Caratteristiche di ricombinazione, trasformazione, trasduzione e coniugazione batterica. Ricombinazioni genetiche

La ricombinazione genetica negli eucarioti è la formazione di individui con una nuova combinazione di tratti come risultato del processo sessuale. Un nuovo individuo riceve diversi geni da un genitore e diversi da un altro genitore geneticamente diverso. Attraverso il processo di ricombinazione, aumenta il numero di cambiamenti ereditari che possono essere influenzati dalla selezione.

Nei procarioti, la ricombinazione genetica si riferisce ai cosiddetti processi parasessuali. In questi organismi sono noti tre processi attraverso i quali il materiale genetico di due genitori diversi può ricombinarsi. Queste sono trasformazione, coniugazione e trasduzione. Tuttavia, nessuno di questi processi comporta una vera fusione cellulare o una fusione completa dei nucleoidi. Solo una parte del materiale genetico della cellula donatrice viene trasferita alla cellula ricevente. Il ricevente diventa quindi diploide perché parte del suo materiale genetico è integrato dal materiale genetico del donatore.

In uno zigote così incompleto, chiamato merozigote, formato a seguito del trasferimento genico, il materiale genetico della cellula ricevente è chiamato endogeno e il frammento genetico trasferito dal donatore è chiamato esogeno. Tipicamente, le parti esogene ed endogene si uniscono e si scambiano i segmenti immediatamente dopo il trasferimento.

Trasformazioneè un processo di trasferimento genico in cui una porzione del DNA di una cellula donatrice, ottenuta mediante estrazione o mediante lisi cellulare naturale, può entrare in una cellula ricevente batterica correlata (della stessa specie o di specie strettamente correlate). Di conseguenza, frammenti del cromosoma del DNA del donatore vengono inclusi nel DNA del ricevente, provocando un cambiamento nelle caratteristiche del batterio ricevente.

Il processo di trasformazione può essere suddiviso in più fasi: 1 - Contatto del DNA con la superficie cellulare; 2 - penetrazione del DNA nella cellula; 3 - connessione del DNA trasformante con il frammento corrispondente del cromosoma del ricevente. L'ulteriore processo è associato alla ricombinazione di una parte della molecola di DNA trasformante esogeno con il DNA cromosomico endogeno ricevente. L'ultima fase è la replicazione di nuove informazioni incluse nel cromosoma.

In condizioni di laboratorio, la trasformazione viene eseguita come segue. Il DNA di un particolare ceppo batterico viene estratto, purificato e mescolato con cellule batteriche di un altro ceppo che differisce dal primo per una o più proprietà ereditarie. La coltura del microrganismo in esame viene lasciata crescere. Nella progenie si può trovare un piccolo numero di cellule con alcune proprietà del ceppo da cui è stato estratto il DNA.

Accade raramente che una singola cellula batterica acquisisca più di una nuova proprietà a seguito della trasformazione. La trasmissione attraverso il DNA di un numero maggiore di tratti si osserva solo se la coltura del microbo donatore è geneticamente vicina alle cellule del microbo ricevente.

Con l'aiuto della trasformazione del DNA è possibile trasmettere caratteristiche come la formazione di capsule, la sintesi delle sostanze necessarie per la cellula, l'attività enzimatica, la resistenza ai veleni, agli antibiotici e ad altre sostanze medicinali.

La trasformazione è stata osservata in molti batteri, in particolare nei rappresentanti dei generi Bacillus, Rhizobium, Streptococcus, ecc.

Coniugazione- un processo in cui le cellule madri avvicinate vengono solitamente collegate con l'aiuto di ponti di coniugazione, attraverso questi ultimi avviene uno scambio di materiale genetico. La coniugazione è stata studiata in vari batteri (Escherichia, Shigella, Salmonella, Pseudomonas), in particolare è stata ben studiata in Escherichia coli.

La capacità di una cellula di diventare donatrice è determinata dal fattore sessuale specifico F (dall'inglesefertilità - fertilità), che, durante la coniugazione, viene trasferito da una cellula batterica all'altra. Queste cellule erano chiamate cellule F+. Le cellule batteriche che non hanno un fattore F sono destinatari di materiale genetico e sono designate F - Il fattore sessuale F è uno dei plasmidi coniugativi ed è una molecola di DNA circolarmente chiusa con un peso molecolare di 64x106 a. mangiare. Il plasmide F provoca la formazione di uno o due cosiddetti pili sessuali, o pili F, sulla superficie cellulare, che facilitano la connessione delle cellule donatrici con le cellule riceventi, nonché la replicazione cromosomica indipendente del proprio DNA e la formazione di prodotti che garantiscono il trasferimento di materiale genetico come la maggior parte dei plasmidi F e dei cromosomi cellulari. Il plasmide F si trova autonomamente nel citoplasma, all'esterno del cromosoma batterico. Tuttavia, ha la capacità di essere incluso (e integrato) in determinati punti del cromosoma batterico e di diventarne parte.

Come risultato dell'integrazione del plasmide F nella composizione del cromosoma batterico, si forma il cosiddetto ceppo Hfr (alta frequenza di ricombinazione - alta frequenza di ricombinazione). Quando un ceppo Hfr viene incrociato con batteri F -, di norma il fattore F non lo è

Viene trasmesso e i geni del cromosoma batterico vengono trasmessi con una frequenza abbastanza alta. All'inizio del processo di coniugazione, le cellule donatrici F+ o Hfr sono collegate alle cellule riceventi (a causa della presenza di F-pili nei donatori). Successivamente, tra le cellule si forma un ponte di coniugazione e attraverso di esso, dalla cellula donatrice alla cellula ricevente, viene trasferito il materiale genetico o plasmidi F o cromosomi. Di solito, durante la coniugazione, viene trasferito solo un filamento di DNA del donatore e il secondo filamento (complementare) viene completato nella cellula ricevente. Il trasferimento, di regola, inizia da un'estremità del cromosoma e continua con il successivo trasferimento di altre parti di esso (Fig. 21).

Il trasferimento del materiale genetico può essere impedito in qualsiasi momento separando le coppie coniugate agitando vigorosamente la sospensione di microrganismi nel mezzo liquido. In questo caso, solo alcune delle proprietà delle cellule maschili vengono trasferite alla cellula femminile e possono manifestarsi nella prole. Prima o poi, nella maggior parte delle coppie coniugate, il trasferimento si interrompe anche quando non sono separate artificialmente. Questo perché il ponte di coniugazione è fragile e facilmente distrutto senza compromettere la vitalità cellulare.

Pertanto, a seguito della coniugazione, la cellula ricevente F - si trasforma in un merozigote contenente, a causa dell'interruzione spontanea del trasferimento di materiale genetico, solo una parte del cromosoma donatore F + oltre al proprio cromosoma. Come risultato del processo di crossover (incrocio di cromosomi, in cui i geni cambiano di posto), che si osserva anche in altri organismi, si forma una nuova combinazione di materiale genetico. A seconda della posizione del materiale genetico scambiato, nella prole possono verificarsi diversi tipi di ricombinanti.

trasduzione- il processo di trasferimento del materiale genetico da una cellula batterica all'altra mediante un batteriofago. In altre parole, il fago svolge allo stesso tempo il ruolo di gamete, trasferendo un frammento di DNA della cellula donatrice nella cellula ricevente. La trasduzione avviene con la partecipazione dei fagi temperati.

Sono noti tre tipi principali di trasduzione: generale (non specifica), localizzata (specifica) e abortiva. Nella trasduzione non specifica, vari frammenti di DNA vengono trasferiti dai batteri donatori ai batteri riceventi con l'aiuto di fagi trasduttori moderati. In questo caso, il frammento di DNA donatore portato dal fago può essere incluso nella regione di DNA omologa della cellula ricevente mediante ricombinazione.

La trasduzione specifica è caratterizzata dalla capacità di un fago di trasferire solo determinati geni dai batteri donatori ai batteri riceventi. Ciò è dovuto al fatto che la formazione del fago trasduttore avviene a seguito della combinazione del suo DNA con geni batterici rigorosamente definiti situati sul cromosoma della cellula donatrice. Si ritiene che ciascuna particella fagica porti con sé un solo gene batterico o diversi geni vicini.

A Trasduzione abortiva Il frammento cromosomico della cellula donatrice portato dal fago non è incluso nel cromosoma della cellula ricevente, ma si trova autonomamente nel suo citoplasma e può funzionare in questa forma. Nel processo di divisione cellulare - il ricevente, il frammento di DNA trasdotto - il donatore può essere trasferito solo su una delle due cellule figlie, cioè viene ereditato in modo unilineare e quindi si perde nella prole.

Durante la trasduzione è possibile trasferire geni che controllano le caratteristiche nutrizionali dei batteri, la loro resistenza ai farmaci, l'attività enzimatica, l'apparato locomotore (flagelli) e altre proprietà.

Il trasferimento di tratti mediante il processo di trasduzione è stato riscontrato in rappresentanti dei generi Bacillus, Pseudomonas, Salmonella, Escherichia, ecc.

I procarioti non sono capaci di riproduzione sessuale. . La loro ricombinazione avviene a seguito di riarrangiamenti intragenomici, che consistono in un cambiamento nella localizzazione dei geni all'interno del cromosoma, o quando una parte del DNA del donatore entra nella cellula ricevente.

Come risultato delle ricombinazioni, si forma un solo ricombinante, il cui genotipo è rappresentato principalmente dal genotipo del ricevente con incluso il frammento di DNA del donatore.

Le ricombinazioni genetiche si verificano con la partecipazione di un numero di enzimi all'interno di singoli geni o gruppi di geni collegati. Esistono geni hes speciali che determinano la capacità di ricombinazione dei batteri. Il trasferimento del materiale genetico (geni cromosomici) da un batterio all'altro avviene attraverso trasformazione, trasduzione e coniugazione. Trasferimento di geni plasmidici - mediante trasduzione e coniugazione.

Trasformazione - un cambiamento in un tipo di cellule sotto l'azione di un principio attivo proveniente da un altro tipo di cellule. Il fenomeno fu scoperto da Griffith in Streptococcus pneumoniae (1928); successivamente Avery, McLeod e McCarthy (1944) isolarono il principio trasformante dei pneumococchi sotto forma di una molecola di DNA. Questa è stata la prima prova diretta che il DNA è il portatore di informazioni genetiche.

I batteri morti rilasciano costantemente DNA che può essere assorbito da altri batteri. Tradizionalmente, qualsiasi DNA estraneo che entra in una cellula batterica viene tagliato dalle endonucleasi. In determinate condizioni, tale DNA si integra nel genoma batterico e lo modifica. L'inserimento del DNA plasmidico può modificare la virulenza dei batteri. La trasformazione gioca un ruolo minore nello scambio di informazioni genetiche.

trasduzione - trasferimento di un frammento di DNA da una cellula (donatore) a un'altra (ricevente) utilizzando un batteriofago. Il fenomeno fu scoperto da Lederberg e Zinder (1952). Esistono 3 tipi di trasduzione:

non specifico (generale) - in una cellula infettata da un batteriofago, durante l'assemblaggio della popolazione figlia, qualsiasi frammento di DNA batterico o plasmide può penetrare nelle teste di alcuni fagi insieme al DNA virale. In questo caso il fago perde parte del suo genoma, diventa difettoso ed è in grado di provocare la trasduzione. Con questa forma di trasduzione, praticamente qualsiasi gene può essere introdotto nelle cellule riceventi.

specifica è caratterizzato dalla capacità di un fago di trasferire determinati geni da un batterio donatore a un batterio ricevente. Ciò è dovuto al fatto che la formazione di un batteriofago trasduttore avviene separando il profago dal cromosoma batterico insieme ai geni situati sul cromosoma nella cellula donatrice accanto al profago. Quando i fagi trasduttori interagiscono con le cellule del ceppo ricevente, il gene del batterio donatore, insieme al DNA del fago difettoso, viene incorporato nel cromosoma del batterio ricevente. I batteri lisogenati con un fago difettoso sono immuni, come tutte le cellule lisogeniche, alla successiva infezione con un fago virulento omologo.

abortivo. Il frammento di DNA del batterio donatore portato dal fago non è incluso nel cromosoma del batterio ricevente, ma si trova nel suo citoplasma e può funzionare in questa forma. Durante la divisione cellulare batterica, il frammento di DNA del donatore trasdotto può essere trasferito solo a una delle due cellule figlie, cioè può essere ereditato in modo unilineare e perso gradualmente.

Coniugazione - trasferimento del materiale genetico della cellula donatrice alla cellula ricevente quando vengono incrociate. Il processo di coniugazione nei batteri fu scoperto per la prima volta da D. Lederberg ed E. Tatum nel 1946. Successivamente divenne chiaro che i donatori di materiale genetico sono cellule che trasportano il plasmide F (fattore sessuale). Quando si incrocia una cellula F + con una cellula F ", il fattore sessuale viene trasferito indipendentemente dal cromosoma del donatore se il plasmide si trova in uno stato autonomo. In questo caso, quasi tutte le cellule riceventi ricevono il plasmide F e diventano cellule F +.

Passaggi di coniugazione:

attacco di una cellula donatrice a una cellula ricevente con l'aiuto di villi sessuali (pili sessuali).

si forma un ponte di coniugazione attraverso il quale il fattore F e altri plasmidi situati nel citoplasma del batterio donatore in uno stato autonomo possono essere trasferiti dalla cellula donatrice alla cellula ricevente.

L'integrazione del plasmide F nel cromosoma batterico porta alla rottura di uno dei filamenti di DNA, che rende possibile il suo trasferimento alla cellula ricevente.

Impostazione dell'esperienza di trasduzione

Il fago temperato ottenuto mediante filtrazione dalla coltura di E. coli in un volume di 1 ml viene introdotto in una provetta sterile, quindi a questa provetta viene aggiunto 1 ml di brodo di coltura di E. coli, che non è in grado di scomporre il lattosio. La provetta viene tenuta in un termostato per 40 minuti. Successivamente effettuare la semina nel settore della coppa con il terreno di Endo: fago moderato; E. coli lac-; dalla provetta.

Impostazione dell'esperimento di coniugazione

La brodocoltura del donatore e la brodocoltura del ricevente vengono introdotte in una provetta sterile separata in un volume di 1 ml. La provetta viene tenuta in un termostato per 40 minuti. Quindi, la semina della coltura del donatore, del ricevente e della miscela del donatore con il ricevente viene effettuata su settori separati del mezzo nutritivo minimo. Incubato 24 ore a 37°C.

ricombinazione nei procarioti. Trasformazione. Coniugazione. Trasduzione. Caratteristiche della costruzione di mappe genetiche nei procarioti.

ricombinazione genetica

Di conseguenza si osserva la variabilità genotipica dei procarioti ri combinazione materiale genet dovuto alla combinazione parziale dei genomi di due cellule e si manifesta nel fenotipo batterico. Trasformazione, trasduzione e coniugazione portano alla variabilità ricombinativa nel materiale genetico dei procarioti.

A differenza degli eucarioti, nei quali durante il processo sessuale si forma un vero e proprio zigote che unisce il materiale genetico di entrambi i genitori, nei procarioti, in tutti e tre i processi sopra menzionati, si verifica solo un trasferimento parziale del materiale genetico dalla cellula donatrice alla cellula donatrice. si osserva la cellula ricevente, che porta ad uno zigote -I difettoso - merozigoti. Pertanto, la cellula ricevente procariotica diventa parzialmente diploide, conservando principalmente il genotipo della cellula ricevente e acquisendo solo alcune proprietà della cellula donatrice.

La responsabilità della ricombinazione è portata da geni speciali della cellula ricevente, chiamati geni rec. Il meccanismo di ricombinazione include una serie di fasi successive:
1) rottura dei filamenti di DNA della cellula ricevente;
2) inserimento di frammenti di DNA introdotti dalla cellula donatrice nel genoma della cellula ricevente;
3) replicazione del DNA ricombinante, dando origine alla progenie di cellule con un genoma modificato.

La prova del suddetto meccanismo di ricombinazione è stata ottenuta sperimentalmente studiando il processo di coniugazione di Escherichia coli (E. coli) utilizzando cellule donatrici marcate con fosforo (P 32).

Trasformazione(dal latino - trasformazione) - un cambiamento nel genoma e nelle proprietà dei batteri come risultato del trasferimento di informazioni quando un frammento di DNA libero penetra dall'ambiente nella cellula. La trasformazione non richiede il contatto diretto tra la cellula donatrice e la cellula ricevente. La fonte della trasformazione del DNA può essere una coltura batterica appena uccisa o preparati puri di DNA da essa estratti.

Il fenomeno della trasformazione dei batteri fu osservato per la prima volta da F. Griffiths nel 1928. Scoprì che quando un pneumococco capsulare virulento di tipo S ucciso con pneumococco di tipo R non capsulare virulento vivo viene iniettato nel corpo dei topi, tutti gli animali muoiono. Allo stesso tempo, i pneumococchi capsulari virulenti di tipo S vengono isolati dal sangue di topi morti insieme ai pneumococchi di tipo R non capsulari. Griffiths non riuscì a spiegare il fenomeno della trasformazione. Solo nel 1944, O. Avery, K. McLeod e M. McCarthy isolarono la sostanza trasformante dalle cellule morte dei pneumococchi capsulari e dimostrarono che è il DNA sensibile alla DNA polimerasi.

Il processo di trasformazione avviene in diverse fasi:
1) adsorbimento del DNA in trasformazione sulla superficie di una cellula ricevente competente;
2) scissione enzimatica del DNA trasformante con formazione di frammenti di peso molecolare medio (4-5)·10 6 ;
3) penetrazione di frammenti di DNA nella cellula ricevente, accompagnata dalla degradazione di una delle catene di DNA e dalla formazione di frammenti a filamento singolo;
4) integrazione: inclusione di frammenti di DNA trasformante nel DNA della cellula ricevente mediante scambio genetico;
5) espressione - riproduzione intensiva di cellule trasformate, la cui progenie avrà un gene alterato nella molecola del DNA.

Il frammento di DNA in trasformazione corrisponde solitamente allo 0,3% del cromosoma batterico, ovvero a circa 15 geni. Un frammento di DNA molto piccolo penetra nella cellula ricevente, provocando la trasformazione di un solo carattere e raramente di due. Trasformandosi da una cellula all'altra si possono trasferire caratteristiche batteriche come la resistenza ai farmaci, la capacità di sintetizzare polisaccaridi capsulari, enzimi, alcuni metaboliti, ecc. Durante la trasformazione non viene aggiunto un tratto ereditario qualitativamente nuovo, si osserva solo la sostituzione di un tratto con un altro.

trasduzione consiste nel trasferimento del materiale genetico dalla cellula donatrice alla cellula ricevente da parte di un batteriofago moderato. Il fenomeno della trasduzione fu scoperto nel 1952 da N. Zinder e J. Lederberg usando come esempio due ceppi di Salmonella.

Secondo il meccanismo di interazione con una cellula batterica, i fagi sono divisi in virulenti e temperati. I fagi virulenti, penetrando nella cellula, provocano la formazione di nuovi fagi e la lisi dei batteri. L'infezione delle cellule da parte dei fagi temperati non è sempre accompagnata da lisi batterica; alcuni di essi sopravvivono e diventano lisogenici. Nei batteri lisogeni, il DNA fagico viene incorporato nelle cellule del DNA e il fago temperato si trasforma in un profago, perdendo la capacità di lisare la cellula batterica. Il profago si comporta come una parte del cromosoma batterico e si riproduce al suo interno per numerose generazioni. Il rilascio di fagi temperati dalle cellule dei batteri lisogeni avviene spontaneamente o sotto l'azione di batteri lisogeni avviene spontaneamente o sotto l'azione di agenti indotti: raggi ultravioletti, radiazioni ionizzanti e mutageni chimici.

Durante la riproduzione di alcuni fagi temperati, un piccolo frammento del cromosoma batterico viene incorporato nel genoma fagico. Il fago trasduttore trasferisce il frammento di DNA dell'ospite precedente in una nuova cellula batterica ad esso sensibile. Pertanto, la cellula batterica ricevente diventa uno zigote parziale.

Si distinguono i batteri 3 tipi di trasduzione: specializzato, generale e abortivo.

Specializzato- il genoma del fago comprende geni del DNA rigorosamente definiti del batterio donatore situati sul cromosoma batterico direttamente accanto al profago. I geni adiacenti al profago vengono scissi dal cromosoma del batterio e alcuni geni del profago rimangono nella sua composizione. I fagi trasduttori difettosi rilasciati dalla cellula donatrice causano la lisogenesi della cellula ricevente. Il DNA del fago difettoso viene incorporato nel cromosoma della cellula ricevente, portandovi i geni del batterio donatore.

Generale- differisce da quello speciale in quanto qualsiasi frammento di DNA del batterio donatore è incluso nel DNA dei fagi. Pertanto, nella trasduzione generale, i fagi trasduttori trasferiscono qualsiasi gene che controlla vari tratti dal cromosoma del batterio donatore alla cellula del batterio ricevente.

Abortivo - il frammento cromosomico della cellula donatrice, introdotto dal fago trasduttore nella cellula ricevente, non è incluso nel suo cromosoma, ma è localizzato nel citoplasma e, durante la divisione della cellula ricevente, viene trasferito ad una sola delle cellule risultanti .

La trasduzione nell'esperimento viene mostrata su batteri intestinali, Pseudomonas, stafilococchi, bacilli e attinomiceti. La trasduzione determina la comparsa di varietà batteriche con nuove proprietà, resistenza ai farmaci, sintesi di enzimi, amminoacidi, ecc.

Negli esperimenti di ingegneria genetica, la trasduzione apre non solo ampie opportunità per l'ibridazione interspecifica dei batteri, ma anche la possibilità di ottenere ibridi tra diversi gruppi di procarioti.

Coniugazione avviene con il contatto diretto delle cellule del batterio e prevede il trasferimento diretto del materiale genetico dalla cellula donatrice alla cellula ricevente. Il fenomeno della coniugazione fu descritto nel 1946 da J. Lederberg ed E. Tatum usando l'esempio del ceppo K 12 di E. coli.

La capacità dei batteri di coniugarsi è associata alla presenza del fattore F sessuale, che è uno dei plasmidi coniugativi. Le celle che portano il fattore F sono designate F + ; cellule prive del fattore F - F ¯ . Il fattore F (plasmide F) nelle cellule F + è solitamente in uno stato isolato dalla coltura batterica ed è una struttura citoplasmatica. Le cellule batteriche contenenti il ​​fattore F differiscono dalle altre cellule per una serie di proprietà: una carica superficiale alterata e la capacità di sintetizzare strutture superficiali aggiuntive dei pili F.

Il processo di coniugazione inizia con l'attacco dell'estremità F-pili della cellula donatrice alla cellula ricevente. Nel giro di pochi minuti, la cellula donatrice e la cellula ricevente si avvicinano, forse a causa della riduzione dei pili F, ed entrano in contatto diretto. Attraverso il ponte citoplasmatico attraverso il canale F-pili, in meno di 5 minuti, il fattore F sessuale viene trasferito, indipendentemente dal cromosoma batterico, dal citoplasma della cellula donatrice F + al citoplasma della cellula ricevente F ¯. Allo stesso tempo, la cellula donatrice non perde la sua capacità di donatore, poiché in essa rimangono copie del fattore F.

Nella popolazione delle cellule F+ esistono batteri capaci di coniugare non il fattore F, ma un frammento del cromosoma batterico. Queste cellule batteriche e i ceppi da esse formati vengono denominati Hfr (alta frequenza di ricombinazione), che significa batteri con un'alta frequenza di ricombinazione. Le ricombinazioni tra cellule Hfr e cellule F ¯ avvengono mille volte più spesso che tra cellule F + e F ¯. La differenza tra le cellule Hfr e le cellule F+ è che il fattore F sessuale è incluso nel cromosoma batterico. Durante la coniugazione, la replicazione del DNA avviene nella cellula donatrice di Hfr. In questo caso, una delle catene di DNA replicanti attraverso il ponte di coniugazione penetra nella cellula ricevente F ¯ , la seconda rimane nella cellula donatrice di Hfr, quindi ciascuna di queste catene si completa con un filamento complementare. Il ponte di coniugazione è fragile, si rompe facilmente, quindi non l'intero cromosoma, ma solo un frammento di esso, viene trasferito dalla cellula donatrice Hfr alla cellula ricevente F¯.

M/y del frammento cromosomico trasferito dalla cellula Hfr e dalla regione omologa del cromosoma della cellula F ¯ avviene uno scambio genetico. Di conseguenza, una parte del DNA del donatore viene inserita nel DNA del ricevente e la parte corrispondente del DNA del ricevente ne viene esclusa. L'efficienza di incorporazione del DNA del donatore nel cromosoma del ricevente è elevata ed è pari a circa 0,5.

La coniugazione dei procarioti non dovrebbe essere identificata con il processo sessuale degli eucarioti, poiché durante la coniugazione solo una parte del materiale genetico della cellula F + viene trasferita alla cellula F ¯, dando luogo alla formazione di un merozigote inferiore. La base di quest'ultimo è il genoma della cellula ricevente con la parte introdotta del genoma della cellula donatrice.

Insieme alla stabilità e all'accuratezza delle proprietà ereditarie, l'apparato genetico dei procarioti è caratterizzato dalla variabilità, che si manifesta sotto forma di mutazioni e ricombinazioni.

Le mutazioni spontanee dei procarioti dovrebbero essere considerate il tipo iniziale di variabilità emersa parallelamente all'inizio del funzionamento del loro DNA come struttura genetica. È possibile che per milioni di anni le mutazioni siano state l'unico meccanismo per la variabilità dei procarioti.

Un salto nell'evoluzione dei procarioti è stato l'emergere della variabilità ricombinativa, che consiste nell'unificazione parziale dell'informazione genetica di due cellule procariotiche del donatore e del ricevente. Quello. c'era un nuovo materiale aggiuntivo per la selezione naturale, accelerando il processo di evoluzione. Dei tre processi ricombinativi discussi sopra, la coniugazione è il più perfetto, poiché fornisce uno scambio più completo di informazioni genetiche tra due cellule. Sono noti casi in cui la coniugazione a lungo termine (90 minuti) di due cellule di E. coli porta all'ingresso dell'intero cromosoma della cellula donatrice nella cellula ricevente.

L'efficienza delle loro ricombinazioni genetiche è elevata solo per i batteri strettamente correlati che sono imparentati all'interno della specie.

Caratteristiche della costruzione di mappe genetiche nei procarioti

Per costruire mappe genetiche nei procarioti, viene utilizzato il fenomeno coniugazioni– trasferimento di materiale genetico da una cellula all’altra con l’aiuto di speciali molecole circolari di DNA (plasmidi, in particolare, con l’aiuto di plasmidi F).

La probabilità di trasferire un determinato gene nella cellula ricevente dipende dalla sua rimozione dal DNA del plasmide F, o meglio, dal punto O, in cui inizia la replicazione del DNA del plasmide F. Più lungo è il tempo di coniugazione, maggiore è la probabilità di trasferire un dato gene. Ciò rende possibile creare una mappa genetica dei batteri in pochi minuti di coniugazione. Ad esempio, nell'Escherichia coli, il gene thr (un operone di tre geni che controllano la biosintesi della treonina) si trova nel punto zero (cioè direttamente accanto al DNA plasmidico F), il gene lac viene trasferito dopo 8 minuti, il gene recE dopo 30 minuti, il gene argR - dopo 70 minuti, ecc.

La ricombinazione è un insieme di processi associati alla sostituzione di un sito dell'acido nucleico originale con un sito omologo (simile).

In questo caso, il grado di omologia può essere diverso: dalla completa identità delle sequenze nucleotidiche originali e nuove a discrepanze evidenti che portano a un cambiamento nel fenotipo. Come risultato della ricombinazione, si formano nuove combinazioni di alleli, ad esempio: AB + ab → Ab + aB.

Nei procarioti esistono tre modi per incorporare il DNA estraneo nel genoma: trasformazione, coniugazione e trasduzione.

Trasformazione

La trasformazione è il trasferimento di DNA puro da una cellula all'altra. La trasformazione fu scoperta dal batteriologo F. Griffiths nel 1928 in esperimenti con pneumococchi. Nei pneumococchi si conoscono due tipi di ceppi: le forme S e R.

La forma S è caratterizzata dalla presenza di una capsula polisaccaridica, per cui, durante la coltivazione artificiale, forma colonie lisce e lucenti; questa forma è patogena per i topi. La forma R è priva di capsula, durante la coltivazione artificiale forma colonie grossolane; questa forma non è patogena per i topi. Ma se ai topi vengono iniettate contemporaneamente cellule S uccise e cellule R vive, i topi muoiono. Pertanto, le proprietà genetiche di un ceppo influenzano le proprietà genetiche di un altro ceppo.

Nel 1944, O. Avery, K. McLeod e M. McCarthy dimostrarono che i cambiamenti nelle proprietà ereditarie delle cellule sono associati al trasferimento del DNA.

La capacità di trasformazione di una cellula è possibile nel suo stato speciale, che si chiama competenza. Nelle cellule competenti, la composizione della parete cellulare e del plasmalemma cambia: la parete diventa porosa, il plasmalemma forma numerose invaginazioni e sulla superficie esterna compaiono antigeni speciali - fattori di competenza (in particolare proteine ​​​​specifiche a basso peso molecolare).

In condizioni naturali, il DNA puro extracellulare si forma durante la morte (lisi) dei procarioti.

Di norma, la trasformazione avviene all'interno di una specie di procarioti, ma in presenza di geni omologhi si osserva anche una trasformazione interspecifica.

Il processo di trasformazione prevede le seguenti fasi:

1. Attacco del DNA trasformante a doppio filamento ai recettori sulla superficie della cellula ricevente.

2. Trasformazione del DNA a doppio filamento in DNA a filamento singolo.

3. Penetrazione del DNA a filamento singolo nella cellula.

4. Integrazione del DNA trasformante nel cromosoma del ricevente e ricombinazione del materiale genetico.

La lunghezza del DNA in trasformazione dovrebbe essere compresa tra 500 e 200 mila bp. L'energia rilasciata durante la degradazione di uno dei filamenti di DNA viene utilizzata per trasportare attivamente il filamento rimanente nella cellula.

I primi tre stadi della trasformazione non dipendono dalla composizione nucleotidica del DNA. Tuttavia, il processo di integrazione del DNA in trasformazione nel cromosoma del ricevente è più probabile se questo DNA è altamente omologo al DNA del ricevente.

Il processo di trasformazione è mostrato nel diagramma. Ogni segmento di linea corrisponde a un filamento di DNA. Il DNA in trasformazione è mostrato in nero e il DNA della cellula ricevente in grigio.

Nella prima fase, il DNA trasformante si attacca ai siti recettoriali sulla superficie della cellula ricevente.

Nella seconda fase, il DNA a doppio filamento sulla superficie cellulare viene trasformato in DNA a filamento singolo a causa della scissione di uno dei filamenti da parte delle nucleasi batteriche.

Nella terza fase, il filamento di DNA rimanente viene trasportato attraverso la membrana nel citoplasma. In questo caso viene utilizzata l'energia rilasciata durante la degradazione della catena complementare.

Durante la replicazione di un cromosoma batterico, il filamento di DNA trasformante è attaccato a una regione di DNA omologa (parzialmente complementare) della cellula ricevente. In questo caso, a causa della mancanza di completa complementarità, si forma un eteroduplex ("eterozigote molecolare") - una sezione di DNA a doppio filamento su cui le basi azotate non sono collegate da legami idrogeno in tutte le coppie nucleotidiche. Il resto del DNA si replica normalmente.

Al termine della replicazione del DNA, la cellula ricevente si divide per formare due cellule: una cellula parzialmente trasformata con un cromosoma comprendente una regione di DNA eteroduplex e una cellula non trasformata. Durante la replicazione del DNA in una cellula parzialmente trasformata, le catene complementari vengono completate su entrambi i filamenti del DNA. Una catena conserva le sequenze nucleotidiche originali, mentre l'altra viene completamente trasformata. Dopo la divisione di una cellula parzialmente trasformata, si formano una cellula non trasformata e una cellula completamente trasformata, in cui la sequenza nucleotidica originale viene sostituita dalla sequenza nucleotidica del DNA trasformante.

Pertanto, durante la trasformazione, i geni riceventi vengono sostituiti da sequenze nucleotidiche omologhe. Maggiore è il grado di omologia, maggiore sarà il successo della trasformazione.

La frequenza di trasformazione nei procarioti dipende dalle proprietà del DNA trasformante, dalla sua concentrazione, dallo stato della cellula ricevente e dal tipo di batteri. La frequenza massima delle cellule trasformate non supera 1 su 100 cellule.

La trasformazione è nota anche per gli eucarioti. Tuttavia, sulla superficie delle cellule eucariotiche non sono presenti siti recettoriali e il DNA trasformante viene introdotto artificialmente nelle cellule. Ad esempio, il DNA viene iniettato nelle uova degli animali mediante microiniezione diretta e nelle uova delle piante mediante microiniezione nel tubo pollinico. I metodi di biobalistica (biolistica) sono ampiamente utilizzati, che consentono di introdurre qualsiasi frammento di DNA nelle colture di tessuti vegetali.

Coniugazione

La coniugazione nei procarioti è il contatto diretto di due cellule di diversa qualità, accompagnato dal trasferimento almeno parziale del materiale genetico dalla cellula donatrice alla cellula ricevente. (Il processo di coniugazione fu scoperto nel 1946 da J. Lederberg e E. Tatum).

In E. coli, la cellula donatrice ("maschio") ha una forma oblunga, la cellula ricevente ("femmina") è isodiametrica. La cellula donatrice forma i villi genitali (pili), che la attraggono verso la cellula ricevente e formano canali citoplasmatici. Questi canali trasportano il DNA dalla cellula donatrice alla cellula ricevente. Esistono tre tipi di cellule donatrici: F+ (ef-plus), Hfr (h-ef-a) e F′ (ef-prim).

I donatori F + contengono nel citoplasma il fattore sessuale - uno specifico plasmide F.

Il plasmide F è un replicone autonomo lungo circa 100 kb. Più di 20 geni sono stati studiati nel plasmide F. Circa la metà di essi formano l'operone gigante tra (lungo circa 30 kb); i prodotti di questo operone controllano la formazione di un contatto tra il donatore e il ricevente e l'effettivo trasferimento del DNA. Altri geni regolano il lavoro del tra-operone.

La cellula ricevente non contiene un plasmide F ed è designata come cellula F.

Quando si forma un ponte citoplasmatico, una delle catene del plasmide F viene tagliata in un certo punto (punto O) e la replicazione del DNA inizia sulla catena complementare secondo il principio dell'anello rotante. Una copia della catena complementare passa attraverso il ponte citoplasmatico nel citoplasma della cellula ricevente e su di essa viene completata la catena mancante. Dopo la fine della replicazione, il DNA plasmidico a doppio filamento si chiude in un anello e la cellula F si trasforma in una cellula F +. Il tempo totale di trasferimento della copia del plasmide F nella cellula ricevente è di circa 5 minuti.

Tuttavia, quando F + × F – viene incrociato, solo i geni contenuti in F– plasmide; i geni housekeeping situati sul cromosoma batterico non vengono trasferiti alla cellula ricevente.

Allo stesso tempo, il plasmide F può integrarsi nel cromosoma batterico, cioè può entrare in uno stato integrato. Ci sono circa 20 siti di integrazione del plasmide F nel cromosoma batterico. Quindi, quando una copia di una delle catene del plasmide F viene trasferita nella cellula ricevente, viene trasportata con sé una copia di una delle catene del cromosoma batterico. Le cellule con un plasmide F integrato sono chiamate donatori Hfr (dall'inglese "alta frequenza di ricombinazione"). A seconda delle condizioni è possibile il trasferimento completo o parziale di una copia del cromosoma batterico del donatore Hfr nel citoplasma del ricevente. Di conseguenza, una cellula si forma con un cromosoma batterico iniziale a doppio filamento e una molecola di DNA omologa a filamento singolo completa o incompleta. Tale cellula è chiamata merozigote ("zigote parziale"). Inoltre, durante la replicazione del DNA, avviene la ricombinazione. Questo processo non è fondamentalmente diverso dalla ricombinazione durante la trasformazione.

Il trasferimento della copia del DNA inizia approssimativamente dalla metà del DNA del plasmide F (dal punto O, in cui uno dei filamenti di DNA viene tagliato e inizia la replicazione del DNA del plasmide F). Pertanto, metà del DNA plasmidico F entra nella cellula ricevente all'inizio della coniugazione e l'altra metà solo dopo il trasferimento completo della copia del DNA cromosomico. Sono necessari più di 100 minuti per completare questo processo a t = 37 0 С. Tuttavia, in condizioni naturali, la coniugazione viene interrotta molto prima; solo una parte della copia del cromosoma del donatore e solo la prima metà del DNA del plasmide F entrano nella cellula ricevente. Pertanto, la cellula ricevente non assume le proprietà del donatore Hfr.

Tuttavia, esistono ceppi di batteri in cui una copia del cromosoma batterico, insieme a una copia del DNA plasmidico F, viene trasferita completamente. Tali cellule sono chiamate donatori vHfr (dall'inglese "frequenza di ricombinazione molto alta").

La probabilità di trasferire un determinato gene nella cellula ricevente dipende dalla sua rimozione dal DNA del plasmide F, o meglio, dal punto O, in cui inizia la replicazione del DNA del plasmide F. Più lungo è il tempo di coniugazione, maggiore è la probabilità di trasferire un dato gene. Ciò rende possibile creare una mappa genetica dei batteri in pochi minuti di coniugazione. Ad esempio, nell'Escherichia coli, il gene thr (un operone di tre geni che controllano la biosintesi della treonina) si trova nel punto zero (cioè direttamente accanto al DNA plasmidico F), il gene lac viene trasferito dopo 8 minuti, il gene recE dopo 30 minuti, il gene argR - dopo 70 minuti, ecc.

Il plasmide F può passare da uno stato integrato a uno stato autonomo mediante autoescissione dal cromosoma batterico. In questo caso è possibile catturare anche parti del DNA cromosomico (fino al 50% dei geni cromosomici). Il plasmide F, compresi i geni cromosomici, è chiamato fattore F′. Il trasferimento di materiale genetico durante gli incroci F′×F è chiamato sessuduzione.

Oltre al plasmide F, nei procarioti sono noti anche altri tipi di fattori sessuali (R, Ent, Hly, Col) che assicurano il trasferimento del materiale genetico da batterio a batterio. Sulla base di plasmidi naturali (compreso il DNA dei cloroplasti e dei mitocondri), sono state ottenute molecole di DNA semisintetico che assicurano il trasferimento del materiale genetico da una cellula all'altra, chiamate vettori. I vettori dovrebbero fornire non solo un trasferimento genico stabile, ma anche la regolazione della loro trascrizione.

I plasmidi procariotici possono replicarsi solo nelle cellule procariotiche. Allo stesso tempo, è necessario il trasferimento genico dagli eucarioti ai procarioti e viceversa. Per questo vengono utilizzati plasmidi navetta che contengono due replicatori (procariotici ed eucariotici) e sono in grado di replicarsi sia nelle cellule procariotiche che in quelle eucariotiche, ad esempio i plasmidi Ti e Ri in grado di replicarsi nelle cellule procariotiche e vegetali e i plasmidi semisintetici vettori creati sulla base di essi. Per proteggere i vettori dalla distruzione da parte delle nucleasi, sono racchiusi in vescicole fosfolipidiche: liposomi.

trasduzione

La trasduzione è il trasferimento di materiale genetico da parte di virus da una cellula donatrice a una cellula ricevente. (Il fenomeno della trasduzione fu scoperto nel 1951 da N. Zinder (allievo di J. Lederberg)).

Durante la trasduzione, il DNA della cellula ospite entra nei virioni. I virioni infettano altre cellule e il DNA della cellula batterica originale entra nell'altra cellula batterica. Il DNA virale si integra nel cromosoma batterico e il DNA batterico introdotto si ricombina con il DNA del cromosoma batterico. Di conseguenza, il 50% delle cellule viene trasformato.

Esistono trasduzioni generali (non specifiche), limitate (specifiche) e abortive.

Trasduzione generale

Nella trasduzione totale, i frammenti di DNA batterico provenienti da un donatore vengono incorporati casualmente in una particella fagica in maturazione insieme o al posto del DNA fagico. Frammenti di DNA batterico si formano quando viene tagliato da un enzima controllato dal fago. Una particella fagica può includere fino a 100 geni batterici.

Trasduzione limitata

Con trasduzione limitata, avviene la ricombinazione: il DNA batterico sostituisce parte del DNA fagico. Il DNA ricombinante contiene un piccolo numero di geni batterici adiacenti al DNA fagico integrato nel cromosoma batterico.

Con la trasduzione totale e limitata, il DNA del donatore sostituisce le regioni omologhe del DNA del ricevente. Questo processo è simile alla trasformazione.

La trasduzione abortiva può essere sia aspecifica che specifica. La sua essenza sta nel fatto che il frammento di DNA trasdotto dal fago non è incluso nel cromosoma del ricevente, ma esiste come replicone citoplasmatico. Prima o poi questo replicone va perduto.

Il fenomeno della trasduzione da parte dei virus è ampiamente utilizzato nel trasferimento genico negli eucarioti. Se viene utilizzato un virus che non è in grado di formare un capside (cioè esiste solo sotto forma di DNA), la trasduzione non è fondamentalmente diversa dalla trasformazione o dal trasferimento coniugativo di materiale genetico utilizzando vettori plasmidici. Sono stati creati sistemi vettoriali basati su virus SV40 modificati (formano fino a 100mila copie in una cellula), herpes, vaccinia e virus del mosaico del cavolfiore.

Va sottolineato ancora una volta che tutti i tipi di ricombinazione descritti non sono associati all'aggiunta di nuovi segmenti di DNA, ma alla sostituzione delle sequenze nucleotidiche esistenti. Maggiore è il grado di omologia tra il DNA trasformante e quello originale, maggiore è la probabilità di successo della ricombinazione. Il modo più semplice è la ricombinazione degli enzimi presenti in tutti gli organismi. È più difficile introdurre nel genoma nuovi regolatori con elevata specificità. Pertanto, per introdurre nuovi geni nel genoma, vengono utilizzati metodi più complessi associati alle modifiche biochimiche del DNA.

Argomento 7: Eredità citoplasmatica . Genetica delle cellule e dei tessuti somatici.

1. Eredità citoplasmatica. Materiale genetico degli organelli semiautonomi. eredità plastidica. Ereditarietà attraverso i mitocondri. Sterilità maschile citoplasmatica

2. Tipi particolari di eredità. Predeterminazione del citoplasma. Ereditarietà per infezione ed endosimbionti

3. Genetica delle cellule somatiche. mutazioni somatiche. Chimere. Genetica del cancro.

Cambiamenti di combinazione.

Appaiono come risultato della trasformazione e della coniugazione. La trasformazione è il processo di trasferimento di una sezione di materiale genetico del DNA contenente una coppia di nucleotidi da una cellula donatrice a una cellula ricevente.

Ci sono 5 fasi nel processo di trasformazione:

1) Adsorbimento del DNA in trasformazione sulla superficie di una cellula microbica;

2) Penetrazione del DNA nella cellula ricevente;

3) Appaiamento del DNA introdotto con le strutture cromosomiche della cellula;

4) Incorporazione di una porzione del DNA della cellula donatrice nelle strutture cromosomiche della cellula ricevente;

5) Ulteriore cambiamento nel nucleotide durante le divisioni successive. La temperatura di trasformazione ottimale è 29-32С.

La trasduzione è un cambiamento in cui il materiale genetico di una cellula donatrice viene trasferito a una cellula ricevente da un fago trasduttore (temperato), cioè fago che non ne causa la distruzione.

Esistono tre tipi di trasduzione:

1) Generale (non specifico), può esserci un trasferimento di vari o più segni contemporaneamente.

2) Specifico, caratterizzato dal trasferimento solo di una determinata caratteristica.

3) Abortiva, la regione del DNA della cellula donatrice, trasferita dal fago nella cellula ricevente, non è inclusa nel suo genoma.

La coniugazione è una forma del processo sessuale in cui le cellule microbiche maschili e femminili sono collegate e la sostanza nucleare viene scambiata tra loro.

In questo caso, il materiale genetico della cellula donatrice passa nella cellula ricevente. Dopo la ricombinazione e la divisione cellulare, si formano forme con segni di cellule coniugate.

Pertanto, tutte e tre le forme di variabilità combinatoria (trasformazione, trasduzione, coniugazione) sono diverse nella forma, ma identiche nell'essenza. Durante la trasformazione, una parte del DNA della cellula donatrice entra nella cellula ricevente, durante la trasduzione questo ruolo viene svolto dal fago e durante la coniugazione il trasferimento delle informazioni genetiche viene effettuato attraverso il ponte citoplasmatico (pili).

Rickettsia

Microrganismi Gram-negativi. La forma è quella di bastoncini corti o di cocchi. Le rickettsie hanno una parete cellulare simile a quella dei batteri Gram-negativi.

Sono classificati come veri batteri. Procarioti.

Nitrificazione.

I prodotti di decadimento delle proteine ​​e la decomposizione dell'urea, dell'ammoniaca e dei sali di ammonio possono essere assorbiti direttamente dalle piante, ma solitamente vengono convertiti in nitrati di acido nitrico.

Nella prima fase di nitrificazione, l'ammoniaca viene ossidata ad acido nitrico secondo lo schema

DG = -662kJ/mol.

Il processo di nitrificazione avviene in più fasi, con la formazione di una serie di prodotti intermedi: idrossilammina, nitrossido, ecc.

Nella seconda fase, l'acido nitroso viene ossidato ad acido nitrico:

DG= -201kJ/mol.

La prima e la seconda fase di un singolo processo di nitrificazione sono causate da diversi agenti patogeni. S.N. Vinogradsky li ha raggruppati in tre generi:

1) Nitrosomonas. Sono a forma di bastoncello, gram-negativi, mobili, dotati di un flagello, non formano spore. Sono ampiamente distribuiti nel terreno e differiscono tra loro per forma e dimensione.

2) Nitrosocystis. Capace di formare zoogley (forme coccali di microbi che circondano la capsula)

3) Nitrosospira. Si dividono in due tipologie. I batteri di entrambe le specie hanno una forma a spirale regolare. Insieme ai fili ritorti a spirale, nelle culture antiche si trovano bastoncini corti e cocchi.

Recentemente sono stati identificati altri due generi di microbi che causano la prima fase di nitrificazione.

I batteri nitrificanti hanno un atteggiamento negativo nei confronti delle sostanze organiche. Nelle soluzioni si nota la forte sensibilità dei microbi nitrificanti alle sostanze organiche; questo non è osservato nel terreno, perché non contiene mai sostanze idrosolubili in quantità significative.

I processi di ossidazione dell'ammoniaca sono influenzati non solo dai microbi, ma anche dai loro enzimi. Oltre alla sostanza organica, la nitrificazione è influenzata dalla concentrazione di ammoniaca. Il suo effetto sulla cultura si manifesta nettamente nei media liquidi. Nel terreno, l'ammoniaca è in uno stato adsorbito e non può avere un effetto deprimente. Pertanto, il nitrobacter ossida immediatamente l'acido nitroso in acido nitrico.

La presenza di ossigeno ha un effetto positivo sul processo di nitrificazione. Nei terreni coltivati ​​il ​​processo di nitrificazione procede più intensamente.