Caratteristiche di ricombinazione, trasformazione, trasduzione e coniugazione batterica. Caratteristiche della costruzione di mappe genetiche nei procarioti

Argomento: Genetica dei microrganismi 1. Coniugazione, trasduzione, trasformazione. 2. Variabilità dei microrganismi. 3. Utilizzo dei risultati ottenuti nella genetica batterica.

L'apparato ereditario dei batteri ha una serie di caratteristiche: i batteri sono organismi aploidi, cioè hanno 1 cromosoma. A questo proposito, quando si ereditano i tratti, non si verifica alcun fenomeno di dominanza; I batteri hanno un alto tasso di riproduzione, in relazione al quale diverse decine di generazioni di batteri vengono sostituite in un breve periodo di tempo (giorno). Ciò rende possibile studiare popolazioni enormi e identificare facilmente anche mutazioni rare. L'apparato ereditario dei batteri è rappresentato da un cromosoma. I batteri ne hanno solo uno. Il cromosoma batterico è una molecola di DNA. La lunghezza di questa molecola raggiunge 1,0 mm e, per "adattarsi" alla cellula batterica, non è lineare, come negli eucarioti, ma è superavvolta in anse e piegata in un anello. Questo anello ad un certo punto è attaccato alla membrana citoplasmatica. I singoli geni si trovano sul cromosoma batterico. Nell'Escherichia coli, ad esempio, ce ne sono più di 2mila.

2. Le unità funzionali del genoma batterico, oltre ai geni cromosomici, sono: sequenze IS; trasposoni; plasmidi. Sequenze IS (inserimento inglese - inserimento, sequenza - sequenza) - brevi frammenti di DNA. Non portano geni strutturali (codificanti per l'una o l'altra proteina), ma contengono solo geni responsabili della trasposizione (la capacità delle sequenze IS di muoversi lungo il cromosoma e integrarsi nelle sue varie regioni). Le sequenze IS sono le stesse in diversi tipi di batteri. I trasposoni sono molecole di DNA più grandi delle sequenze IS. Oltre ai geni responsabili della trasposizione, contengono anche un gene strutturale che codifica l'uno o l'altro tratto. I trasposoni (elementi Tn) sono costituiti da 2000-25000 paia di basi, contengono un frammento di DNA che trasporta geni specifici e due elementi IS terminali. Ogni trasposone solitamente contiene geni che conferiscono caratteristiche importanti al batterio, come la resistenza multipla agli agenti antibatterici. In generale, i trasposoni sono caratterizzati dagli stessi geni dei plasmidi (geni per la resistenza agli antibiotici, la produzione di tossine, enzimi metabolici aggiuntivi). I trasposoni si muovono facilmente lungo il cromosoma. La loro posizione influenza l'espressione sia dei propri geni strutturali che di quelli cromosomici vicini. I trasposoni possono esistere anche al di fuori del cromosoma,

I plasmidi sono molecole circolari di DNA superavvolte. Il loro peso molecolare varia ampiamente e può essere centinaia di volte maggiore di quello dei trasposoni. I plasmidi contengono geni strutturali che conferiscono alla cellula batterica proprietà diverse e molto importanti per essa: plasmidi R - resistenza ai farmaci; Col-plasmidi: la capacità di sintetizzare le colicine; Plasmidi F: per trasferire informazioni genetiche; Tox-plasmidi: per sintetizzare una tossina; Plasmidi di biodegradazione: distruggono l'uno o l'altro substrato, ecc. I plasmidi possono essere integrati nel cromosoma (a differenza delle sequenze IS e dei trasposoni, sono costruiti in aree rigorosamente definite), oppure possono esistere autonomamente. In questo caso hanno la capacità di replicarsi autonomamente, ed è per questo che in una cellula possono esserci 2, 4, 8 copie di tale plasmide. Molti plasmidi contengono geni di trasmissibilità e sono in grado di essere trasferiti da una cellula all'altra durante la coniugazione (scambio di informazioni genetiche). Tali plasmidi sono chiamati trasmissibili.

Nei batteri esistono 2 tipi di variabilità: fenotipica e genotipica. La variabilità fenotipica - modificazione - non influisce sul genotipo, ma colpisce la maggior parte degli individui della popolazione. Le modifiche non vengono ereditate e svaniscono nel tempo, cioè ritornano al fenotipo originale dopo un numero maggiore (modifiche a lungo termine) o minore (modificazioni a breve termine) di generazioni. h La variabilità genotipica influenza il genotipo. Si basa su mutazioni e ricombinazioni. Le mutazioni nei batteri non sono fondamentalmente diverse dalle mutazioni nelle cellule eucariotiche. Una caratteristica delle mutazioni nei batteri è la relativa facilità di rilevamento, poiché è possibile lavorare con grandi popolazioni di batteri. Per origine le mutazioni possono essere: spontanee; indotto. Per lunghezza: punteggiato; genetico; cromosomico. Per direzione: dritto; - inversione.

La ricombinazione (scambio di materiale genetico) nei batteri differisce dalla ricombinazione negli eucarioti: i batteri hanno diversi meccanismi di ricombinazione; durante le ricombinazioni nei batteri non si forma uno zigote, come negli eucarioti, ma un merozigote (porta l'informazione genetica completa del ricevente e parte dell'informazione genetica del donatore sotto forma di integratore); in una cellula batterica ricombinante cambia non solo la qualità, ma anche la quantità dell'informazione genetica.

Coniugazione Nei batteri, metodo per trasferire materiale genetico da una cellula batterica a un'altra. In questo caso, due batteri sono collegati da un sottile ponte, attraverso il quale un pezzo di filamento di acido desossiribonucleico (DNA) passa da una cellula (donatore) a un'altra (ricevente). Le proprietà ereditarie del ricevente cambiano in base alla quantità di informazioni genetiche contenute nel pezzo di DNA trasferito.

Coniugazione Coniugazione (dal latino conjugatio - connessione), processo parasessuale - trasferimento unidirezionale di una parte del materiale genetico (plasmidi, cromosoma batterico) con contatto diretto di due cellule batteriche. Inaugurato nel 1946 da J. Lederberg e E. Taitem. Ha una grande importanza in natura, perché favorisce lo scambio di tratti utili in assenza di un vero processo sessuale. Di tutti i processi di trasferimento genico orizzontale, la coniugazione consente il trasferimento della maggior quantità di informazioni genetiche.

La coniugazione è lo scambio di informazioni genetiche nei batteri trasferendole da un donatore a un ricevente durante il loro contatto diretto. Dopo la formazione di un ponte di coniugazione tra il donatore e il ricevente, un filamento del DNA del donatore entra attraverso di esso nella cellula ricevente. Più lungo è il contatto, maggiore sarà la quantità di DNA del donatore che potrà essere trasferita al ricevente. Sulla base dell'interruzione della coniugazione a determinati intervalli, è possibile determinare l'ordine dei geni sul cromosoma dei batteri - per costruire mappe cromosomiche dei batteri (per mappare i batteri). Le cellule F+ hanno una funzione di donatore.

Trasduzione Esther Lederberg riuscì a isolare il batteriofago lambda, un virus a DNA, dall'Escherichia coli K 12 nel 1950. L'effettiva scoperta della trasduzione è associata al nome di Joshua Lederberg. Nel 1952, insieme a Norton Zinder, scoprirono la trasduzione totale. Nel 1953, Lederberg e colleghi dimostrarono l'esistenza di una trasduzione abortiva e, nel 1956, di una trasduzione specifica.

La trasduzione è lo scambio di informazioni genetiche nei batteri trasferendole da un donatore a un ricevente con l'aiuto di batteriofagi moderati (trasduttori). I fagi trasduttori possono trasportare 1 o più geni (caratteri). La trasduzione avviene: specifica: viene trasferito sempre lo stesso gene; non specifico: vengono trasmessi geni diversi. Ciò è dovuto alla localizzazione dei fagi trasduttori nel genoma del donatore: nel caso di trasduzione specifica, si trovano sempre nello stesso punto del cromosoma; a nonspecifico la loro localizzazione è mutabile.

Riso. 2. Trasduzione 1 - batterio - donatore (B+), 2 - fago, 3 - riproduzione, 4 - adsorbimento, 5 - batterio - ricevente (B-), 6 - batterio - ricevente con una nuova proprietà.

La trasformazione è lo scambio di informazioni genetiche nei batteri mediante l'introduzione di un preparato di DNA già pronto (appositamente preparato o isolato direttamente da una cellula donatrice) nella cellula batterica ricevente. Molto spesso, il trasferimento dell'informazione genetica avviene quando il ricevente viene coltivato su un mezzo nutritivo contenente il DNA del donatore. Per poter percepire il DNA del donatore durante la trasformazione, la cellula ricevente deve trovarsi in un certo stato fisiologico (competenza), che si ottiene mediante metodi speciali di elaborazione della popolazione batterica o avviene spontaneamente. Durante la trasformazione vengono trasmessi singoli segni (solitamente 1). La trasformazione è la prova più oggettiva della relazione del DNA o dei suoi frammenti con l'uno o l'altro tratto fenotipico, poiché nella cellula ricevente viene introdotta una preparazione di DNA puro.

Riso. 3. La trasformazione del ceppo capsulare dei batteri (1) durante la semina dà origine alla crescita (6). Dopo aver fatto bollire questa cultura, non c'è crescita (7). Il risultato di un simile esperimento con un ceppo senza capsule (4 -crescita +, 8 -crescita -) è simile. La combinazione in un unico contenitore dell'estratto della manioca (1) e della coltura viva dei ceppi non capsulari (3), seguita dalla semina, dà la crescita del ceppo capsulare (5).

Proprietà delle cellule delle colonie Forme S e R Forma S Forma R Le colonie sono ruvide, opache con bordi irregolari, spesso rugose Flagelli sono spesso assenti Capsule o strato mucoso assenti Biochimicamente meno attivi Debolmente virulento o avirulento Antigenicamente difettoso Scarsamente sensibile a fago La sospensione si deposita rapidamente, sedimento simile a una briciola, cellule polimorfiche Le colonie sono trasparenti, con una superficie liscia e lucida, rotonde, con bordi uniformi, convesse Le specie mobili hanno flagelli Le specie capsulari hanno una capsula o uno strato mucoso chiaramente visibile Biochimicamente più attive Vengono espresse proprietà virulente in specie patogene Antigenalmente completo Sensibile ai fagi Cellule in sospensione in soluzione salina omogenee, stabili, cellule di dimensioni normali

ricombinazione nei procarioti. Trasformazione. Coniugazione. Trasduzione. Caratteristiche della costruzione di mappe genetiche nei procarioti.

ricombinazione genetica

Di conseguenza si osserva la variabilità genotipica dei procarioti ri combinazione materiale genet dovuto alla combinazione parziale dei genomi di due cellule e si manifesta nel fenotipo batterico. Trasformazione, trasduzione e coniugazione portano alla variabilità ricombinativa nel materiale genetico dei procarioti.

A differenza degli eucarioti, nei quali durante il processo sessuale si forma un vero e proprio zigote che unisce il materiale genetico di entrambi i genitori, nei procarioti, in tutti e tre i processi sopra menzionati, si verifica solo un trasferimento parziale del materiale genetico dalla cellula donatrice alla cellula donatrice. si osserva la cellula ricevente, che porta ad uno zigote -I difettoso - merozigoti. Pertanto, la cellula ricevente procariotica diventa parzialmente diploide, conservando principalmente il genotipo della cellula ricevente e acquisendo solo alcune proprietà della cellula donatrice.

La responsabilità della ricombinazione è portata da geni speciali della cellula ricevente, chiamati geni rec. Il meccanismo di ricombinazione include una serie di fasi successive:
1) rottura dei filamenti di DNA della cellula ricevente;
2) inserimento di frammenti di DNA introdotti dalla cellula donatrice nel genoma della cellula ricevente;
3) replicazione del DNA ricombinante, dando origine alla progenie di cellule con un genoma modificato.

La prova del suddetto meccanismo di ricombinazione è stata ottenuta sperimentalmente studiando il processo di coniugazione di Escherichia coli (E. coli) utilizzando cellule donatrici marcate con fosforo (P 32).

Trasformazione(dal latino - trasformazione) - un cambiamento nel genoma e nelle proprietà dei batteri come risultato del trasferimento di informazioni quando un frammento di DNA libero penetra dall'ambiente nella cellula. La trasformazione non richiede il contatto diretto tra la cellula donatrice e la cellula ricevente. La fonte della trasformazione del DNA può essere una coltura batterica appena uccisa o preparati puri di DNA da essa estratti.

Il fenomeno della trasformazione dei batteri fu osservato per la prima volta da F. Griffiths nel 1928. Scoprì che quando un pneumococco capsulare virulento di tipo S ucciso con pneumococco di tipo R non capsulare virulento vivo viene iniettato nel corpo dei topi, tutti gli animali muoiono. Allo stesso tempo, i pneumococchi capsulari virulenti di tipo S vengono isolati dal sangue di topi morti insieme ai pneumococchi di tipo R non capsulari. Griffiths non riuscì a spiegare il fenomeno della trasformazione. Solo nel 1944, O. Avery, K. McLeod e M. McCarthy isolarono la sostanza trasformante dalle cellule morte dei pneumococchi capsulari e dimostrarono che è il DNA sensibile alla DNA polimerasi.

Il processo di trasformazione avviene in diverse fasi:
1) adsorbimento del DNA in trasformazione sulla superficie di una cellula ricevente competente;
2) scissione enzimatica del DNA trasformante con formazione di frammenti di peso molecolare medio (4-5)·10 6 ;
3) penetrazione di frammenti di DNA nella cellula ricevente, accompagnata dalla degradazione di una delle catene di DNA e dalla formazione di frammenti a filamento singolo;
4) integrazione: inclusione di frammenti di DNA trasformante nel DNA della cellula ricevente mediante scambio genetico;
5) espressione - riproduzione intensiva di cellule trasformate, la cui prole avrà un gene modificato nella molecola del DNA.

Il frammento di DNA in trasformazione corrisponde solitamente allo 0,3% del cromosoma batterico, ovvero a circa 15 geni. Un frammento di DNA molto piccolo penetra nella cellula ricevente, provocando la trasformazione di un solo carattere e raramente di due. Trasformandosi da una cellula all'altra si possono trasferire caratteristiche batteriche come la resistenza ai farmaci, la capacità di sintetizzare polisaccaridi capsulari, enzimi, alcuni metaboliti, ecc. Durante la trasformazione non viene aggiunto un tratto ereditario qualitativamente nuovo, si osserva solo la sostituzione di un tratto con un altro.

trasduzione consiste nel trasferimento del materiale genetico dalla cellula donatrice alla cellula ricevente da parte di un batteriofago moderato. Il fenomeno della trasduzione fu scoperto nel 1952 da N. Zinder e J. Lederberg usando come esempio due ceppi di Salmonella.

Secondo il meccanismo di interazione con una cellula batterica, i fagi sono divisi in virulenti e temperati. I fagi virulenti, penetrando nella cellula, provocano la formazione di nuovi fagi e la lisi dei batteri. L'infezione delle cellule da parte dei fagi temperati non è sempre accompagnata da lisi batterica; alcuni di essi sopravvivono e diventano lisogenici. Nei batteri lisogeni, il DNA fagico viene incorporato nelle cellule del DNA e il fago temperato si trasforma in un profago, perdendo la capacità di lisare la cellula batterica. Il profago si comporta come una parte del cromosoma batterico e si riproduce al suo interno per numerose generazioni. Il rilascio di fagi temperati dalle cellule dei batteri lisogeni avviene spontaneamente o sotto l'azione di batteri lisogeni avviene spontaneamente o sotto l'azione di agenti indotti: raggi ultravioletti, radiazioni ionizzanti e mutageni chimici.

Durante la riproduzione di alcuni fagi temperati, un piccolo frammento del cromosoma batterico viene incorporato nel genoma fagico. Il fago trasduttore trasferisce il frammento di DNA dell'ospite precedente in una nuova cellula batterica ad esso sensibile. Pertanto, la cellula batterica ricevente diventa uno zigote parziale.

Si distinguono i batteri 3 tipi di trasduzione: specializzato, generale e abortivo.

Specializzato- il genoma del fago comprende geni del DNA rigorosamente definiti del batterio donatore situati sul cromosoma batterico direttamente accanto al profago. I geni adiacenti al profago vengono scissi dal cromosoma del batterio e alcuni geni del profago rimangono nella sua composizione. I fagi trasduttori difettosi rilasciati dalla cellula donatrice causano la lisogenesi della cellula ricevente. Il DNA del fago difettoso viene incorporato nel cromosoma della cellula ricevente, portandovi i geni del batterio donatore.

Generale- differisce da quello speciale in quanto qualsiasi frammento di DNA del batterio donatore è incluso nel DNA dei fagi. Pertanto, nella trasduzione generale, i fagi trasduttori trasferiscono qualsiasi gene che controlla vari tratti dal cromosoma del batterio donatore alla cellula del batterio ricevente.

Abortivo - il frammento cromosomico della cellula donatrice, introdotto dal fago trasduttore nella cellula ricevente, non è incluso nel suo cromosoma, ma è localizzato nel citoplasma e, durante la divisione della cellula ricevente, viene trasferito ad una sola delle cellule risultanti .

La trasduzione nell'esperimento viene mostrata su batteri intestinali, Pseudomonas, stafilococchi, bacilli e attinomiceti. La trasduzione determina la comparsa di varietà batteriche con nuove proprietà, resistenza ai farmaci, sintesi di enzimi, amminoacidi, ecc.

Negli esperimenti di ingegneria genetica, la trasduzione apre non solo ampie opportunità per l'ibridazione interspecifica dei batteri, ma anche la possibilità di ottenere ibridi tra diversi gruppi di procarioti.

Coniugazione avviene con il contatto diretto delle cellule del batterio e prevede il trasferimento diretto del materiale genetico dalla cellula donatrice alla cellula ricevente. Il fenomeno della coniugazione fu descritto nel 1946 da J. Lederberg ed E. Tatum usando l'esempio del ceppo K 12 di E. coli.

La capacità dei batteri di coniugarsi è associata alla presenza del fattore F sessuale, che è uno dei plasmidi coniugativi. Le celle che portano il fattore F sono designate F + ; cellule prive del fattore F - F ¯ . Il fattore F (plasmide F) nelle cellule F + è solitamente in uno stato isolato dalla coltura batterica ed è una struttura citoplasmatica. Le cellule batteriche contenenti il ​​fattore F differiscono dalle altre cellule per una serie di proprietà: una carica superficiale alterata e la capacità di sintetizzare strutture superficiali aggiuntive dei pili F.

Il processo di coniugazione inizia con l'attacco dell'estremità F-pili della cellula donatrice alla cellula ricevente. Nel giro di pochi minuti, la cellula donatrice e la cellula ricevente si avvicinano, forse a causa della riduzione dei pili F, ed entrano in contatto diretto. Attraverso il ponte citoplasmatico attraverso il canale F-pili, in meno di 5 minuti, il fattore F sessuale viene trasferito, indipendentemente dal cromosoma batterico, dal citoplasma della cellula donatrice F + al citoplasma della cellula ricevente F ¯. Allo stesso tempo, la cellula donatrice non perde la sua capacità di donatore, poiché in essa rimangono copie del fattore F.

Nella popolazione delle cellule F+ esistono batteri capaci di coniugare non il fattore F, ma un frammento del cromosoma batterico. Queste cellule batteriche e i ceppi da esse formati vengono denominati Hfr (alta frequenza di ricombinazione), che significa batteri con un'alta frequenza di ricombinazione. Le ricombinazioni tra cellule Hfr e cellule F ¯ avvengono mille volte più spesso che tra cellule F + e F ¯. La differenza tra le cellule Hfr e le cellule F+ è che il fattore F sessuale è incluso nel cromosoma batterico. Durante la coniugazione, la replicazione del DNA avviene nella cellula donatrice di Hfr. In questo caso, una delle catene di DNA replicanti attraverso il ponte di coniugazione penetra nella cellula ricevente F ¯ , la seconda rimane nella cellula donatrice di Hfr, quindi ciascuna di queste catene si completa con un filamento complementare. Il ponte di coniugazione è fragile, si rompe facilmente, quindi non l'intero cromosoma, ma solo un frammento di esso, viene trasferito dalla cellula donatrice Hfr alla cellula ricevente F¯.

M/y del frammento cromosomico trasferito dalla cellula Hfr e dalla regione omologa del cromosoma della cellula F ¯ avviene uno scambio genetico. Di conseguenza, una parte del DNA del donatore viene inserita nel DNA del ricevente e la parte corrispondente del DNA del ricevente ne viene esclusa. L'efficienza di incorporazione del DNA del donatore nel cromosoma del ricevente è elevata ed è pari a circa 0,5.

La coniugazione dei procarioti non dovrebbe essere identificata con il processo sessuale degli eucarioti, perché durante la coniugazione solo una parte del materiale genetico della cellula F + viene trasferita alla cellula F ¯, dando luogo alla formazione di un merozigote inferiore. La base di quest'ultimo è il genoma della cellula ricevente con la parte introdotta del genoma della cellula donatrice.

Insieme alla stabilità e all'accuratezza delle proprietà ereditarie, l'apparato genetico dei procarioti è caratterizzato dalla variabilità, che si manifesta sotto forma di mutazioni e ricombinazioni.

Le mutazioni spontanee dei procarioti dovrebbero essere considerate il tipo iniziale di variabilità emersa parallelamente all'inizio del funzionamento del loro DNA come struttura genetica. È possibile che per milioni di anni le mutazioni siano state l'unico meccanismo per la variabilità dei procarioti.

Un salto nell'evoluzione dei procarioti è stato l'emergere della variabilità ricombinativa, che consiste nell'unificazione parziale dell'informazione genetica di due cellule procariotiche del donatore e del ricevente. Quello. c'era un nuovo materiale aggiuntivo per la selezione naturale, accelerando il processo di evoluzione. Dei tre processi ricombinativi discussi sopra, la coniugazione è il più perfetto, poiché fornisce uno scambio più completo di informazioni genetiche tra due cellule. Sono noti casi in cui la coniugazione a lungo termine (90 minuti) di due cellule di E. coli porta all'ingresso dell'intero cromosoma della cellula donatrice nella cellula ricevente.

L'efficienza delle loro ricombinazioni genetiche è elevata solo per i batteri strettamente correlati che sono imparentati all'interno della specie.

Caratteristiche della costruzione di mappe genetiche nei procarioti

Per costruire mappe genetiche nei procarioti, viene utilizzato il fenomeno coniugazioni– trasferimento di materiale genetico da una cellula all’altra con l’aiuto di speciali molecole circolari di DNA (plasmidi, in particolare, con l’aiuto di plasmidi F).

La probabilità di trasferire un determinato gene nella cellula ricevente dipende dalla sua rimozione dal DNA del plasmide F, o meglio, dal punto O, in cui inizia la replicazione del DNA del plasmide F. Più lungo è il tempo di coniugazione, maggiore è la probabilità di trasferire un dato gene. Ciò rende possibile creare una mappa genetica dei batteri in pochi minuti di coniugazione. Ad esempio, nell'Escherichia coli, il gene thr (un operone di tre geni che controllano la biosintesi della treonina) si trova nel punto zero (cioè direttamente accanto al DNA plasmidico F), il gene lac viene trasferito dopo 8 minuti, il gene recE dopo 30 minuti, il gene argR - dopo 70 minuti, ecc.

La ricombinazione genetica negli eucarioti è la formazione di individui con una nuova combinazione di tratti come risultato del processo sessuale. Un nuovo individuo riceve diversi geni da un genitore e diversi da un altro genitore geneticamente diverso. Attraverso il processo di ricombinazione, aumenta il numero di cambiamenti ereditari che possono essere influenzati dalla selezione.

Nei procarioti, la ricombinazione genetica si riferisce ai cosiddetti processi parasessuali. In questi organismi sono noti tre processi attraverso i quali il materiale genetico di due genitori diversi può ricombinarsi. Queste sono trasformazione, coniugazione e trasduzione. Tuttavia, nessuno di questi processi comporta una vera fusione cellulare o una fusione completa dei nucleoidi. Solo una parte del materiale genetico della cellula donatrice viene trasferita alla cellula ricevente. Il ricevente diventa quindi diploide perché parte del suo materiale genetico è integrato dal materiale genetico del donatore.

In uno zigote così incompleto, chiamato merozigote, formato a seguito del trasferimento genico, il materiale genetico della cellula ricevente è chiamato endogeno e il frammento genetico trasferito dal donatore è chiamato esogeno. Tipicamente, le parti esogene ed endogene si uniscono e si scambiano i segmenti immediatamente dopo il trasferimento.

Trasformazioneè un processo di trasferimento genico in cui una porzione del DNA di una cellula donatrice, ottenuta mediante estrazione o mediante lisi cellulare naturale, può entrare in una cellula batterica ricevente correlata (della stessa specie o di specie strettamente correlate). Di conseguenza, frammenti del cromosoma del DNA del donatore vengono inclusi nel DNA del ricevente, provocando un cambiamento nelle caratteristiche del batterio ricevente.

Il processo di trasformazione può essere suddiviso in più fasi: 1 - Contatto del DNA con la superficie cellulare; 2 - penetrazione del DNA nella cellula; 3 - connessione del DNA trasformante con il frammento corrispondente del cromosoma del ricevente. L'ulteriore processo è associato alla ricombinazione di una parte della molecola di DNA trasformante esogeno con il DNA cromosomico endogeno ricevente. L'ultima fase è la replicazione di nuove informazioni incluse nel cromosoma.

In condizioni di laboratorio, la trasformazione viene eseguita come segue. Il DNA di un particolare ceppo batterico viene estratto, purificato e mescolato con cellule batteriche di un altro ceppo che differisce dal primo per una o più proprietà ereditarie. La coltura del microrganismo in esame viene lasciata crescere. Nella progenie si può trovare un piccolo numero di cellule con alcune proprietà del ceppo da cui è stato estratto il DNA.

Accade raramente che una singola cellula batterica acquisisca più di una nuova proprietà a seguito della trasformazione. La trasmissione attraverso il DNA di un numero maggiore di tratti si osserva solo se la coltura del microbo donatore è geneticamente vicina alle cellule del microbo ricevente.

Con l'aiuto della trasformazione del DNA è possibile trasmettere caratteristiche come la formazione di capsule, la sintesi delle sostanze necessarie per la cellula, l'attività enzimatica, la resistenza ai veleni, agli antibiotici e ad altre sostanze medicinali.

La trasformazione è stata osservata in molti batteri, in particolare nei rappresentanti dei generi Bacillus, Rhizobium, Streptococcus, ecc.

Coniugazione- un processo in cui le cellule madri avvicinate vengono solitamente collegate con l'aiuto di ponti di coniugazione, attraverso questi ultimi avviene uno scambio di materiale genetico. La coniugazione è stata studiata in vari batteri (Escherichia, Shigella, Salmonella, Pseudomonas), in particolare è stata ben studiata in Escherichia coli.

La capacità di una cellula di diventare donatrice è determinata dal fattore sessuale specifico F (dall'inglesefertilità - fertilità), che, durante la coniugazione, viene trasferito da una cellula batterica all'altra. Queste cellule erano chiamate cellule F+. Le cellule batteriche che non hanno un fattore F sono destinatari di materiale genetico e sono designate F - Il fattore sessuale F è uno dei plasmidi coniugativi ed è una molecola di DNA circolarmente chiusa con un peso molecolare di 64x106 a. mangiare. Il plasmide F provoca la formazione di uno o due cosiddetti pili sessuali, o pili F, sulla superficie cellulare, che facilitano la connessione delle cellule donatrici con le cellule riceventi, nonché la replicazione cromosomica indipendente del proprio DNA e la formazione di prodotti che garantiscono il trasferimento di materiale genetico come la maggior parte dei plasmidi F e dei cromosomi cellulari. Il plasmide F si trova autonomamente nel citoplasma, all'esterno del cromosoma batterico. Tuttavia, ha la capacità di essere incluso (e integrato) in determinati punti del cromosoma batterico e di diventarne parte.

Come risultato dell'integrazione del plasmide F nella composizione del cromosoma batterico, si forma il cosiddetto ceppo Hfr (alta frequenza di ricombinazione - alta frequenza di ricombinazione). Quando un ceppo Hfr viene incrociato con batteri F -, di norma il fattore F non lo è

Viene trasmesso e i geni del cromosoma batterico vengono trasmessi con una frequenza abbastanza alta. All'inizio del processo di coniugazione, le cellule donatrici F+ o Hfr sono collegate alle cellule riceventi (a causa della presenza di F-pili nei donatori). Successivamente, tra le cellule si forma un ponte di coniugazione e attraverso di esso, dalla cellula donatrice alla cellula ricevente, viene trasferito il materiale genetico o plasmidi F o cromosomi. Di solito, durante la coniugazione, viene trasferito solo un filamento del DNA del donatore e il secondo filamento (complementare) viene completato nella cellula ricevente. Il trasferimento, di regola, inizia da un'estremità del cromosoma e continua con il successivo trasferimento di altre parti di esso (Fig. 21).

Il trasferimento del materiale genetico può essere impedito in qualsiasi momento separando le coppie coniugate agitando vigorosamente la sospensione di microrganismi nel mezzo liquido. In questo caso, solo alcune delle proprietà delle cellule maschili vengono trasferite alla cellula femminile e possono manifestarsi nella prole. Prima o poi, nella maggior parte delle coppie coniugate, il trasferimento si interrompe anche quando non sono separate artificialmente. Questo perché il ponte di coniugazione è fragile e facilmente distrutto senza compromettere la vitalità cellulare.

Pertanto, a seguito della coniugazione, la cellula ricevente F - si trasforma in un merozigote contenente, a causa dell'interruzione spontanea del trasferimento di materiale genetico, solo una parte del cromosoma donatore F + oltre al proprio cromosoma. Come risultato del processo di crossover (incrocio di cromosomi, in cui i geni cambiano di posto), che si osserva anche in altri organismi, si forma una nuova combinazione di materiale genetico. A seconda della posizione del materiale genetico scambiato, nella prole possono verificarsi diversi tipi di ricombinanti.

trasduzione- il processo di trasferimento del materiale genetico da una cellula batterica all'altra mediante un batteriofago. In altre parole, il fago svolge allo stesso tempo il ruolo di gamete, trasferendo un frammento di DNA della cellula donatrice nella cellula ricevente. La trasduzione avviene con la partecipazione dei fagi temperati.

Sono noti tre tipi principali di trasduzione: generale (non specifica), localizzata (specifica) e abortiva. Nella trasduzione non specifica, vari frammenti di DNA vengono trasferiti dai batteri donatori ai batteri riceventi con l'aiuto di fagi trasduttori moderati. In questo caso, il frammento di DNA donatore portato dal fago può essere incluso nella regione di DNA omologa della cellula ricevente mediante ricombinazione.

La trasduzione specifica è caratterizzata dalla capacità di un fago di trasferire solo determinati geni dai batteri donatori ai batteri riceventi. Ciò è dovuto al fatto che la formazione del fago trasduttore avviene a seguito della combinazione del suo DNA con geni batterici rigorosamente definiti situati sul cromosoma della cellula donatrice. Si ritiene che ciascuna particella fagica porti con sé un solo gene batterico o diversi geni vicini.

A Trasduzione abortiva Il frammento cromosomico della cellula donatrice portato dal fago non è incluso nel cromosoma della cellula ricevente, ma si trova autonomamente nel suo citoplasma e può funzionare in questa forma. Nel processo di divisione cellulare - il ricevente, il frammento di DNA trasdotto - il donatore può essere trasferito solo su una delle due cellule figlie, cioè viene ereditato in modo unilineare e quindi si perde nella prole.

Durante la trasduzione è possibile trasferire geni che controllano le caratteristiche nutrizionali dei batteri, la loro resistenza ai farmaci, l'attività enzimatica, l'apparato locomotore (flagelli) e altre proprietà.

Il trasferimento di tratti mediante il processo di trasduzione è stato riscontrato in rappresentanti dei generi Bacillus, Pseudomonas, Salmonella, Escherichia, ecc.

Il processo di formazione di genomi contenenti materiale genetico da due forme parentali. Nei batteri, viene effettuato a seguito di coniugazione, trasformazione, trasduzione.

Le ricombinazioni si dividono in legali e illegali. La ricombinazione legittima richiede tratti estesi e complementari di DNA nelle molecole ricombinanti. Si verifica solo tra specie di microrganismi strettamente imparentati.

La ricombinazione illecita non richiede regioni di DNA complementari estese.

Trasformazione- il processo di assorbimento da parte di una cellula di un organismo di una molecola di DNA libera dall'ambiente e di incorporarla nel genoma, che porta alla comparsa in tale cellula di nuovi tratti ereditari caratteristici dell'organismo donatore di DNA. Cellule in grado di accettare un donatore
nuyu DNA sono chiamati competenti. Lo stato di competenza è di breve durata. Si verifica durante un certo periodo di crescita di una coltura batterica.In uno stato di competenza, la parete cellulare batterica diventa permeabile ai frammenti di DNA altamente polimerici. Apparentemente, ciò è dovuto al fatto che il frammento di DNA trasformato si lega alla proteina, formando un trasformasoma, nel quale viene trasferito nella cellula batterica. Processo di trasformazione:

1) Adsorbimento del DNA del donatore sulla cellula ricevente.

2) penetrazione del DNA nella cellula ricevente;

3) connessione del DNA con una regione omologa del cromosoma del ricevente con successiva ricombinazione.

Dopo la penetrazione nella cellula, il DNA in trasformazione viene despiralizzato. Quindi, uno dei due filamenti di DNA del donatore viene fisicamente incorporato nel genoma del ricevente.

trasduzione- il processo di trasferimento del DNA batterico da una cellula all'altra da parte di un batteriofago.

Non specifico: i fagi trasduttori sono solo portatori di materiale genetico da un batterio all'altro, poiché il DNA fagico stesso non partecipa alla formazione di ricombinanti.

specifica: caratterizzato dalla capacità di un fago di trasferire determinati geni da un batterio donatore a un batterio
destinatario.

abortivo: il frammento di DNA del batterio donatore portato dal fago non è compreso nel cromosoma del batterio ricevente, ma si trova nel citoplasma.

Coniugazione- trasferimento unidirezionale di una parte del materiale genetico mediante contatto diretto di due cellule batteriche.

Il primo passo è l'attacco della cellula donatrice alla cellula ricevente con l'aiuto dei villi genitali, poi tra le due cellule si forma un ponte di coniugazione attraverso il quale il fattore F e altri plasmidi situati nel citoplasma del batterio donatore in modo autonomo lo stato può essere trasferito dalla cellula donatrice alla cellula ricevente.

Trasposizione- movimento di alcuni elementi genetici da un punto all'altro del cromosoma.

infezione da digestione microbica

La ricombinazione è il processo di scambio di materiale genetico rompendo e unendo molecole diverse. La ricombinazione avviene per riparare le rotture del doppio filamento nel DNA e per continuare la replicazione quando la forca di replicazione si ferma negli eucarioti, nei batteri e negli archaea. I virus possono ricombinarsi tra le molecole di RNA dei loro genomi.

La ricombinazione negli eucarioti avviene solitamente durante il passaggio durante la meiosi, in particolare durante la formazione di spermatozoi e uova negli animali. La ricombinazione, insieme alla replicazione del DNA, alla trascrizione dell'RNA e alla traduzione delle proteine, appartiene alla fondamentale e precoce ricombinazione omologa

Ricombinazione omologa

Classificazione dei tipi di ricombinazione omologa: allelica, ectopica e omeologa; reciproci (crossing over) e non reciproci (conversione genica).

ricombinazione reciproca. Prime idee sulla natura del crossover: le ipotesi “break and join” e “copia selettiva”. Esperimenti di Meselson sulla dimostrazione del meccanismo di "interruzione e connessione". Sviluppo di approcci metodologici allo studio dei meccanismi molecolari di ricombinazione. Due fasi della formazione del DNA ricombinante: molecole “congiunte” e ricombinanti primarie.

Controllo genetico della ricombinazione omologa nei batteriofagi. Il sistema Rosso nel batteriofago l. Esonucleasi l. Sistema Orf. Batteriofago T4: il ruolo dei geni 30, 32, 43, 46, 47, 49 e uvsX. Enzimologia delle reazioni di ricombinazione: endo- ed esonucleasi, DNA polimerasi, DNA ligasi, proteina UvsX, proteina SSB ed altre proteine. Processi di “spostamento del filamento”, formazione del D-loop, “migrazione dei rami”, correzione eteroduplex. Le fasi principali del crossover sono la presinapsi, la sinapsi e la postsinapsi. Modelli di incrocio nei batteriofagi. Generalità sui processi di ricombinazione e riparazione del DNA.

Modelli base di ricombinazione omologa. Modello festivo. Background del modello, essenza, valore. Sviluppo del modello negli studi successivi, il suo stato attuale. Modello di lettura di Meselson. Un modello di riparazione della rottura del doppio filamento (DNR) del DNA nel lievito (Zhostak et al.) applicato al crossover e alla conversione.

Ricombinazione durante la trasformazione del DNA cromosomico nei batteri. parametri di ricombinazione. Dimensioni dei frammenti di DNA del donatore integrabili. Cinetica ed efficienza della trasformazione. Prova dell'integrazione di frammenti a filamento singolo di DNA del donatore. Controllo genetico e principali fasi del processo di trasformazione in Bacillus subtilis e Streptococcus pneumoniae. Complesso donatore-ricevente. Controllo genetico e meccanismo di ricombinazione durante la trasformazione in Haemophilus influenzae. Transformosoma.

Ricombinazione durante la coniugazione in Escherichia coli. Caratterizzazione del trasferimento della coniugazione del DNA. Meccanismi di integrazione del DNA del donatore nel cromosoma della cellula ricevente.

Controllo genetico della ricombinazione omologa in E. coli. Geni coinvolti nella presinapsi: recA, recB, recC, recD, recE, recJ, ecc. Effetto pleiotropico delle mutazioni recB e recC. Nucleasi RecBCD ATP-dipendente, sue attività, meccanismi d'azione e ruoli in vari processi genetici. Sito Chi come hotspot di ricombinazione. Universalità delle nucleasi ATP-dipendenti per i batteri. Geni che controllano il processo di sinapsi: recA, recF, recO, recR, ssb, ecc. Proprietà dei mutanti recA. Proteina RecA, sue caratteristiche. Reazioni catalizzate dalla proteina RecA, suo ruolo chiave nelle prime fasi del processo di crossover: presinapsi e sinapsi. La natura della sinapsi nella ricombinazione omologa. Filamenti di DNA RecA, loro struttura e funzioni nella ricombinazione. Schema di crossover in E. coli che coinvolge la nucleasi RecBCD e la proteina RecA. Omologhi di RecA in altri organismi procarioti ed eucarioti. Il ruolo della proteina SSB. Geni post-sinapsi: ruvA, ruvB, ruvC, recG e loro prodotti. Il ruolo nell'implementazione della migrazione del semi-chiasma di Holliday e nella sua risoluzione.

Mutazioni soppressorie in sbcA, sbcB, sbcC e sbcD. Esonucleasi I e VIII. Nucleasi SbcCD. Tre vie di ricombinazione del DNA cromosomico in E. coli K-12 secondo Clark: RecBCD, RecF e RecE, le loro caratteristiche. Il ruolo delle vie RecF e RecE nella ricombinazione omologa dei plasmidi.

Caratteristiche del processo di crossover negli eucarioti. Crossover meiotico. Il ruolo del complesso sinaptonemico. Controllo genetico della ricombinazione meiotica. Diversità delle proteine ​​​​simili a RecA (ricombinasi) negli eucarioti.

Crossing mitotico: relazione tra ricombinazione reciproca e non reciproca. Crossing nelle celle G1. Differenze nel controllo genetico del crossover meiotico e mitotico nei lieviti saccaromiceti.

Hotspot di ricombinazione negli eucarioti. Il ruolo del DNA DNR nell'inizio del crossover meiotico e mitotico.

Riparazione ricombinante del DNR nel DNA cromosomico e plasmidico nel lievito. Controllo genetico e una varietà di meccanismi: il modello di Zhostak et al. e sue modifiche, “break and copy”, “annealing of complementari filamenti di DNA” (“single-strand annealing”), meccanismi di “ligazione omologo-dipendente”.

Ricombinazione ectopica, suo controllo genetico, meccanismi molecolari e significato biologico.

Conversione genica (correzione dell'eteroduplex di ricombinazione). Non reciprocità della ricombinazione intragenica. Ipotesi di correzione del mismatch (Hallyday). Controllo genetico e modi per correggere gli eteroduplex in E. coli. Sistemi per la riparazione di basi spaiate con formazione e accumulo di gap estesi nell'eteroduplex. Sistema Mut HLSU, sue caratteristiche. Modello molecolare di correzione eteroduplex con la partecipazione del sistema MutHLSU. Conservatorismo evolutivo delle proteine ​​MutL e MutS. Ruolo delle proteine ​​MutL e MutS nei processi di correzione delle basi misappaiate e nella regolazione della ricombinazione omeologa. Sistemi di correzione del disadattamento in E. coli con formazione e riempimento di brevi lacune. Correzione degli eteroduplex durante la trasformazione batterica, suo controllo genetico (sistema Hex), influenza sui risultati della mappatura genetica. Correzione e alta interferenza negativa.

Conversione genica negli eucarioti. Analisi tetrade degli incroci interallelici. Tipi di quaderni. Polarità di conversione, sue cause. Coconversione. La lunghezza della sezione di conversione. La questione della relazione tra conversione meiotica e ricombinazione reciproca dei marcatori del fianco. Conversione del gene allelico mitotico. Conversione ectopica meiotica e mitotica. Commutazione dei loci MAT nei lieviti omotallici. Controllo genetico della conversione genetica negli ecarioti utilizzando il lievito e l'uomo come esempi. Omologhi eucariotici delle proteine ​​batteriche MutL e MutS - famiglie di proteine ​​PMS, MHL, MHS, ecc., le loro funzioni nella ricombinazione e altri processi cellulari. Complessità dei sistemi di correzione del disadattamento negli eucarioti basati sulla partecipazione di vari omologhi delle proteine ​​batteriche MutL e MutS.

Il ruolo della conversione nell'evoluzione e nell'ontogenesi. Relazione tra processi di crossover e conversione in diversi sistemi genetici. Processi di conversione che avvengono indipendentemente dal crossover.

Processi di ricombinazione che non necessitano di omologia per la sinapsi

Ricombinazione sito-specifica. Distribuzione dei sistemi di ricombinazione sito-specifici nei procarioti e negli eucarioti, loro funzioni. Topoisomerasi sito specifiche di tipo I come proteine ​​chiave della ricombinazione sito specifica in batteriofagi, batteri e lieviti. Le due famiglie di topoisomerasi I site-specific sono le integrasi e le resolvasi.

Ricombinazione sito-specifica durante l'integrazione e l'escissione del fago l. Lo schema di Campbell. Differenze tra le mappe genetiche del fago vegetativo e del profago. Struttura dei siti attP e attB. Sistema int. Proteina Int come rappresentante della famiglia delle integrasi. Proteina IHF di E.coli. Intasoma. Modello molecolare di integrazione ed escissione dei fagi l. Allineamento antiparallelo dei siti att durante la sinapsi. La natura della sinapsi nella ricombinazione sito-specifica.

Inversioni del DNA sito-specifiche in batteriofagi e batteri (sistema Din) e nel lievito. Le proteine ​​chiave della ricombinazione sono le invertasi come membri della famiglia delle resolvas. Miglioratori della ricombinazione per inversioni sito-specifiche. Proteina Fis E.coli. Invertasoma. Modello molecolare della ricombinazione effettuata dalle resolvasi. Il ruolo delle inversioni sito-specifiche nella regolazione dell'espressione genica.

Trasposizioni di elementi genetici mobili. Trasposizioni nei procarioti. Elementi genetici mobili: elementi IS, trasposoni (Tn), fago Mu. La struttura degli elementi in movimento. Funzioni controllate da vari elementi mobili. Trasporre. Partecipazione delle proteine ​​della cellula ospite alla trasposizione. La questione della specificità dell'integrazione di un elemento mobile in un bersaglio del DNA. La generalità delle reazioni che compongono i processi di trasposizione in diversi tipi di elementi mobili di procarioti ed eucarioti.

Organizzazione genetica dei trasposoni semplici della famiglia Tn3. Geni tnpA e tnpR, loro prodotti. Trasposizione replicativa, due fasi del processo. Modello molecolare di Shapiro. Controllo genetico e meccanismo molecolare della trasposizione non replicativa nei trasposoni complessi Tn5, Tn9 e Tn10. Controllo genetico e meccanismi di trasposizione nel fago Mu. Trasposoma.

Trasposoni coniugativi di batteri gram-positivi e gram-negativi, loro classificazione. Controllo genetico e meccanismi di trasposizione. significato biologico.

Elementi genetici mobili degli eucarioti (lieviti, piante, Drosophila, mammiferi). Classificazione degli elementi mobili negli eucarioti. Elementi con struttura di tipo procariotico. Retrotrasposoni di tipo I in lieviti, piante e animali, loro struttura, controllo genetico e meccanismo di trasposizione, classificazione. Retrotrasposoni di tipo II: caratteristiche strutturali, distribuzione, meccanismo di trasposizione.

Effetti genetici causati da elementi mobili nei procarioti e negli eucarioti: cambiamenti nell'espressione genica, mutazioni genetiche, riarrangiamenti cromosomici, disgenesia ibrida. La partecipazione di elementi mobili nell'organizzazione della struttura dei cromosomi. Ruolo nell'ontogenesi degli organismi viventi e nell'evoluzione del materiale genetico. Elementi mobili come strumento per la ricerca genetica.

ricombinazione illegale. La gamma dei fenomeni riconducibili alla ricombinazione illegale. Ricombinazione non omologa nei batteri catalizzata dalla DNA girasi. Modello molecolare (Ikeda). Ricombinazione non omologa che coinvolge la proteina chinasi DNA-dipendente nei vertebrati. Ruolo nella riparazione delle rotture del doppio filamento, integrazione del DNA esogeno nei cromosomi e riarrangiamenti delle sequenze di DNA delle immunoglobuline.

Riarrangiamenti di ricombinazione programmata di materiale genetico nell'ontogenesi

Unione di parti disconnesse di geni mediante ricombinazione sito-specifica durante la sporulazione nel Bacillus subtilis e durante la formazione di eterocisti nei cianobatteri filamentosi. Riarrangiamento del materiale genetico durante la formazione del macronucleo nei ciliati ciliati. Diminuzione della cromatina in un numero di rappresentanti di invertebrati.

Ricombinazione sito-specifica nei vertebrati coinvolti nei riarrangiamenti delle sequenze di DNA delle immunoglobuline. Struttura delle molecole di immunoglobuline. Organizzazione e struttura delle sequenze di DNA coinvolte nella formazione dei geni che codificano per le immunoglobuline. Ruolo dei prodotti dei geni RAG1 e RAG2. Il meccanismo di ricombinazione sito-specifica durante l'aggancio di segmenti codificanti di geni immunoglobulinici. Partecipazione di altri processi genetici nella formazione dei geni delle immunoglobuline: ricombinazione omologa (crossover mitotico ectopico, conversione mitotica ectopica), ricombinazione illegale, ipermutagenesi, splicing alternativo. Il confinamento di questi processi a determinati stadi di differenziazione dei linfociti B.

La trasformazione è il processo di assorbimento da parte di una cellula di un organismo di una molecola di DNA libera dall'ambiente e la sua integrazione nel genoma, che porta alla comparsa in tale cellula di nuovi tratti ereditari, caratteristici dell'organismo-donatore di DNA. A volte la trasformazione è intesa come qualsiasi processo di trasferimento genico orizzontale, inclusa la trasduzione, la coniugazione, ecc.

Trasformazione dei procarioti

In qualsiasi popolazione, solo una parte dei batteri è in grado di assorbire le molecole di DNA dall’ambiente. Lo stato delle cellule in cui ciò è possibile è chiamato stato di competenza. Di solito, il numero massimo di cellule competenti si osserva alla fine della fase di crescita logaritmica.

Nello stato di competenza, i batteri producono una speciale proteina a basso peso molecolare (fattore di competenza) che attiva la sintesi dell’autolisina, dell’endonucleasi I e della proteina legante il DNA. L'autolisina distrugge parzialmente la parete cellulare, consentendo al DNA di attraversarla e riduce anche la resistenza dei batteri allo shock osmotico. In uno stato di competenza diminuisce anche l’intensità complessiva del metabolismo. È possibile portare artificialmente le cellule in uno stato di competenza. A tale scopo, i mezzi con un alto contenuto di calcio, cesio, ioni rubidio, l'elettroporazione o le cellule riceventi vengono sostituiti con protoplasti senza pareti cellulari.

L'efficienza della trasformazione è determinata dal numero di colonie coltivate su una capsula Petri dopo l'aggiunta di 1 μg di DNA plasmidico superavvolto alle cellule e la semina delle cellule su un mezzo nutritivo. I metodi moderni consentono di raggiungere l'efficienza 106--109.

Il DNA assorbito dovrebbe essere a doppio filamento (l'efficienza della trasformazione del DNA a filamento singolo è inferiore di ordini di grandezza, ma aumenta leggermente in un ambiente acido), la sua lunghezza è di almeno 450 paia di basi. Il pH ottimale affinché il processo avvenga è intorno a 7. Per alcuni batteri (Neisseria gonorrhoeae, Hemophilus), il DNA per essere assorbito deve contenere determinate sequenze.

Il DNA viene adsorbito in modo irreversibile su una proteina legante il DNA, dopo di che uno dei filamenti viene tagliato dall'endonucleasi in frammenti di 2-4 mila paia di basi e penetra nella cellula, il secondo viene completamente distrutto. Se questi frammenti presentano un elevato grado di omologia con alcune regioni del cromosoma batterico, queste regioni possono essere sostituite da essi. Pertanto, l’efficienza della trasformazione dipende dalla distanza evolutiva tra donatore e ricevente. Il tempo totale del processo non supera alcuni minuti. Successivamente, durante la divisione, il DNA costruito sulla base del filamento di DNA originale entra in una cellula figlia e nell'altra cellula basata sul filamento con il frammento estraneo incluso (scissione).

Trasformazione di cellule eucariotiche utilizzando cationi polimerici sintetici

Consegna di acidi nucleici estranei in cellule intatte, o la trasformazione è alla base di molti metodi di ingegneria genetica. Il trasporto di geni funzionali nei tessuti può consentire di correggere carenze e mutazioni genetiche che provocano gravi patologie ereditarie o tumori cancerosi. Attualmente sono stati sviluppati numerosi metodi per introdurre il DNA nelle cellule, tra i quali i più comuni sono la precipitazione con fosfato di calcio o dietilamminoetil destrano (DEAE-destrano), elettroporazione, microiniezione, inclusione del DNA nel guscio ricostruito di virus o liposomi (artificiali vescicole lipidiche di membrana).

Nonostante la diversità di questi metodi, continua la ricerca di nuovi modi per trasformare le cellule pro ed eucariotiche. Da un lato ciò è dovuto alla necessità di aumentare l'efficienza della trasformazione, dall'altro i metodi sopra elencati sono applicabili solo a un numero limitato di linee cellulari e sono inefficaci quando si tenta di introdurre l'RNA nelle cellule. Infine, la maggior parte di questi approcci non può essere utilizzata per la trasformazione genetica in vivo.

Come trasportatori del DNA vengono utilizzati vettori retrovirali, vettori basati su virus contenenti DNA e HIV, liposomi basati su lipidi cationici e cationi polimerici che legano il DNA. L'uso di polimeri sintetici come trasportatori di DNA presenta numerosi vantaggi: facilità di conservazione e purificazione, facilità di test di tossicità e sicurezza e, cosa particolarmente importante per la terapia genica, riduzione del rischio di complicanze patogenetiche e immunologiche.

Quando soluzioni di policationi lineari e DNA vengono miscelati, si formano complessi interpolielettrolitici (IPEC) a causa della formazione di un sistema cooperativo di legami elettrostatici intercatena. In questo caso le catene policationiche circondano la molecola di DNA, formando sfere o toroidi, a seconda del tipo di polimero. L'inclusione nell'IPEC porta alla compattazione del DNA, all'aumento della sua resistenza alle nucleasi, migliora la sua interazione con la membrana cellulare e migliora l'attività di trasformazione in relazione sia alle cellule procariotiche che a quelle eucariotiche. Combinando molecole di policatione con ligandi capaci di legarsi specificatamente alla membrana cellulare, è possibile garantire la penetrazione dell'IPEC nella cellula attraverso la via del recettore e nel corpo - distribuzione mirata alle cellule bersaglio.

I sistemi di rilascio del DNA da utilizzare nella terapia genica devono garantire la penetrazione del DNA nell'organo, tessuto o gruppo specifico di cellule desiderato e quindi nel nucleo della cellula. Gli oligonucleotidi antisenso, che vengono spesso utilizzati nella terapia genica, devono trovare l'mRNA o la regione del DNA cromosomico contro cui sono diretti. Il gene introdotto deve essere incorporato in un costrutto capace di esprimerlo.

Tuttavia, questo è un problema piuttosto difficile. Quando un acido nucleico o un oligonucleotide vengono introdotti nel corpo, non raggiungeranno prevalentemente il tessuto o l'organo desiderato e la parte di essi che si troverà nel posto giusto sarà in grado solo in piccola parte di passare attraverso la cellula idrofobica membrana. Inoltre, nel corso dell'evoluzione, sono stati sviluppati meccanismi per proteggere le cellule del corpo dall'invasione di fattori ambientali, compreso il DNA estraneo. Una volta all'interno della cellula, il DNA estraneo potrebbe non essere localizzato dove necessario e, inoltre, potrebbe finire nei lisosomi, dove verrà distrutto dalle nucleasi.

La penetrazione nella cellula e il trasporto intracellulare dell'IPEC avviene, possibilmente, a causa della formazione e della successiva distruzione degli endosomi. In ogni fase di questo processo, una parte significativa del materiale viene persa. Lo scarso rilascio di vettori dagli endosomi nel citoplasma e il loro inefficiente trasferimento al nucleo portano a una bassa efficienza dell'espressione del transgene.

Mappa di restrizione del plasmide pBR 322:

i numeri indicano la numerazione dei nucleotidi;

trattini sottili - singoli siti riconosciuti dalle restritasi;

spesse frecce grigie sopra - la direzione della trascrizione;

Pbla - Promotore del gene Ampr - resistenza all'ampicillina;

Ptet - Promotore del gene Tetr - resistenza alla tetraciclina;

TT1 - Terminatore della trascrizione Rho-indipendente (posizione 3140-3160); TT2 - posizione 3080-3110; ROP - proteina che promuove la formazione di duplex tra RNA 1 e RNA 2 (regolatore del numero di copie negative); RNA 1 - RNA di controllo (controlla il numero di copie del plasmide); RNA 2 - RNA "primer" (funge da primer per la replicazione); frecce nere spesse: la direzione della trascrizione di RNA 1 e RNA 2

Vettori basati sul fago M13

Esistono tre modi per migliorare l'efficienza del trasferimento del DNA nelle cellule eucariotiche utilizzando policationi sintetici. Innanzitutto, si tratta di un aumento della specificità della trasfezione dovuto ai ligandi legati alla molecola policationica e che forniscono un'interazione selettiva dei complessi con cellule di un determinato fenotipo. In secondo luogo, aumentando l'efficienza della trasformazione grazie alla selezione di geni o oligonucleotidi introdotti nella cellula. In terzo luogo, un aumento della frequenza di trasfezione, che si ottiene attraverso l'uso di ligandi che interagiscono più efficacemente con la membrana cellulare e di sostanze che destabilizzano la membrana. Inoltre è possibile la sintesi di nuovi policationi.

Il Laboratorio di virologia molecolare e ingegneria genetica dell'Istituto di ricerca sull'influenza dell'Accademia russa delle scienze mediche di San Pietroburgo sta studiando i mezzi per fornire DNA e particelle virali nelle cellule. In questo lavoro utilizziamo una serie di supporti polimerici sintetizzati dallo staff dell'Istituto dei composti macromolecolari dell'Accademia russa delle scienze. Come vettori di espressione sono stati utilizzati i seguenti plasmidi: pUC 18, contenente il promotore del citomegalovirus e il gene della b-galattosidasi, e pBR 322, contenente il promotore del citomegalovirus e il gene della proteina fluorescente del verde algale.

Come risultato degli studi, si è scoperto che gli IPEC di poli-(2-(dimetilammino)etil)metacrilato (PDMAEMA) con bassi pesi molecolari hanno la massima attività di trasfezione. Ulteriori ricerche consentiranno di sviluppare nuovi approcci per risolvere problemi urgenti in virologia, biologia molecolare e cellulare, ingegneria genetica e terapia genica.

La trasduzione (dal latino transductio - movimento) è il processo di trasferimento del DNA batterico da una cellula all'altra da parte di un batteriofago. La trasduzione generale viene utilizzata nella genetica batterica per la mappatura del genoma e l'ingegneria dei ceppi. Sia i fagi temperati che quelli virulenti sono capaci di trasduzione; tuttavia, questi ultimi distruggono la popolazione batterica; pertanto, la trasduzione con il loro aiuto è di scarsa importanza sia in natura che nella ricerca.

Trasduzione generale (non specifica).

Viene effettuato dal fago P1, che esiste nella cellula batterica sotto forma di plasmide, e dai fagi P22 e Mu, che si integrano in qualsiasi parte del cromosoma batterico. Dopo l'induzione del profago, con una probabilità di 10?5 per cellula, un frammento di DNA batterico può essere erroneamente impacchettato nel capside del fago; in questo caso, il fago stesso non contiene DNA. La lunghezza di questo frammento è uguale alla lunghezza del normale DNA fagico; la sua origine può essere qualsiasi: una regione casuale del cromosoma, un plasmide, altri fagi temperati.

Una volta in un'altra cellula batterica, un frammento di DNA può essere incorporato nel suo genoma, solitamente mediante ricombinazione omologa. I plasmidi trasferiti dal fago sono in grado di formare un anello e replicarsi in una nuova cellula. In alcuni casi, un frammento di DNA non si integra nel cromosoma del ricevente, non si replica, ma rimane nella cellula e viene trascritto. Questo fenomeno è chiamato trasduzione abortiva.

Trasduzione specifica

La trasduzione specifica è stata studiata meglio sull'esempio del fago L. Questo fago si integra solo in una regione (sito att) del cromosoma di E. coli con una determinata sequenza nucleotidica (omologa alla regione att nel DNA del fago). Durante l'induzione, la sua esclusione può fallire con un errore (probabilità 10?3--10?5 per cellula): viene tagliato un frammento della stessa dimensione del DNA fagico, ma con l'inizio nel posto sbagliato. In questo caso, alcuni geni del fago vengono persi e alcuni geni dell'E. coli vengono catturati dal fago. La probabilità di trasferimento genico in questo caso diminuisce all'aumentare della distanza da esso al sito att.

Ogni fago temperato che si integra specificamente nel cromosoma ha il proprio sito att e, di conseguenza, i geni situati accanto ad esso, che è in grado di trasmettere. Un certo numero di fagi può integrarsi in qualsiasi punto del cromosoma e trasportare qualsiasi gene mediante il meccanismo della trasduzione specifica. Inoltre, il cromosoma solitamente contiene sequenze parzialmente omologhe alla regione att del DNA fagico. Quando un sito att completamente omologo viene danneggiato, è possibile ottenere l'inclusione del fago nel cromosoma secondo queste sequenze e il trasferimento, nel corso di trasduzione specifica, di geni ad essi già adiacenti.

Quando un fago temperato che trasporta geni batterici viene integrato nel cromosoma di un nuovo batterio ospite, contiene già due geni identici: i suoi e portati dall'esterno. Poiché il fago è privato di alcuni dei propri geni, spesso non può essere indotto e riprodursi. Tuttavia, quando la stessa cellula viene infettata da un fago "ausiliario" della stessa specie, diventa possibile l'induzione di un fago difettoso. Sia il DNA del fago "ausiliario" normale che il DNA del fago difettoso, insieme ai geni batterici che trasportano, escono dal cromosoma e si replicano. Pertanto, circa il 50% delle particelle fagiche risultanti trasportano DNA batterico. Questo fenomeno è chiamato trasduzione ad alta frequenza (HFT).

Coniugazione (dal latino conjugatio - connessione), processo parasessuale - trasferimento unidirezionale di parte del materiale genetico (plasmidi, cromosoma batterico) con contatto diretto di due cellule batteriche. Inaugurato nel 1946 da J. Lederberg e E. Taitem. Ha una grande importanza in natura, perché favorisce lo scambio di tratti utili in assenza di un vero processo sessuale. Di tutti i processi di trasferimento genico orizzontale, la coniugazione consente il trasferimento della maggior quantità di informazioni genetiche.

Meccanismo

Per stabilire con successo il contatto tra due cellule, nella cellula donatrice deve essere presente un plasmide coniugativo (sessuale, trasmissibile). Il primo di questi era il plasmide F: un episoma (capace di integrarsi nel cromosoma batterico), lungo circa 100mila paia di basi. Il plasmide trasporta geni che codificano una serie di funzioni. Uno di questi è la formazione dei pili sessuali responsabili dell'adesione alla cellula ricevente.

I plasmidi coniugativi codificano anche proteine ​​che impediscono l'attaccamento dei pili di altri batteri alla parete cellulare di questo. Pertanto, le cellule che già contengono plasmidi trasmissibili hanno diversi ordini di grandezza meno probabilità di fungere da riceventi durante la coniugazione.

Il plasmide codifica per un'endonucleasi che taglia uno dei filamenti di DNA in un punto specifico (oriT). Quindi la catena tagliata viene sciolta e l'estremità da 5 "viene trasferita alla cellula ricevente. È stato suggerito che il DNA venga trasferito attraverso i canali nei peli sessuali, ma finora è stato dimostrato che il trasferimento avviene attraverso i pori nella parete cellulare Nel primo segmento del filamento che entra nella cellula ricevente, il DNA contiene geni antirestrizione. Questi geni devono essere trascritti nel ricevente immediatamente dopo il loro arrivo per garantire l'accumulo di proteine ​​che bloccano il processo di distruzione del DNA da parte degli enzimi di restrizione. Infine, la catena trasferita si chiude in un anello e, su di essa, viene ripristinata la struttura a doppio filamento del DNA plasmidico. L'intero processo dura diversi minuti.

Il plasmide coniugativo può essere integrato nel cromosoma mediante ricombinazione omologa che coinvolge elementi IS. La coniugazione in questo caso avviene secondo lo stesso meccanismo, tuttavia non solo il plasmide viene trasferito al ricevente, ma anche il materiale cromosomico del donatore. In questo caso, il processo viene ritardato per ore, spesso si verifica una rottura nel filamento di DNA trasmesso. Arrestando artificialmente il trasferimento del DNA in tempi diversi e osservando quali geni venivano trasferiti, è stata ottenuta una mappa del cromosoma di E. coli e ne è stata mostrata la struttura ad anello.

Quando viene tagliato da un cromosoma, un plasmide può catturarne il frammento e trasferirlo con esso in un'altra cellula (un'analogia con la trasduzione). Questo processo è chiamato sessuduzione.

Alcuni piccoli plasmidi, detti mobilizzabili, possono essere trasferiti mediante coniugazione utilizzando un apparato di trasferimento plasmidico di trasferimento "helper". Per fare ciò, devono contenere sequenze simili all'oriT del plasmide coniugativo e riconosciute dalle sue endonucleasi.