tuttavia, ci sono anche una serie di differenze fondamentali tra loro.
Nella fig. 1 mostra il principio di funzionamento di una cellula di DNA o di un biochip oligonucleotidico basato sulle interazioni complementari della base di adenina (A) con timina (T) e guanina (G) con citosina (C) in due filamenti di DNA. Se la sequenza di basi in un filamento di DNA (o oligonucleotide) è completamente complementare alla sequenza dell'altro filamento, allora si forma un'elica stabile e perfetta a doppio filamento: un duplex. Tuttavia, la presenza nel duplex anche di una sola coppia sbagliata, come G-G, impedisce la formazione di un duplex. Se uno specifico DNA a filamento singolo o, ad esempio, un oligonucleotide da 20 meri (sonda) viene immobilizzato in uno degli elementi del microchip, allora quando frammenti di DNA marcati con coloranti fluorescenti, ad esempio, il genoma umano, vengono aggiunti al microchip, si verificherà la loro interazione altamente specifica. Un dato elemento oligonucleotidico del biochip legherà specificamente solo una sequenza complementare su 420 = 1,09 x 1012 di tutte le possibili sequenze di questa lunghezza nel DNA. Di conseguenza, la luce fluorescente si osserva solo su questo elemento complementare del biochip. Pertanto, un elemento del biochip produce un campione tra circa un trilione di possibili opzioni, a differenza dell'elemento del chip elettronico, dove esiste un campione binario: SI o NO.
Riso. 1. Schema della formazione di una doppia elica del DNA su un biochip
L'oligonucleotide è fissato su uno degli elementi del biochip e lega selettivamente solo quello complementare di molti frammenti di DNA marcati in modo fluorescente. Di conseguenza, solo questo elemento inizia a brillare. Ciò è dovuto alle interazioni altamente specifiche delle coppie di basi complementari A con T e G con C. La presenza di una coppia non complementare, ad esempio G-G, impedisce l'interazione e lascia l'elemento del microchip scuro
Il rapido sviluppo della biologia nella seconda metà del secolo scorso è strettamente correlato all'emergere della biologia molecolare e cellulare, che si basa sul concetto di riduzionismo: la riduzione di processi biologici complessi a processi che si verificano a livello di singole molecole di biopolimeri, principalmente proteine e acidi nucleici e i loro vari complessi e strutture cellulari. Al riduzionismo si opponeva il concetto di integralismo sulla necessità di uno studio completo della struttura e del funzionamento dell'intero insieme di macromolecole nella cellula. Negli ultimi anni sono emersi nuovi approcci integrativi come la genomica, la proteomica e la cellomica, sviluppati da grandi team o spesso da intere “fabbriche della scienza”. Queste indicazioni consentono di stabilire la struttura e studiare i processi a livello dei geni dell'intero genoma, delle proteine dell'intera cellula o delle cellule dell'intero tessuto. I microchip biologici sviluppati negli ultimi anni consentono di implementare in forma accessibile approcci integrativi molto complessi di genomica, proteomica e cellomica. Ad esempio, i microarray di oligonucleotidi e DNA prodotti da numerose aziende consentono di studiare l'espressione della maggior parte dei geni di vari batteri e di molti geni umani in esperimenti abbastanza semplici accessibili ai singoli ricercatori. Il prossimo passo è la creazione di chip proteici contenenti un gran numero di proteine cellulari immobilizzate o anticorpi specifici per esse.
Sono noti da tempo macroarray di DNA e proteine immobilizzati sul filtro, o fissati nei pozzetti della compressa. Tuttavia, il primo lavoro sui microarray di DNA e uno dei primi sui microarray di proteine in un formato moderno sono stati pubblicati dal nostro laboratorio presso l'Istituto di Biologia Molecolare. V.A. Engelhardt RAS (IMB). Questo salto fondamentale è stato proposto per l'uso in un nuovo metodo di sequenziamento del DNA mediante ibridazione. Nel 1968, l’Unione Sovietica, seguita dagli Stati Uniti e da altri paesi, adottò programmi governativi per stabilire la sequenza completa di tutti i 3 miliardi di nucleotidi del genoma umano. Si è ampiamente discusso se questo compito debba essere risolto ampliando gli approcci esistenti o se si debbano sviluppare metodi nuovi e più efficienti. A causa dei limiti di tempo, gli scienziati hanno intrapreso la strada del miglioramento significativo e dell'enorme ridimensionamento di un metodo già esistente basato sulla lettura di un nucleotide dopo l'altro dall'estremità di brevi frammenti di DNA. Questo metodo nella versione chimica ed enzimatica è stato proposto da W. Gilbert e F. Sanger, che hanno condiviso il Premio Nobel per il 1967. Gli accademici E.D. Sverdlov e A.D. Mirzabekov. Nel suo discorso per il Nobel, W. Gilbert ha osservato che "l'idea del metodo è arrivata solo dopo la seconda visita di A. Mirzabekov" al suo laboratorio.
Riso. 2. Sequenziamento di un frammento di DNA mediante ibridazione con un microarray oligonucleotidico completo contenente tutti i 4096 6-meri
I 6-meri del microchip, che formano duplex perfetti dopo l'ibridazione con un frammento di DNA marcato in modo fluorescente, brillano intensamente. Tali 6-meri adiacenti si sovrappongono di cinque nucleotidi; questa sovrapposizione permette di ricostruire in modo univoco la sequenza nucleotidica del DNA
Alla ricerca di nuovi approcci al sequenziamento del DNA, il sequenziamento dell'ibridazione è stato proposto nel 1988 da noi e indipendentemente da altri due gruppi in Inghilterra e Serbia. In questo metodo, il sequenziamento viene effettuato non da singoli nucleotidi, ma da parole come parte di un "dizionario" completo di parole nucleotidiche di una certa dimensione. Tale dizionario può contenere tutti i possibili 4096 esanucleotidi, cioè parole genetiche di sei lettere. La necessità di creare microchip divenne evidente per noi e l'anno successivo apparve il primo articolo che descriveva la preparazione e le proprietà dei microchip in gel da noi proposti. Successivamente, abbiamo creato dizionari completi di esanucleotidi su microchip. Da quel momento ad oggi, il nostro gruppo si è concentrato sullo sviluppo dei biochip: la creazione di biochip di DNA, proteine e cellule, lo sviluppo di tecnologie per la loro produzione e la loro applicazione nella ricerca fondamentale e le loro varie applicazioni in medicina, biotecnologia e altri campi. Questi studi sono esaminati in un documento di revisione.
Riso. 2 mostra tale microarray oligonucleotidico completo da 6 meri e il sequenziamento di un frammento di DNA da 50 nucleotidi su di esso. Nel caso in questione, l'identificazione di tutti i 6-meri complementari al DNA e la sovrapposizione dei 6-meri vicini da parte di cinque nucleotidi, rende possibile ricostruire la sequenza nucleotidica completa del DNA. Il metodo in questa variante, infatti, funziona solo in alcuni casi; la sua ampia applicazione dovrebbe essere preceduta dalla soluzione di una serie di problemi sperimentali, che verranno considerati di seguito. .
BIOCHIPS IN GEL, LORO PROPRIETÀ, PRODUZIONE E ANALISI
La particolarità e la differenza dei biochip da noi sviluppati è che sono gocce emisferiche di idrogel, fissate mediante legame chimico sulla superficie di vetro, plastica o silicone. Varie biomolecole sono distribuite uniformemente e immobilizzate da legami chimici nel volume del gel. L'immobilizzazione non su una superficie bidimensionale, ma in un volume di gel tridimensionale offre numerosi vantaggi significativi. La capacità del biochip per unità di superficie aumenta di decine e centinaia di volte e, di conseguenza, aumenta la sensibilità delle misurazioni. Le macromolecole immobilizzate sono, per così dire, fissate in un mezzo acquoso omogeneo, che costituisce circa il 95% del volume del gel. Ciò esclude la loro interazione sia tra loro che con una superficie solida, dove i processi eterofasici con la partecipazione di biomolecole fissate su di essa procedono in modo più complesso. Ciò è particolarmente importante per i chip proteici poiché le molecole proteiche tendono a denaturarsi nell'interfase formata tra la superficie solida e il mezzo acquoso. Infine, gli elementi gel in aria o sott'olio vengono trasformati, per così dire, in provette isolate di micro e nanolitri, in ciascuna delle quali possono essere eseguite individualmente varie interazioni specifiche, reazioni chimiche ed enzimatiche. Per questo motivo, i biochip in gel combinano le proprietà sia dei microarray che dei microlaboratori.
La tecnologia per la produzione di biochip in gel ha attraversato tre fasi di sviluppo.
La tecnologia di prima generazione, ingombrante e inefficiente, consisteva in cinque fasi ed è stata sviluppata e brevettata presso l'IMB nel 1989-1993. È stato trasferito in un laboratorio congiunto di biochip organizzato dall'IMB e dall'Argonne National Laboratory (ANL, USA) nel 1994-2000. e divenne la tecnologia di prima generazione, fu concessa in licenza dalle aziende americane Motorola e Packard. Tuttavia, a causa della sua imperfezione, le aziende hanno iniziato a produrre biochip non come microarray di elementi gel, ma come una superficie continua di gel di poliacrilammide.
Negli ultimi tre anni IMB ha sviluppato tecnologie per la produzione di biochip di seconda e terza generazione. La tecnologia di seconda generazione consiste in tre fasi: modifica di biopolimeri immobilizzabili con gruppi di monomeri di gel, applicazione di una soluzione di queste sostanze miscelata con unità di monomeri di gel utilizzando un ago o un robot piezoelettrico e, infine, copolimerizzazione fotoindotta di monomero libero e legato al biopolimero molecole. Ciò porta all'immobilizzazione uniforme delle sostanze nell'intero volume del gel. In una tecnologia a due stadi di terza generazione ancora più semplice, la prima e la terza fase per ottenere biochip vengono combinate utilizzando una sorta di reazione chimica.
Una tecnologia di terza generazione abbastanza semplice, versatile ed economica consente di produrre centinaia e, nel prossimo futuro, migliaia di microarray di oligonucleotidi, DNA o proteine al giorno, anche in condizioni di laboratorio. È stato inoltre sviluppato un metodo per ottenere microchip mediante copolimerizzazione con dimensioni di microcelle di gel fino a 5x5x5 µm. I biochip contengono da decine a diverse migliaia di elementi gel con composti immobilizzati al loro interno. Gli elementi del microchip sono emisferi di idrogel (circa 100 µm di diametro) posti ad una distanza di 250 µm l'uno dall'altro sulla superficie di vetro idrofobizzato. Il DNA a filamento singolo fino a 200-300 nucleotidi di lunghezza e le proteine che pesano fino a 150 kD si diffondono facilmente e abbastanza rapidamente negli elementi idrogel di microarray appositamente progettati. Il biochip stesso è collocato in una camera di reazione con ingresso e uscita capillare, nella quale possono essere eseguiti vari processi in condizioni rigorosamente controllate.
ANALISI DEL BIOCHIP
La registrazione dei processi che si verificano sui biochip viene effettuata utilizzando metodi fluorescenti e, in alcuni casi, chemiluminescenti e spettrometrici di massa. Per l'analisi quantitativa della fluorescenza, abbiamo sviluppato, insieme al Centro di ricerca russo "Istituto ottico statale intitolato a S.I. Vavilov", microscopi fluorescenti ad ampio campo e ad alta apertura dotati di una telecamera CCD e di un computer. Il dispositivo consente di effettuare nella camera di reazione un'analisi quantitativa in tempo reale di tutti gli elementi del biochip contemporaneamente in modalità automatica, simultaneamente a quattro lunghezze d'onda, ad una temperatura determinata o variabile. Più di 20 analizzatori di ricerca sui biochip piuttosto costosi sono stati forniti a laboratori in Russia e negli Stati Uniti. Abbiamo sviluppato un analizzatore laser più semplice ed economico per le cliniche. Consente la registrazione quantitativa della fluorescenza simultaneamente dall'intero biochip utilizzando una semplice fotocamera CCD e l'elaborazione dei risultati su un computer portatile collegato utilizzando programmi appositamente progettati.
I metodi chemiluminescenti, sebbene inferiori in sensibilità a quelli luminescenti, possono semplificare e ridurre significativamente il costo delle apparecchiature di registrazione. Inoltre, è stato sviluppato un metodo speciale per l'analisi diretta dei composti direttamente nelle cellule gel utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF. Questo metodo, importante in proteomica, consente un'ulteriore identificazione dei composti che interagiscono con i biochip in base alla loro massa.
OLIGONUCLEOTIDI E MICROCHIP DI DNA
Il processo di interazione complementare di due filamenti di DNA (ibridazione) è complicato dalla stabilità significativamente inferiore del duplex A-T perfetto rispetto al duplex G-C e dall'effetto destabilizzante diseguale di varie coppie di basi irregolari. Pertanto, in alcuni tipi di esperimenti, è stata introdotta la misurazione delle curve di fusione, cioè la registrazione quantitativa della fluorescenza in parallelo in tutte le cellule del microchip in un gradiente di temperatura crescente. Ciò rende possibile calcolare i parametri termodinamici della formazione del duplex: energia libera, entropia ed entalpia. L'esecuzione di tali studi su microarray da noi prodotti contenenti vari nucleotidi di 6-meri (ce ne sono 4096 in totale) apre possibilità uniche. I parametri termodinamici vengono attualmente misurati per 4096 duplex esamerici perfetti e 73728 duplex contenenti tutti i tipi di coppie di basi irregolari in tutte le posizioni degli esanucleotidi. La compilazione di un catalogo completo di parametri termodinamici dei duplex esamerici consentirà di creare una teoria più accurata dell'ibridazione e di valutare l'effetto delle strutture primarie e secondarie nel DNA sull'ibridazione. Questa teoria è necessaria per il lavoro pratico con il DNA e, a sua volta, contribuirà al completamento dello sviluppo del metodo di sequenziamento del DNA mediante ibridazione.
Per l'uso diffuso del sequenziamento del DNA mediante ibridazione con microarray completi, ad esempio a 6 dimensioni o più complessi, è necessario risolvere una serie di problemi. Un compito importante è la discriminazione affidabile dei duplex perfetti e irregolari formati sul biochip, che è ostacolata dalle differenze nella stabilità delle coppie di basi A-T e G-C. La misurazione delle curve di fusione dei duplex e l'uso di algoritmi che calcolano l'area sotto la curva di fusione per ciascun duplex aumentano l'affidabilità dell'analisi. Un altro ostacolo importante è la frequente presenza di esanucleotidi ripetitivi e di sequenze più lunghe nel DNA. Questa frequenza può essere quantificata misurando e confrontando l'intensità della fluorescenza di diversi elementi del biochip.
L'ibridazione con un biochip a 6 dimensioni completo diventa un metodo interessante per identificare note e scoprire nuove mutazioni e polimorfismi nucleotidici nelle regioni del DNA con una struttura nota. L'ibridazione sequenziale con lo stesso biochip completo di due frammenti della stessa regione del genoma con una struttura conosciuta e analizzata consente di rivelare differenze nel modello di fluorescenza e di stabilire la struttura e la posizione della base modificata nel DNA. Questo metodo può rilevare la presenza di mutanti patogeni in un ceppo standard di poliovirus utilizzato come vaccino antipolio.
Sono stati utilizzati anche bioarray a 6 dimensioni complete per identificare la specificità dei composti che legano il DNA per determinate sequenze nucleotidiche. In questo modo, la specificità della proteina batterica istone-simile HU, del colorante a basso peso molecolare Hext 33258 e della proteina p50, che è un regolatore della trascrizione e della traduzione e scoperta dal gruppo dell'accademico L.P. Ovchinnikov (figura 3).
Riso. 3. Identificazione del riconoscimento da parte della proteina P50 di regioni specifiche nel DNA
La proteina P50 colorata in modo fluorescente si lega a un microarray oligonucleotidico completo di 6 meri. La fluorescenza delle proteine viene misurata su ciascun elemento del biochip in un gradiente di temperatura crescente e temperature di fusione ТD dei complessi proteici con oligonucleotidi. Gli oligonucleotidi del microchip, che mostrano la massima stabilità alla temperatura nel complesso con il DNA, sono localizzati nella croce luminosa e contengono le sequenze tetranucleotidiche TGGT e GGTC, dimostrano anche la massima specificità di legame.
L'ibridazione con microarray di oligonucleotidi serve per l'identificazione qualitativa e quantitativa degli acidi nucleici e per l'analisi delle variazioni strutturali in essi. I ribosomi sono presenti in tutte le cellule viventi e gli RNA ribosomiali sono tra le macromolecole più conservate dal punto di vista evolutivo. Tuttavia, ci sono diverse regioni variabili nell'RNA ribosomiale. Le differenze nella sequenza nucleotidica di queste regioni vengono utilizzate per identificare i microrganismi e tracciarne l'evoluzione. Abbiamo sviluppato una serie di microchip per un metodo express per l'identificazione di batteri nitrificanti, batteri del gruppo Bacillus e archeobatteri. La presenza di RNA ribosomiale nella cellula in quantità di migliaia di copie consente in alcuni casi l'analisi senza la loro amplificazione. È stato inoltre sviluppato un semplice sistema per l'isolamento degli RNA ribosomiali e la loro marcatura fluorescente sulla stessa colonna, che ha reso possibile la creazione di un metodo biochip espresso per l'analisi di tipi di armi biologiche come l'antrace. Stiamo anche esplorando la possibilità di creare biogeni per identificare tutti o la maggior parte dei microrganismi conosciuti.
Per l'analisi qualitativa e quantitativa dell'espressione genica e del contenuto di vari RNA messaggeri, esistono diversi sistemi di biochip commerciali stranieri. I gel microarray sono stati da noi utilizzati anche per l'analisi dell'mRNA, ad esempio per identificare i riarrangiamenti cromosomici che causano otto diversi tipi di leucemia. Nel Centro repubblicano di ematologia pediatrico è stata introdotta un'appropriata diagnostica tramite microchip della leucemia.
I microarray di oligonucleotidi rappresentano un approccio efficace per l'identificazione simultanea di decine o migliaia di geni e la loro analisi strutturale, per identificare sequenze nucleotidiche specifiche e variazioni nucleotidiche nella loro struttura. Tuttavia, quando i geni sono presenti nel genoma in quantità di una o più copie, è necessaria la loro amplificazione preliminare. Il metodo più efficace di amplificazione del DNA è la reazione a catena della polimerasi, durante la quale si verifica un aumento esponenziale del numero di molecole di DNA da diverse a milioni o più copie, sufficienti per la loro analisi di ibridazione.
In un approccio più tradizionale e semplice, l'amplificazione del DNA e l'ibridazione del DNA amplificato nel biochip vengono eseguite in due fasi separate. Tali metodi a due fasi sono stati sviluppati da noi in studi congiunti con numerosi laboratori russi e stranieri per identificare le mutazioni nel gene della b-globina che causa la malattia ereditaria b-talassemia, determinare gli alleli nel gene di istocompatibilità HLA DQAI e il polimorfismo nucleotidico nel gene del recettore m-oppioide, che probabilmente provoca una tendenza alla tossicodipendenza, determinando una serie di geni batterici responsabili della resistenza agli antibiotici e della sintesi di alcune tossine.
L'ibridazione del DNA amplificato con veri e propri biochip ha trovato applicazione nella pratica per identificare le mutazioni responsabili della resistenza dei bacilli della tubercolosi a uno dei principali farmaci antitubercolari, la rifampicina. Questo metodo è semplice, poco costoso e accelera l'analisi da settimane a 1 giorno. Il metodo è stato sviluppato in collaborazione con il Centro scientifico e pratico di Mosca per la lotta alla tubercolosi e il Centro scientifico statale di virologia e biotecnologia "Vector" e testato su oltre 150 pazienti in numerose cliniche. È stata lanciata la produzione commerciale di tali kit di test contenenti microarray di oligonucleotidi, componenti per l'amplificazione del DNA, compresi oligonucleotidi sintetici marcati in modo fluorescente, un analizzatore di bioarray clinici con un computer portatile e un programma per l'analisi automatica dei biochip. Questo metodo può essere facilmente adattato per rilevare molti altri microrganismi, geni di resistenza ai farmaci e sintesi di tossine, nonché per identificare varie mutazioni in virus, microrganismi, animali (compreso l'uomo) e piante. L'introduzione delle modifiche adeguate necessarie per adempiere a questi compiti può essere effettuata in breve tempo, da alcune settimane a diversi mesi.
In altri due metodi sviluppati, l'ibridazione dei microarray è combinata con l'amplificazione dei microarray in un unico passaggio, il che accelera e semplifica l'analisi. Nel secondo metodo, l'amplificazione avviene in parallelo in una soluzione nella camera di reazione e in elementi di microchip in gel contenenti oligonucleotidi immobilizzati (primer) coinvolti nell'amplificazione. Questo approccio è stato utilizzato per ridurre l'identificazione del bacillo della tubercolosi a 2 ore e determinarne la resistenza a due farmaci contemporaneamente: rifampicina e isoniazide. Il metodo utilizza anche l'amplificazione allele-specifica procedendo su oligonucleotidi immobilizzati nel gel. Inoltre, mutazioni e nucleotidi polimorfici possono essere rilevati utilizzando reazioni enzimatiche di allungamento di oligonucleotidi immobilizzati su un chip da un nucleotide e la loro connessione con altri oligonucleotidi - legatura.
Nel terzo metodo, l'amplificazione avviene esclusivamente in elementi gel di microchip, utilizzati in questo caso come provette con un volume da diversi nanolitri a frazioni di microlitro. Ciascuno di questi nanotubi di gel contiene due o più oligonucleotidi specifici necessari per l'amplificazione. Il metodo è ancora piuttosto complicato nell’esecuzione e richiede un ulteriore affinamento. Tuttavia, la sua implementazione consentirà di analizzare migliaia di nucleotidi polimorfici nel genoma su un biochip e in un esperimento, il che consentirà di utilizzarlo per lo screening di massa delle popolazioni. È noto che il polimorfismo di circa 3 milioni di nucleotidi sui 3 miliardi che compongono il genoma umano distingue una persona da un'altra. Il polimorfismo è responsabile di difetti e patologie ereditarie, predisposizione a molte malattie, comprese quelle maligne, e determina molte altre caratteristiche geneticamente definite di una persona. Pertanto, la creazione di un'analisi tramite microchip semplice ed efficace del polimorfismo contemporaneamente in molte aree per ciascun individuo avvicinerà una persona all'obiettivo "Conosci te stesso", iscritto circa 2500 anni fa sul muro del Tempio Delfico in Grecia.
Biochip progettati per identificare alcuni batteri patogeni, virus e armi biologiche, nonché per rilevare mutazioni che causano tumori a - virus variola, vaccinia, vaiolo bovino;
b - antrace, peste, brucellosi su un chip;
c - rilevamento di agenti patogeni nel sangue del donatore;
d - mutazioni nel gene brcal responsabile dell'insorgenza del cancro al seno;
e - traslocazioni nella leucemia
Alcuni di questi biochip possono essere utilizzati per rilevare in modo rapido e sensibile armi biologiche, vaiolo, antrace e altre malattie simili.
La tecnologia di produzione dei microarray consente, con piccole modifiche, di ottenere sia microarray di oligonucleotidi che di DNA, nonché microarray di proteine contenenti enzimi, anticorpi, antigeni, ecc. L'effetto stabilizzante dell'immobilizzazione del gel consente di conservare la maggior parte dei microarray proteici per mesi senza perdita di attività funzionale.
In collaborazione con i laboratori dei Membri Corrispondenti RAS E.V. Grishin e V.A. Nesmeyanov (IBCh, RAS), così come A.Yu. Baryshnikov (Oncocentro dell'Accademia Russa delle Scienze Mediche), abbiamo dimostrato l'uso efficace di chip di gel proteico per la diagnosi quantitativa di una serie di tossine, nonché di antigeni e anticorpi tumorali nel sangue dei pazienti. Questi esperimenti iniziali indicano che i biochip sono competitivi nell'immunodiagnostica clinica con i metodi standard.
L’uso di chip proteici nella proteomica in rapido sviluppo è promettente. A questo proposito risultano di particolare interesse i seguenti due compiti:
Determinazione qualitativa e quantitativa di un gran numero di proteine in parallelo in cellule di vari tessuti o in vari stati funzionali, per le quali possono essere utilizzati anticorpi specifici, come mostrato in Fig. 7, per l'identificazione quantitativa dell'antigene del cancro alla prostata; in diversi paesi sono già stati lanciati programmi per la produzione della maggior parte delle proteine delle cellule umane e batteriche e per la produzione di anticorpi specifici contro di esse; speriamo di utilizzare la tecnologia domestica dei biochip per collaborare con questi programmi per creare un sistema per la determinazione quantitativa delle proteine cellulari;
Studio delle interazioni delle proteine cellulari tra loro e con altri ligandi cellulari, quali DNA e composti a basso peso molecolare; determinazione della specificità delle proteine leganti il DNA utilizzando microarray oligonucleotidici completi descritti in precedenza; un compito molto più difficile è l'identificazione di proteine che interagiscono specificamente tra loro e con i ligandi, se almeno un componente è sconosciuto; per questi casi è stato sviluppato un metodo per identificare le molecole che si legano al microchip mediante spettrometria di massa; microchip proteici contenenti enzimi immobilizzati possono essere utilizzati anche per l'analisi cinetica dei loro substrati e inibitori.
MICROCHIP CELLULARI
È noto che molte cellule procariotiche ed eucariotiche sopravvivono e addirittura si dividono quando vengono fissate in un idrogel. Ciò apre una serie di possibilità interessanti, inclusa la creazione di biochip cellulari come biosensori a matrice per la determinazione parallela, ad esempio, di una serie di antibiotici e xenobiotici. Microchip batterico contenente ceppi di E. coli immobilizzati e resistenti a vari antibiotici. Una foto di un elemento gel colorato indica la distribuzione delle cellule in crescita nell'intero volume del gel. La cinetica di divisione e crescita dei batteri nel gel del microchip viene registrata colorando le cellule con un colorante fluorescente. La crescita dei batteri dipende dalla resistenza delle cellule all'antibiotico e dalla sua presenza nel mezzo. La figura mostra un microchip batterico contenente 4 ceppi di E. coli immobilizzati in gel, sensibili e resistenti agli antibiotici tetraciclina, cloramfenicolo e ad una miscela di cloramfenicolo e ampicillina. La soppressione della crescita batterica negli elementi corrispondenti del biochip permette di identificare la presenza di questi antibiotici nel mezzo. Dopo aver costruito la curva di calibrazione, il contenuto di antibiotici nel terreno può essere misurato quantitativamente. È anche interessante creare microarray contenenti cellule animali e vegetali per determinare un'ampia gamma di sostanze diverse nell'ambiente.
Biochip per la diagnosi precoce del cancro
Gli scienziati dell’Argonne National Laboratory presso il Nuclear Energy Research Center di Chicago, Illinois, hanno sviluppato un biochip in grado di diagnosticare alcuni tipi di cancro prima che compaiano i sintomi.
Eprogen ha concesso in licenza questa tecnologia e la sta utilizzando per cercare nuovi biomarcatori del cancro. I tumori, anche negli stadi più precoci e asintomatici, producono proteine che entrano nel flusso sanguigno e innescano le risposte immunitarie, in particolare la sintesi di anticorpi. Confrontare i profili degli autoanticorpi di persone sane e di malati di cancro è un metodo promettente per trovare indicatori precoci di malattia, afferma l’azienda.
Il processo che utilizzano, chiamato frazionamento proteico bidimensionale, seleziona migliaia di diverse proteine delle cellule tumorali in base alle differenze nella loro carica elettrica e idrofobicità. Utilizzando questo metodo, i ricercatori ottengono 960 frazioni proteiche, che vengono inserite in un biochip contenente piastre da 96 pozzetti. Successivamente, il biochip viene trattato con autoanticorpi pre-conosciuti sintetizzati dal sistema immunitario dei malati di cancro.
L'utilizzo degli autoanticorpi di un paziente per la diagnosi consentirà ai medici di personalizzare il trattamento in base al profilo autoanticorpale individuale. L'unicità del nuovo metodo sta nel fatto che gli scienziati utilizzano dati reali sulla malattia di una persona per ottenere informazioni diagnostiche nuove e più dettagliate che gli specialisti possono utilizzare per studiare e curare il cancro.
Secondo Daniel Schabacker, specialista dell'Argonne National Laboratory, che ha sviluppato la tecnologia, i biochip hanno già mostrato un grande potenziale nella medicina diagnostica. Oltre a Eprogen, altre tre società hanno concesso in licenza la tecnologia. Uno di loro, Akonni Biosystems, ha già sviluppato diverse dozzine di test basati su di esso, venduti con il marchio TruArray. Un'altra società, Safeguard Biosystems, ha concesso in licenza biochip per kit diagnostici veterinari.
Ad esempio, quando si diagnosticano malattie delle prime vie respiratorie, gli anticorpi o il DNA contenuti in uno striscio prelevato dal cavo orale del paziente si legano a molecole depositate sul biochip. Dopo l'elaborazione, i pozzetti del biochip in cui si è verificato tale legame iniziano a brillare. Un programma speciale decifra l'immagine scansionata dal computer, calcola la probabilità statistica della presenza di un particolare agente infettivo e fornisce informazioni al medico.
Lo sviluppo di strumenti diagnostici come TruArray ha il potenziale per rivoluzionare la diagnostica, ad esempio Permette di diagnosticare contemporaneamente un gran numero di malattie. Una delle proprietà uniche del metodo è la possibilità di eseguire test simultanei per infezioni batteriche e virali.
L'analisi mediante biochip richiede circa 30 minuti e garantisce riservatezza ed elevata precisione diagnostica il medico, senza lasciare lo studio, può quasi di fronte al paziente determinare la natura della malattia e lo stadio del suo sviluppo.
Nei pazienti diabetici, le particelle piccole e dense di LDL-C contengono glicosilatiapoIN
Charlton-Menys (Università di Manchester, Regno Unito) ha valutato il grado di glicosilazione di varie sottofrazioni lipidiche in 44 volontari con DM. Si è scoperto che il livello medio di Apo B glicosilata era di 3,0 mg / dl, con l'84,6% di Apo B glicosilata nella composizione di LDL-C e il 67,8% nella composizione della sottofrazione più aterogenica, ovvero piccole particelle dense dell'X-LDL.
Il livello di piccole particelle dense di LDL-C è maggiormente correlato allo spessore dell’intima media delle arterie carotidi
Tetsuo Shoji (Osaka City University Graduate School of Medicine, Giappone) e colleghi hanno determinato i livelli lipidici in 326 pazienti esaminati per l'indice di massa corporea carotideo. I ricercatori hanno mostrato una forte correlazione tra il livello di colesterolo LDL piccolo e denso e lo spessore intima-media delle arterie carotidi (coefficiente di correlazione 0,441). La correlazione di altri lipidi con lo spessore dell'intima-media era la seguente: apolipoproteina B (0,279), LDL-C 0,249) e trigliceridi (0,175). Nei pazienti con livelli elevati di proteina C-reattiva, i livelli di C-LDL piccolo e denso sono risultati inferiori rispetto ai pazienti con livelli bassi di proteina C-reattiva.
Aterosclerosi 2008; Pubblicazione online anticipata.
Medici del Centro russo di ricerca sul cancro dal nome N.N. Blokhin, insieme ai colleghi di Nizhny Novgorod, ha sviluppato un sistema di test unico per la ricerca immunocitochimica. Può sostituire un intero laboratorio, non ha analoghi al mondo e ha ricevuto voti alti dai principali oncologi giapponesi. Con l'aiuto di questa innovazione è possibile determinare la presenza o l'assenza di una neoplasia maligna in un paziente alla prima visita in clinica. Il sistema di test è pensato in modo tale da poter essere implementato facilmente e rapidamente in tutto il paese.
La novità si chiamava "Biochip". È stato il risultato di un lavoro congiunto a lungo termine del Centro russo per la ricerca sul cancro. N.N. Blokhin, l'Accademia medica di Nizhny Novgorod e l'Istituto di epidemiologia e microbiologia. IN. Blokhin.
Il biochip è uno sviluppo fondamentalmente nuovo, - ha detto a Izvestia uno degli autori del sistema di test, capo del laboratorio di citologia clinica del Centro russo per la ricerca sul cancro intitolato a Izvestia. N.N. Blokhin, oncocitologa Marina Savostikova. - Nel 2016 abbiamo registrato un sistema di test in Russia per scopi scientifici e abbiamo ricevuto un brevetto internazionale. I colleghi giapponesi si sono interessati al biochip. Alla fine del 2016 hanno firmato con noi un accordo sul trasferimento dello sviluppo ai paesi della regione Asia-Pacifico.
Il sistema di test è progettato per diagnosticare qualsiasi processo maligno: cancro, melanoma, linfoma. È esso stesso un biochip, uno scanner per la digitalizzazione dei risultati e un mezzo di trasporto e nutrimento per la conservazione del biomateriale.
Un biochip è un substrato diviso in 15 cellule in cui vengono introdotti vari anticorpi. Il biomateriale prelevato da un paziente per l'analisi (fluido corporeo patologico o punteggiato da una neoplasia) deve essere trattato in una centrifuga standard, disponibile in qualsiasi laboratorio, e quindi introdotto nelle cellule dove, quando riscaldato a 37 gradi, avviene una reazione. Per visualizzare la reazione, agli anticorpi sono state aggiunte etichette fluorocromiche. Quando l'antigene di una cellula tumorale reagisce con un anticorpo, la cellula si illumina. Grazie a questo bagliore è possibile determinare immediatamente se nel campione sono presenti o meno cellule tumorali.
Questo è un metodo di immunocitochimica fluorescente, - ha spiegato Marina Savostikova. - La reazione è quasi istantanea. La tecnologia consente analisi tre volte più veloci rispetto al metodo standard e tre volte più economiche. È possibile condurre uno studio nelle condizioni di qualsiasi clinica in cui il paziente si è rivolto con qualsiasi reclamo.
Nonostante il fatto che con l'aiuto di un biochip sia possibile distinguere una neoplasia maligna da una benigna, i medici non suggeriscono di controllare in questo modo tutti di fila per il cancro. Per l'analisi vengono prelevati fluidi o cellule di tessuto patologico ottenuti mediante puntura.
Ad esempio, un paziente è andato dal terapista lamentando gonfiore al collo, spiega Marina Savostikova. - Può essere una comune linfoadenite, una cisti del collo, una reazione allergica a una puntura d'insetto, un sarcoma dei tessuti molli del collo. E se un paziente ha del liquido nei polmoni, la causa potrebbe essere la tubercolosi, la polmonite, le metastasi del cancro, il mesotelioma. Con l'aiuto del nuovo sistema di test possiamo escludere tutto questo e dare consigli ai medici dove cercare il problema.
Per l'introduzione diffusa di questo metodo diagnostico, non è necessario impiantare oncocitologi nel laboratorio di ciascun policlinico. È solo necessario dotare ogni laboratorio di biochip e scanner. È auspicabile che disponga di una fornitura di provette con un mezzo di trasporto nutriente (TPS). Questo è anche lo sviluppo degli autori del progetto. Il TPS è una provetta con tappo ermetico in cui viene introdotto un biomateriale. Il tubo contiene conservanti che inibiscono la crescita dei microbi. In questo ambiente, il biomateriale può essere conservato senza frigorifero fino a un mese.
Il chirurgo del policlinico o dell'ospedale deve effettuare una puntura e introdurre il materiale patologico nel TPS e quindi nel biochip. Successivamente, posiziona il sistema di test nello scanner, che invierà l'immagine allo specialista del centro di riferimento.
Abbiamo già lanciato la produzione su piccola scala di biochip, - ha detto un altro autore del progetto, il direttore della centrale nucleare "Biochip" Svyatoslav Zinoviev. - Si trova a Nizhny Novgorod. Abbiamo realizzato da zero apparecchiature per la stampa automatizzata di biochip, poiché non esistono analoghi al mondo e quindi non esistono soluzioni progettuali adeguate. Gli scanner secondo il nostro ordine e mandato vengono prodotti anche dall'impresa Nizhny Novgorod.
Secondo Svyatoslav Zinoviev, la produzione di scanner è una sostituzione delle importazioni. Il costo totale di ciascun dispositivo sarà 10 volte inferiore rispetto alla controparte importata. Gli scanner hanno superato i test di laboratorio e ora gli sviluppatori stanno presentando i documenti per la registrazione.
Il biochip è installato in uno scanner che digitalizza l'immagine e la invia al centro di riferimento regionale. Lì, citologi con una vasta esperienza guardano l'immagine, analizzano il materiale ottenuto a distanza e restituiscono la conclusione. Il paziente alla seconda visita dal medico riceve una diagnosi accurata e l'opportunità di iniziare il trattamento. Tutti i casi complessi che i citologi regionali non sono riusciti a interpretare saranno presi in considerazione dal consiglio del Centro russo per la ricerca sul cancro. N.N. Blokhin. La comunicazione con il principale centro di riferimento è organizzata attraverso un sistema informativo e analitico, la cui realizzazione è inclusa nel progetto.
È molto importante fare una diagnosi il più presto possibile. Per un malato di cancro, questi termini sono la vita. Nell’era delle tecnologie mirate si cura l’oncologia. Ora il limite di sopravvivenza di cinque anni è la norma. Ci sono tumori dai quali non muoiono più. Ad esempio, questo è un tumore della tiroide, - ha detto Marina Savostikova.
Secondo Svyatoslav Zinoviev, la diagnostica con il nuovo sistema di test può essere gratuita per i pazienti, perché la ricerca immunocitochimica è inclusa negli standard dell'assicurazione medica obbligatoria (CHI).
Nizhny Novgorod, Cheboksary, San Pietroburgo, Yaroslavl, Rostov sul Don, Krasnodar e altre regioni hanno già annunciato la loro disponibilità a lavorare secondo il nuovo schema. Abbiamo comunicato con citologi, direttori e primari dei dispensari di oncologia, rappresentanti dei ministeri di alcune regioni e ovunque ci siamo incontrati con grande interesse, - ha detto Svyatoslav Zinoviev.
Ora i creatori del biochip attendono la conclusione di Roszdravnadzor, senza la quale è impossibile avviare la produzione di massa.
Per non perdere tempo, abbiamo già iniziato a formare gli specialisti che lavoreranno con il nuovo sistema, - precisa Marina Savostikova. - I citologi verranno formati con noi, supereranno gli esami e riceveranno certificati. E solo dopo potranno interpretare autonomamente i risultati ottenuti sul biochip.
Con un verdetto positivo da parte di Roszdravnadzor, i partecipanti al progetto promettono una rapida attuazione del progetto. La scadenza effettiva è aprile 2017.
Gli esperti-oncologi confermano la necessità di un'introduzione di massa di questo tipo di diagnostica.
L’idea di un biochip non è nuova. Sistemi simili vengono creati nel nostro istituto, ma finora li usiamo solo per diagnosticare la leucemia, - Alexey Maschan, vicedirettore generale - Direttore dell'Istituto di ematologia, immunologia e tecnologie cellulari dell'Istituto statale di bilancio "FNKTs DGOI dal nome Dmitry Rogachev" del Ministero della Salute russo, ha detto a Izvestia. - In effetti, esiste un problema con la disponibilità della diagnostica nelle regioni remote e tali sviluppi possono risolverlo. Il vantaggio della diagnostica tramite biochip è il suo pragmatismo: a fronte della carenza di finanziamenti per le istituzioni mediche, un tale sistema di test può risolvere alcuni dei problemi. Ma solo se ha resistito al confronto con i metodi diagnostici classici.
Secondo l’oncologo capo del Ministero della Salute tali sistemi vanno replicati, e non solo nel nostro Paese.
Questo è un sistema di test davvero unico per determinare eventuali processi maligni e finora non ha analoghi in nessuna parte del mondo, - ha detto a Izvestia Mikhail Davydov, capo oncologo del Ministero della sanità russo, accademico dell'Accademia delle scienze russa. - Questa è una decisione importante nel campo della diagnostica del cancro, che deve essere replicata e mostrata non solo ai colleghi nazionali, ma anche a quelli stranieri.
Il rapporto degli scienziati di Nizhny Novgorod sulla diagnostica espressa dell'oncologia utilizzando un biochip è riconosciuto come il migliore nella sezione Citologia del 29° Congresso Europeo di Patologia! - dopo queste parole, colleghi provenienti da Italia, Croazia, Turchia, Germania si sono precipitati a congratularsi con i russi ... È comprensibile: essere tra i migliori a questo congresso è come ottenere un Oscar nel cinema. Ogni anno, i principali luminari della medicina provenienti da tutto il mondo combattono per questo diritto ad Amsterdam.
Sviluppiamo questo biochip dal 2012, ma ha acquisito la sua forma attuale solo un paio di anni fa, quando è apparso un investitore, - afferma uno degli autori del progetto, capo del Laboratorio di Biologia Molecolare e Biotecnologia dell'NNII. Blokhin Oleg Utkin. - Non esistono analoghi di questo sistema di test in nessuna parte del mondo, l'affidabilità della diagnosi è del 95%.
Non si può dire subito che una tecnologia unica sia in fase di sviluppo all'interno delle mura dell'Istituto Nizhny Novgorod. Nessuna password segreta per te all'ingresso, nessun mitragliere di guardia. Tra tutte le precauzioni solo copriscarpe e camice bianco obbligatorio all'ingresso del laboratorio.
Questo è il nostro biochip, - Oleg mi mostra una minuscola lastra di vetro, appena visibile sul palmo della mano. Guardando questa bambina, è difficile credere che sia in grado di rilevare quasi ogni tipo di cancro in appena un'ora e mezza. Per questa tecnologia, molti presidenti darebbero metà del loro regno e una figlia per giunta.
Il principio di funzionamento di questo sistema è semplice: prendiamo qualsiasi biomateriale – fluido sieroso, urina o materiale postoperatorio – e lo inseriamo nelle cellule del biochip. In totale, il chip ha 15 settori, ciascuno dei quali contiene una proteina marcata con una soluzione fluorescente. Se vengono rilevati segni di oncologia, le cellule nella cellula mostreranno un bagliore al microscopio a fluorescenza.
A proposito, a differenza di tutti gli altri metodi diagnostici, un biochip non solo segnalerà il fatto stesso di una malattia oncologica, ma ne determinerà anche il tipo e la presenza di metastasi, aiutando così il medico a dare una prognosi sul decorso della malattia e per la scelta della terapia personale. Oggi il sistema di test è in grado di diagnosticare quasi tutti i tipi di cancro: polmone, seno, stomaco, colon, ovaie… A seconda del tipo sospetto di oncologia, cambierà anche l’insieme delle proteine nel biochip.
Ora esistono otto varietà di tali sistemi di test: dal solito screening, che rileva semplicemente la presenza di oncologia, a quelli personalizzati per ciascuna patologia, spiegano gli sviluppatori. – Soprattutto, la ricerca non richiede laboratori costosi o un enorme staff di medici altamente qualificati. Qualsiasi assistente di laboratorio può inserire il biomateriale nel nostro sistema di test, dopodiché l'oncologo può già trarre una conclusione.
Per questo sviluppo, gli scienziati hanno già ricevuto il premio nazionale "Vocazione". FOTO: Servizio stampa dell'Accademia medica statale di Nizhny
Questi biochip sono facili non solo da utilizzare, ma anche da produrre. In un piccolo laboratorio si possono realizzare migliaia di sistemi di questo tipo ogni giorno. Da qui il loro basso costo: uno di questi chip in una clinica costerà poco più di mille rubli. E per il paziente stesso, la diagnostica sarà completamente gratuita: deve essere inclusa nel sistema CHI.
Abbiamo già ricevuto tutti i brevetti necessari, russi e stranieri, - afferma Oleg Utkin. – Ma per poter consegnare i biochip ai policlinici, abbiamo bisogno del certificato di registrazione di Roszdrav. Ci auguriamo di riceverlo al più presto. Successivamente, tra un paio di mesi saremo in grado di avviare la produzione di massa.
Da parte sua, il Ministero della Sanità russo ha conferito agli sviluppatori di Nizhny Novgorod il prestigioso premio nazionale "Vocazione", assegnato ai migliori medici russi, nella nomination "Per la creazione di un nuovo metodo diagnostico".
AIUTO "KP"
Nello sviluppo del biochip sono coinvolti eminenti scienziati di tre centri di ricerca russi: L'accademico I.N. Blokhina, Istituto di bilancio dello Stato federale Centro russo per la ricerca sul cancro im. N.N. Blokhin, Istituto di istruzione superiore di bilancio dello Stato federale Accademia medica statale di Nizhny. Scienziati provenienti da Russia, Giappone, Svizzera, Cina, Bielorussia, Kazakistan e Armenia si sono già interessati a questa tecnologia.
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