Metodi moderni di diagnosi di laboratorio della rabbia nei cani. Rabbia negli animali domestici e selvatici Esami di laboratorio per la rabbia

Nedosekov V.V., Vishnyakov I.O., Gruzdev K.N. VNIIVViM, VGNKI

Una delle malattie infettive più antiche e pericolose dell'umanità è la rabbia. Il pericolo rappresentato dalla rabbia per la vita di persone e animali, purtroppo, non tende a diminuire.

Il significato pratico di questa malattia è determinato dalla sua ampia distribuzione in molte specie animali, dall'elevata mortalità dei pazienti affetti da rabbia e dalla mancanza di trattamenti efficaci.

Nonostante il fatto che le epizoozie della rabbia siano attualmente sostenute principalmente da animali selvatici, gli esseri umani sono principalmente minacciati da cani e gatti. Pertanto, viene prestata particolare attenzione ai problemi relativi alla diagnosi di una malattia nei cani.

La diagnostica di laboratorio moderna e accurata della rabbia, in particolare la diagnostica rapida, rimane rilevante per la medicina veterinaria pratica.

La rabbia del cane viene diagnosticata sia post mortem che in vivo.

Diagnosi post mortem.

UN) rilevamento dell'antigene

Un metodo rapido e sensibile per diagnosticare la rabbia nei cani è il metodo degli anticorpi fluorescenti (MFA), basato sull'esame microscopico ai raggi ultravioletti di impronte, strisci e sezioni di tessuto crioconservate trattate con globulina antirabbica coniugata con isotiocianato di fluoresceina. In alternativa all'MFA, è possibile utilizzare sul campo una variante istochimica del test immunoassorbente enzimatico, che consente di identificare un antigene specifico sia nel materiale decomposto che in quello conservato; inoltre, per registrare i risultati del test è sufficiente un microscopio ottico .

Molto diffuso per la diagnosi della rabbia ricevuto "Sandwich" - una variante del test immunoassorbente enzimatico, il metodo si basa sull'assorbimento dell'antigene in diverse diluizioni su globuline specifiche immobilizzate, seguito dal rilevamento dell'antigene mediante globuline coniugate con perossidasi di rafano . Inoltre nella reazione vengono utilizzati sia anticorpi policlonali che monoclonali, questi ultimi senza dubbio hanno la preferenza maggiore a causa della loro specificità, avidità, stabilità e assenza di reazioni non specifiche.

Uno dei test più accurati per la rilevazione dell'antigene della rabbia è la reazione a catena della polimerasi. Questo metodo consente di diagnosticare la rabbia anche in presenza di almeno un virione nel materiale. Il test si basa sul completamento complementare dello stampo di RNA, effettuato in vitro utilizzando l'enzima RNA polimerasi. Tuttavia, la reazione a catena della polimerasi non è ancora sufficientemente sviluppata per la diagnosi di routine della rabbia e non ha ancora trovato applicazione nei laboratori.

B) isolamento del virus in vitro

L'isolamento del virus può essere necessario per confermare i risultati dei test antigenici e per caratterizzare ulteriormente gli isolati. A questo scopo è ampiamente utilizzata una coltura cellulare di neuroblastoma murino (Na C1300). L’isolamento del virus in colture di neuroblastoma è almeno altrettanto efficace nel rilevare piccole quantità di virus della rabbia quanto lo è nei topi. Inoltre, quando si utilizza questa coltura, il tempo richiesto per la diagnosi viene ridotto da 10-15 a 2 giorni, viene eliminata la necessità di animali da esperimento e il costo della ricerca viene significativamente ridotto. Tuttavia, nonostante ciò, l’infezione intracerebrale dei topi rimane un metodo importante per la diagnosi di laboratorio della rabbia canina.

Diagnosi in vivo.

Un aspetto importante della diagnosi di una malattia è la diagnostica per tutta la vita; fare una diagnosi il più precocemente possibile è di grande importanza per prendere una decisione sull’uso dell’immunoprofilassi. L'antigene virale può essere rilevato mediante MFA nelle impronte corneali o nelle biopsie cutanee di animali affetti da rabbia. Inoltre, il virus può essere isolato da alcuni tessuti e fluidi corporei, in particolare dalla saliva e dal liquido cerebrospinale. Tuttavia, se un risultato positivo del test indica la rabbia, un risultato negativo non esclude la possibilità di infezione.

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La rabbia è una delle malattie infettive più pericolose e gravi ad eziologia virale. L'agente eziologico della rabbia (virus Neuroiyctes rabid) provoca danni gravi e irreversibili al sistema nervoso centrale. Il virus è resistente agli antibiotici, alle basse temperature, ma viene distrutto dal riscaldamento e dall'interazione con gli alcali. La maggior parte delle infezioni sono fatali.

Esistono la rabbia naturale, il cui meccanismo di trasmissione è associato all'attività degli animali selvatici (pipistrelli, lupi, volpi, puzzole, cani procione, ecc.) e il tipo urbano della malattia (animali coinvolti nell'agricoltura, gatti, cani). . Il tasso di mortalità più alto è nella percentuale di persone infette attraverso i morsi. cani randagi o domestici.

L'infezione da rabbia avviene attraverso il morso di un animale o il contatto con una ferita aperta della sua saliva infetta. Dopo l'introduzione del virus, si diffonde rapidamente attraverso tutti i messaggi e i sistemi del corpo umano. Attraverso i tronchi nervosi penetra nel sistema nervoso centrale e periferico, colpendo tutti i suoi dipartimenti. Le caratteristiche del virus indicano che si diffonde anche per via ematogena e linfogena.

"Gli animali sono la principale fonte di rabbia"

Sintomi

Il periodo di incubazione di questa malattia è di circa 1-2 mesi(in rari casi fino a un anno). Il termine dipende dalla posizione della lesione, dalla sua distanza dal cervello del paziente, dal numero di molecole virali entrate nella ferita. Dalla zona lesa, il virus della rabbia entra nel midollo allungato, dove provoca l'encefalite. La velocità con cui il virus si muove lungo le fibre nervose è di 3 mm/ora.

Ci sono tre fasi della rabbia negli esseri umani. Ognuno di essi è caratterizzato da sintomi specifici.

Periodo iniziale o prodromico

La sua durata va dalle 24 ore ai 3 giorni. I seguenti sintomi sono caratteristici:

• I primi segnali arrivano dal lato della ferita. Se a questo punto il sito del morso dell'animale è già guarito, il paziente avverte ancora una sensazione di bruciore o prurito. L'epidermide si infiamma;
• Appare una temperatura subfibrillare (37-37,3 ° C). Non oscilla ancora al di sopra di un dato livello;
• Si uniscono segni di malessere generale: mal di testa, debolezza, nausea, che si trasforma in vomito;
• Spesso il morso cade sul viso. In questo caso, la malattia si manifesta sotto forma di varie anomalie psicologiche. Ci sono allucinazioni visive o olfattive. Il paziente è perseguitato da immagini e odori inesistenti. Un brusco cambiamento di umore provoca uno stato depressivo, isolamento o, al contrario, aggressività, ansia;
• Mancanza di appetito, disturbi del sonno. I terrori notturni contribuiscono all'insonnia.

Fase di eccitazione

In questa fase, il virus si diffonde attivamente in tutti i sistemi umani. La sua durata è variabile da 2 a 3 giorni. I seguenti sintomi sono considerati tipici:

1. Un segno caratteristico della progressione della malattia è l'idrofobia nella rabbia. Se vuoi bere un sorso di liquido, la vittima sviluppa uno spasmo incontrollato dei muscoli della deglutizione e della respirazione. La loro compressione è così forte che può verificarsi il vomito.
2. Le condizioni del paziente sono caratterizzate da una maggiore sensibilità ai suoni forti, alle luci intense e ad altri stimoli esterni. La loro azione provoca aggressività, allucinazioni, forte eccitazione, delirio. Gli attacchi possono verificarsi periodicamente, durante il picco in cui il battito cardiaco di una persona si ferma per alcuni secondi, non c'è respirazione. Non appena passa l'attacco di rabbia, il paziente diventa di nuovo adeguato, il suo discorso viene compreso dagli altri.
3. Il polso di una persona infetta durante un attacco di panico accelera, la saliva scorre abbondantemente dalla cavità orale.
4. Ci sono convulsioni. Colpiscono, prima di tutto, i muscoli facciali.
5. La temperatura corporea sale anche fino a 40°C.

Stadio di paralisi

In questa fase, la malattia copre completamente l'intero corpo umano. La sua durata non è più di un giorno. Convulsioni e allucinazioni cessano di disturbare il paziente, sembra calmo, il che viene spesso percepito dagli altri come il progresso della guarigione. Dopo un breve periodo, si avverte un suono significativo e acuto salto di temperatura fino a 42°С. Allo stesso tempo, la pressione sanguigna scende al di sotto del livello critico, il battito cardiaco accelera. La morte avviene a causa della paralisi del miocardio o del centro respiratorio.

Nella maggior parte dei casi clinici, l’intero ciclo della malattia di una persona infetta dura dai 3 ai 7 giorni. A volte la morte per rabbia avviene il primo giorno dell'infezione, quando il quadro clinico è offuscato e la malattia progredisce rapidamente.

Diagnostica

Come dimostra la pratica, la diagnosi di laboratorio di questo virus negli esseri umani durante la vita è praticamente impossibile. Il test della rabbia viene spesso eseguito sulla base dei sintomi clinici. Questi includono:

• il fatto di un morso o il contatto con la saliva di un animale potenzialmente pericoloso sulla pelle umana;
• dolore al sito del morso anche dopo la completa guarigione dei tessuti molli;
• idrofobia, fotofobia;
• spasmi dei principali gruppi muscolari;
• paralisi;
• violazione della funzione respiratoria, deglutizione.

Un esame del sangue per la rabbia negli esseri umani rivela un numero elevato di globuli bianchi, un livello di emoglobina anormalmente alto e un numero di globuli rossi. Lo studio del biomateriale sanguigno registrerà anche un aumento dell'ematocrito.

Un metodo altamente accurato e altamente sensibile per la diagnosi in vivo della rabbia è uno studio ELISA della zona cutanea del collo, prelevata mediante biopsia (lungo l'attaccatura dei capelli). Il metodo consente di determinare in modo affidabile e rapido l'antigene del virus della rabbia, che è localizzato nelle terminazioni nervose adiacenti ai follicoli piliferi.

Trattamento

La malattia è incurabile se compaiono i suoi segni caratteristici. La profilassi post-esposizione (o PEP) può ridurre la dose del virus entrato nell’organismo.

Il suo obiettivo principale è fornire il primo soccorso corretto e tempestivo a una persona che ha subito un morso o un contatto che comporta il rischio di infezione da rabbia. Queste misure impediranno la penetrazione del virus nelle cellule del sistema nervoso centrale, che di solito porta inevitabilmente alla morte di una persona. La prevenzione dell’emergenza consiste nelle seguenti operazioni:

1. Abbondante disinfezione (lavaggio) e trattamento locale del sito del morso. Le manipolazioni devono essere eseguite immediatamente dopo il contatto! Utilizzare acqua e sapone, soluzioni contenenti iodio.
2. Rafforza le tue difese immunitarie con un vaccino antivirale potente ed efficace che soddisfa gli attuali standard dell'OMS.
3. L'introduzione dell'AIH (immunoglobulina antirabbica). Eseguito solo in presenza di determinate indicazioni.

Gli anticorpi contro il virus appariranno nel corpo non prima di 2 settimane dopo la prima vaccinazione. E il loro numero maggiore sarà notato un mese dopo la vaccinazione. Se esiste anche un piccolo rischio di accorciamento del periodo asintomatico, al paziente viene somministrata l'AIH. Non appena il corso sarà completato, il sistema immunitario della vittima si attiverà e inizierà a funzionare.

Viene effettuato anche un trattamento sintomatico intensivo. Durante il periodo di manifestazione di evidenti segni di rabbia, al paziente vengono prescritti farmaci per alleviare il dolore, stimolanti cardiaci, sonniferi e sedativi. Nelle ultime fasi diventa necessario collegarsi ad un ventilatore.

Nonostante i farmaci e le pillole contro la rabbia sviluppati utilizzando le ultime tecnologie per l'uomo, le vittime continuano a morire a causa del terribile virus. I medici sono sicuri che la colpa sia della disattenzione delle persone e della loro mancanza di consapevolezza del pericolo della malattia.

Durante il periodo di trattamento, al paziente è vietato bere alcolici, ipotermia, rimanere in condizioni di temperature elevate (al sole, in un bagno). L'attività fisica pesante è altamente indesiderabile. Tutti questi fattori sono associati ad una diminuzione del tasso di produzione di anticorpi, ad un calo delle difese dell'organismo.

Prevenzione

Le misure che prevengono la rabbia negli animali domestici sono:

• rispetto delle regole stabilite per tenere i cani, registrarli, camminare con la museruola, tenere nelle voliere;
• vaccinazione obbligatoria (obbligatoria) contro la rabbia, che viene effettuata una volta all'anno.

La terapia immunitaria preventiva è indicata per le persone le cui attività professionali sono legate ad animali selvatici o domestici (cacciatori, veterinari, addetti alle trappole).

Se vieni comunque morso da un animale di strada o da compagnia di cui non conosci lo stato di salute, dovresti adottare le seguenti misure preventive:

1. lavare la ferita con una soluzione calda con sapone da bucato.
2. trattare i bordi dei tessuti molli danneggiati con alcool farmaceutico.
3. indossare una benda allentata e cercare un aiuto qualificato.

Al pronto soccorso il medico deciderà se il paziente ha bisogno di essere vaccinato. La sua attuazione è obbligatoria nei seguenti casi:

• contatto con la saliva di un animale sulle mucose di una persona;
• morsi di qualsiasi gravità e profondità che cadono sulla testa, sul viso, sulle mani;
• morsi profondi o multipli di un animale domestico;
• qualsiasi lesione o danno inflitto da animali selvatici (inclusa la saliva).

Causato dal virus della rabbia. Inoltre, non solo per l'animale stesso, ma anche per il suo ambiente (il proprietario e gli altri membri della famiglia). Il virus provoca infiammazione del cervello negli esseri umani e negli animali. Particolarmente sensibili alla malattia sono volpi, lupi, gatti, bovini grandi e piccoli, cani, pecore, capre, cavalli, ecc.. Gli animali domestici e gli esseri umani si infettano quando mordono animale con la rabbia o dalla saliva che entra in contatto con la pelle rotta, le mucose o gli occhi. La saliva può diventare contagiosa fino a 10 giorni prima che compaiano i segni della rabbia.
Attualmente esistono descrizioni di altre vie di trasmissione: il metodo aereo (alimentare - attraverso cibo e acqua) e il metodo transplacentare (attraverso la placenta durante la gravidanza).
Il virus, diffondendosi lungo le vie nervose, raggiunge le ghiandole salivari e le cellule nervose della corteccia cerebrale e, colpendole, provoca gravi danni irreversibili.

malattia della rabbia animale registrati in tutto il mondo (le uniche eccezioni sono Giappone, Australia e Regno Unito).

Sfortunatamente, la Russia non è inclusa nell’elenco delle eccezioni. Mosca e la regione di Mosca sono anche un ambiente favorevole per la comparsa della rabbia negli animali domestici e selvatici.
Il virus è instabile nell'ambiente esterno: muore se riscaldato a 56 gradi in 15 minuti e quando bollito in 2 minuti. Il virus della rabbia è anche sensibile ai raggi ultravioletti e alla luce solare diretta. Tuttavia, il virus della rabbia è resistente alle basse temperature e agli antibiotici.

Il periodo di incubazione durante l'infezione da rabbia può durare da diversi giorni a diversi mesi (in media 3-6 settimane). La rabbia negli esseri umani può durare fino a un anno. La manifestazione del quadro clinico è preceduta da un periodo di latenza (incubazione). Anche l'animale è pericoloso in questo momento.

Sintomi e segni della rabbia negli animali

Segni di rabbia può comparire in un animale un paio di settimane dopo il morso di un animale rabbioso o il contatto con il virus. Presta attenzione al comportamento del tuo animale domestico. Qualsiasi comportamento inadeguato e innaturale dell'animale dovrebbe avvisarti ed essere più attento. In alcuni casi, la temperatura potrebbe aumentare.
Come sai, gli animali selvatici hanno paura degli umani. In caso di malattia gli animali selvatici possono avvicinarsi alla casa e attaccare anche il bestiame e le persone. Pertanto, se il tuo animale domestico inizia a comportarsi in modo aggressivo o eccessivamente affettuoso, allora questo è un serio campanello d'allarme per non correre rischi e chiamare un veterinario per un esame e una diagnosi della probabilità di rabbia.

Spesso sintomi aspecifici e diagnosi intravitali inaffidabili dovrebbero escludere opzioni "a caso", perché si tratta di conseguenze fatali non solo per l'animale, ma con un'alta probabilità anche per il proprietario.

Diagnosi della rabbia negli animali

La diagnosi viene effettuata sulla base di dati complessi e test di laboratorio. Oggi non esiste un metodo affidabile al 100% per la diagnosi a vita della rabbia negli animali utilizzati nella pratica veterinaria.
L'antigene virale vitale può essere rilevato utilizzando l'MFA nelle impronte della cornea degli animali affetti da rabbia. Inoltre, il virus può essere isolato da alcuni tessuti e fluidi corporei. Tuttavia, un risultato negativo di questo metodo non esclude la possibilità di infezione da rabbia.
Nella diagnosi post mortem della rabbia negli animali, i risultati sono più accurati, perché. vengono applicati altri metodi. Ad esempio, una delle diagnosi patoanatomiche esatte nello studio del cervello è il rilevamento di inclusioni specifiche (corpi di Babes-Negri). Inoltre, il metodo più importante rimane il test biologico: l'infezione intracerebrale.
Un ostacolo alla diagnosi della rabbia negli animali è anche la presenza di varie forme della malattia. I veterinari dividono convenzionalmente la manifestazione della rabbia in tre forme (alcune forme hanno stadi diversi).

Forme di sviluppo e decorso della rabbia negli animali (quadro clinico):

Forma violenta di rabbia:
1 fase. L'animale evita le persone, si nasconde in un luogo buio e appartato. Può apparire un comportamento atipico: aumento dell'affetto o aggressività passiva. In questo caso, può comparire prurito nel sito del morso. L'animale può leccare o mordere il punto di ingresso del virus (lesione). L'appetito diminuisce. Compaiono vomito, salivazione e allucinazioni. L'atto della deglutizione è difficile.
Fase 2. C'è un'aggressività pronunciata. L'ansia cresce, c'è la tendenza a mangiare oggetti non commestibili. Desiderio inconscio di muoversi. L'animale può mordere il proprio corpo (autolesionismo), rosicchiare oggetti circostanti, munizioni, terra. Attacco ad altri animali e persino al proprietario. L'animale non può ingoiare l'acqua. Per questo motivo, salivazione abbondante e incontrollata. Non è possibile mangiare. Manifestazione di convulsioni. Si verifica una paralisi parziale dei muscoli del viso e dei gruppi degli arti. Di conseguenza, si sviluppa lo strabismo, la mascella inferiore si abbassa, la lingua cade fuori dalla bocca.
3 fase (terminale - paralitico). Stato depressivo. Grave esaurimento del corpo, sviluppo della paralisi. L'animale mente quasi costantemente e cade in coma e coma. La morte avviene a seguito di arresto respiratorio dovuto alla paralisi dei muscoli respiratori.

Forma silenziosa di rabbia:
La forma silenziosa è caratterizzata dallo sviluppo di paralisi, salivazione, incapacità di mangiare. Dopo 2-4 giorni l'animale muore. La fase di eccitazione (furia) è di breve durata o assente.

Forma atipica di rabbia:
Forma atipica (viene diagnosticato il complesso). Possono verificarsi diarrea o atonia intestinale. Potrebbe esserci un miglioramento a breve termine della condizione, seguito da sintomi neurologici progressivi. Di conseguenza, l'animale muore. Questa fase del decorso della rabbia può durare fino a 3 mesi o più.

Nel bestiame prevale la forma silenziosa. L'eccitazione in questo caso è debolmente espressa, si notano muggiti rauchi, salivazione, andatura instabile, si sviluppa rapidamente la paralisi degli arti. Spesso si sviluppa un decorso atipico: rifiuto del cibo, atonia del proventricolo, frequente bisogno di defecare, convulsioni, quindi paralisi. In forma violenta, al momento di una crisi, gli animali si liberano dal guinzaglio, ruggiscono, scavano il terreno, si gettano sui muri, attaccano altri animali della loro specie e sono particolarmente aggressivi nei confronti dei cani.
Nelle pecore e nelle capre la malattia procede quasi come nei bovini, ma la paralisi si sviluppa più velocemente (il secondo giorno).
Nei cavalli e nei maiali prevale la forma violenta.

Prevenzione della rabbia negli animali

Il più efficiente ed efficace metodo di prevenzione della rabbia animaleè la vaccinazione. Secondo la legge della Federazione Russa, la vaccinazione annuale è obbligatoria per tutti gli animali domestici e da allevamento. Oggi esiste un'ampia selezione di vaccini contro la rabbia negli animali, sia importati che nazionali. I vaccini moderni forniscono la formazione dell’immunità entro tre anni. La vaccinazione annuale contro la rabbia animale non rappresenta un pericolo per un animale domestico sano.

GOST26075-2013

STANDARD INTERSTATALE

ANIMALI

Metodi per la diagnosi di laboratorio della rabbia

Animali. Metodi di diagnostica di laboratorio della rabbia

Data di introduzione 2015-01-01

Prefazione

Gli obiettivi, i principi di base e la procedura di base per lo svolgimento dei lavori sulla standardizzazione interstatale sono stabiliti da GOST 1.0-92 "Sistema di standardizzazione interstatale. Disposizioni di base" e GOST 1.2-2009 "Sistema di standardizzazione interstatale. Standard, regole e raccomandazioni interstatali per la standardizzazione interstatale. Norme per lo sviluppo, l'adozione, la domanda, il rinnovo e la cancellazione

A proposito della norma

1 SVILUPPATO dall'Istituto federale di bilancio dello Stato "Centro statale panrusso per la qualità e la standardizzazione dei medicinali per animali e mangimi" (FGBU "VGNKI")

2 INTRODOTTO dall'Agenzia Federale per la Regolazione Tecnica e la Metrologia della Federazione Russa

3 ADOTTATO dal Consiglio interstatale per la standardizzazione, la metrologia e la certificazione (verbale del 27 giugno 2013 N 57-P)

Votato per accettare:

Nome abbreviato del paese secondo MK (ISO 3166) 004-97		Nome abbreviato dell'ente nazionale di normalizzazione
Armenia		Ministero dell'Economia della Repubblica d'Armenia
Bielorussia		Stendardo statale della Repubblica di Bielorussia
Kirghizistan		Standard kirghiso
Moldavia		Standard Moldavia
Russia		Rosstandart
Uzbekistan		Uzstandard

4 Con ordinanza dell'Agenzia federale per la regolamentazione tecnica e la metrologia del 30 settembre 2013 N 1127-st, la norma interstatale GOST 26075-2013 è entrata in vigore come norma nazionale della Federazione Russa dal 1 gennaio 2015

5 INVECE DI GOST 26075-84


Le informazioni sulle modifiche a questo standard sono pubblicate nell'indice informativo pubblicato annualmente "Norme nazionali" e il testo delle modifiche e degli emendamenti - nell'indice informativo pubblicato mensilmente "Norme nazionali". In caso di revisione (sostituzione) o cancellazione della presente norma, un avviso corrispondente sarà pubblicato nell'indice informativo pubblicato mensilmente "Norme nazionali". Informazioni, notifiche e testi rilevanti sono pubblicati anche nel sistema informativo pubblico - sul sito web ufficiale dell'Agenzia federale per la regolamentazione tecnica e la metrologia su Internet

1 zona di utilizzo

1 zona di utilizzo

La norma si applica a tutte le specie di mammiferi e stabilisce i seguenti metodi per la diagnosi di laboratorio della rabbia:

- metodo degli anticorpi fluorescenti (MFA);

- un metodo per isolare il virus della rabbia in una coltura cellulare di neuroblastoma di topo CCL-131 (o neurinoma del ganglio di Gasser del ratto - NGUK-1);

- saggio biologico su topi bianchi;

- metodo di dosaggio immunoenzimatico (ELISA);

- reazione di precipitazione per diffusione (RDP).

Appunti

1 Questi metodi sono applicabili a tutti i membri del genere Lyssavirus.

2 Il virus della rabbia di strada appartiene a microrganismi della 2a classe di patogenicità (rappresenta un pericolo mortale per l'uomo e gli animali).

3 Se è necessario genotipizzare il virus della rabbia utilizzando sistemi di test già pronti, viene utilizzato il metodo della reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa (RT-PCR).

2 Riferimenti normativi

Questo standard utilizza riferimenti normativi ai seguenti standard:

GOST ISO/IEC 17025-2009 Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e taratura

GOST 12.0.004-90 Sistema di standard di sicurezza sul lavoro. Organizzazione della formazione sulla sicurezza del lavoro. Disposizioni generali

GOST 12.1.005-88 Sistema di norme sulla sicurezza del lavoro. Requisiti sanitari e igienici generali per l'aria dell'area di lavoro

GOST 12.1.008-76 Sistema di standard di sicurezza sul lavoro. sicurezza biologica. Requisiti generali

GOST 12.4.011-89 Sistema di norme sulla sicurezza del lavoro. Mezzi di tutela per i lavoratori. Requisiti generali e classificazione

GOST 17.0.0.01-76 Sistema di standard nel campo della protezione della natura e del miglioramento dell'uso delle risorse naturali. Disposizioni fondamentali

GOST 177-88 Perossido di idrogeno. Specifiche

Reagenti GOST 2603-79. Acetone. Specifiche

GOST 2768-84 Acetone tecnico. Specifiche

Reagenti GOST 4204-77. Acido solforico. Specifiche

GOST 6709-72 Acqua distillata. Specifiche.

GOST ISO 7218-2011 Microbiologia degli alimenti e dei mangimi. Requisiti generali e raccomandazioni per gli studi microbiologici

GOST 8074-82 Microscopi strumentali. Tipi, parametri di base e dimensioni. Requisiti tecnici.

GOST 9147-80 Vetreria e attrezzature in porcellana da laboratorio. Specifiche

GOST 9284-75 Vetrini per micropreparazioni. Specifiche

GOST 12026-76 Carta da filtro da laboratorio. Specifiche

GOST 13739-78 Olio da immersione per microscopia. Requisiti tecnici. Metodi di prova

GOST 16317-87 Apparecchi elettrici di refrigerazione domestici. Specifiche generali

GOST 21241-89 Pinzetta medica. Specifiche generali.

GOST 22967-90 Siringhe per iniezione medica riutilizzabili. Requisiti tecnici generali e metodi di prova

GOST 24861-91 (ISO 7886-84) Siringhe per iniezione monouso

GOST 25046-81 (ISO 7864-81) Aghi per iniezione monouso. Dimensioni principali. Requisiti tecnici. Metodi di prova

GOST 25336-82 Vetreria e attrezzature da laboratorio. Tipologie, parametri fondamentali e dimensioni

GOST 29230-91 (ISO 835-4-81) Vetreria da laboratorio. Pipette graduate. Parte 4. Pipette per soffiaggio

Nota - Quando si utilizza questo standard, è consigliabile verificare la validità degli standard di riferimento nel sistema di informazione pubblica - sul sito web ufficiale dell'Agenzia federale per la regolamentazione tecnica e la metrologia su Internet o secondo l'indice di informazione annuale "Norme nazionali" , che è stato pubblicato a partire dal 1 gennaio dell'anno in corso, e sulle questioni dell'indice informativo mensile "Norme nazionali" per l'anno in corso. Se lo standard di riferimento viene sostituito (modificato), quando si utilizza questo standard è necessario essere guidati dallo standard sostitutivo (modificato). Se la norma richiamata viene cancellata senza sostituzione, si applica la disposizione in cui è dato il riferimento alla stessa, nella misura in cui tale riferimento non viene pregiudicato.

3 Termini, definizioni e abbreviazioni

3.1 I seguenti termini sono utilizzati nel presente standard con le rispettive definizioni:

3.1.1 rabbia: Malattia infettiva dell'uomo e degli animali causata da membri della famiglia Rhabdoviridae Tipo Lyssavirus(rabdovirus), e portando alla morte nel 100% dei casi.

3.1.2 virus della rabbia: L'agente eziologico di una malattia infettiva nell'uomo e negli animali.

3.1.3 antigene del virus della rabbia: Strutture proteiche superficiali del virus della rabbia contro le quali vengono prodotti anticorpi.

3.1.2* metodo con anticorpi fluorescenti (MFA): Metodo per la rilevazione dell'antigene del virus della rabbia con anticorpi antirabbica marcati con isotiocianato di fluoresceina, con la formazione di caratteristici complessi di inclusioni luminose rilevati nel campo visivo di un microscopio a fluorescenza.
________________

3.1.3 metodo per isolare il virus della rabbia in coltura cellulare di neuroblastoma di topo CCL-131 (o neuroma del nodo di Gasser di ratto - NGUK-1): un metodo per isolare l'antigene del virus della rabbia basato sulla propagazione del virus in coltura cellulare e sulla sua identificazione mediante anticorpi fluorescenti .

3.1.3* saggio biologico: Metodo per isolare il virus della rabbia nei topi bianchi iniettando loro una sospensione di materiale patologico, seguita dall'identificazione del virus mediante il metodo degli anticorpi fluorescenti.
________________
*La numerazione corrisponde all'originale. - Nota del produttore del database.

3.1.4 test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA): Un metodo per rilevare l'antigene del virus della rabbia basato sulla sua interazione specifica con un anticorpo antirabbico immobilizzato su un supporto solido, seguita dal rilevamento dell'antigene legato utilizzando un secondo anticorpo marcato con un enzima mediante colorazione del prodotto della reazione con un cromogeno.

3.1.5 reazione di precipitazione per diffusione (RDP): Metodo per rilevare il virus della rabbia basato sulla capacità degli anticorpi e dell'antigene del virus della rabbia di diffondere in un gel di agar e, in seguito a specifica interazione, di formare un complesso antigene-anticorpo, visibile ad occhio nudo sotto forma di linea di precipitazione.

3.1.6 Reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa (RT-PCR): Metodo per rilevare il genoma del virus della rabbia traducendo una specifica sequenza di RNA del virus in DNA, seguita da ripetute copie del DNA risultante e rilevamento dei prodotti di reazione, effettuata in vitro.

3.2 Nella presente norma vengono utilizzate le seguenti abbreviazioni:

FAG - immunoglobulina antirabbica fluorescente;

AnG - globulina antirabbica;

CFG: controlla la globulina fluorescente;

PBS - soluzione tampone fosfato;

NGUK-1 - neurinoma nodo di Gasser del ratto;

FITC - isotiocinato di fluoresceina;

RNA - acido ribonucleico;

DNA - acido desossiribonucleico;

CCL-131 - coltura cellulare di neuroblastoma di topo;

OFD - ortofenildiammina;

TMB - tetrametilbenzidina.

4 Condizioni di ricerca e requisiti di sicurezza

4.1 Condizioni di ricerca

4.1.1 Requisiti generali per l'analisi microbiologica e il lavoro con microrganismi dei gruppi di patogenicità I-II - secondo GOST ISO 7218.

4.1.2 Requisiti generali per i locali - secondo GOST ISO 7218.

4.1.3 Requisiti per il personale - secondo GOST ISO 7218, GOST ISO / IEC 17025.

I dipendenti qualificati con esperienza nel lavoro con microrganismi dei gruppi di patogenicità I-II, che hanno studiato i metodi di lavoro microbiologico, vaccinati contro la rabbia, possono condurre ricerche.

4.2 Requisiti di sicurezza

4.2.1 Requisiti generali di sicurezza per il lavoro in conformità con GOST 12.1.008.

4.2.2 I dispositivi di protezione per i lavoratori devono essere conformi ai requisiti di GOST 12.4.011.

4.2.3 L'aria dell'area di lavoro deve essere conforme ai requisiti di GOST 12.1.005.

4.2.4 Formazione del personale addetto alla sicurezza sul lavoro in conformità con GOST 12.0.004.

4.2.5 Smaltimento del materiale ottenuto per lo studio, nonché dei dispositivi di protezione individuale utilizzati, degli strumenti, ecc. effettuata mediante ebollizione per 30 minuti o autoclavaggio per 15 minuti ad una pressione di (0,11 ± 0,20) MPa.

5 Strumenti di misura, attrezzature, materiali, reagenti e animali

5.1 Per uso di ricerca:

- spettrofotometro a scansione con un intervallo spettrale di lunghezze d'onda da 190 a 1100 nm con un errore non superiore a ±0,5 nm e un intervallo di misurazioni della densità ottica (OD) da 0,1 a 3,0;

- compresse per reazioni immunologiche a 96 fori;

- un termostato che mantiene la temperatura da 20 °C a 50 °C;

- frigorifero domestico, che garantisce il mantenimento della temperatura da 0 °С a 10 °С secondo GOST 16317;

- centrifuga da laboratorio;

- bagnomaria;

- microscopio luminescente invertito secondo GOST 8074;

- mortai in porcellana con pestello secondo GOST 9147 o omogeneizzatore secondo GOST ISO / IEC 17025;

- vetrini secondo GOST 9284;

- provette in vetro secondo GOST 25336;

- Piastre Petri secondo GOST 25336;

- cuvetta secondo GOST 25336;

- pipette con una capacità di 1,0; 2,0 e 10,0 cm secondo GOST 29230;

- pipette automatiche con capacità da 0,05 a 0,20 ml con puntali;

- pinzette mediche secondo GOST 21241;

- siringhe da insulina con una capacità di 1,0 cm3 secondo GOST 22967 o GOST 24861;

- aghi per iniezione secondo GOST 25046;

- bicchieri da coltura per otto fori;

- gabbie per topi;

- acetone secondo GOST 2603 o GOST 2768;

- immunoglobulina antirabbica fluorescente (FAG);

- globulina antirabbica (AnG);

- controllare la globulina fluorescente (CFG);

- olio per immersione non fluorescente secondo GOST 13739;

- acqua distillata secondo GOST 6709;

- una soluzione tampone fosfato con concentrazione molare di 0,01 mol/dm (PBS), pH 7,2-7,4;

- soluzione isotonica sterile di cloruro di sodio allo 0,9%;

- coltura cellulare di neuroblastoma murino CCL-131 o neurinoma del nodo di Gasser del ratto - NGUK-1;

- penicillina;

-streptomicina;

- Ago MEM medio con doppio corredo di aminoacidi e vitamine (DMEM), pH 7,2;

- soluzione di trypsin 0,25%;

- siero di sangue fetale di bovino per colture cellulari 10%;

-glutammina 3%:

- perossido di idrogeno 3% secondo GOST 177;

- una serie di farmaci per la diagnosi di laboratorio della rabbia animale mediante ELISA;

- una soluzione di acido solforico con concentrazione molare di 2 mol/dm secondo GOST 4204;

- carta da filtro secondo GOST 12026;

- un timbro per la preparazione dei fori;

- mertiolato;

- agar "Difko" o simili;

- una soluzione di arancio metilico all'1% in etanolo al 50%;

- antigeni positivi e negativi;

- siero o immunoglobulina antirabbica;

- topi bianchi clinicamente sani del peso di 6-8 g.

5.2 È consentito l'uso di altri strumenti di misura con caratteristiche metrologiche e apparecchiature con caratteristiche tecniche non peggiori, nonché reagenti e materiali di qualità non inferiore a quelli sopra indicati. Sono consentite stoviglie usa e getta.

6 Campionamento

6.1 Per condurre ricerche sulla presenza del virus della rabbia, al laboratorio viene inviato materiale patologico: un cadavere fresco o una testa di piccoli animali, la testa o il cervello di animali di grandi dimensioni.

6.2 Il materiale patologico selezionato per la ricerca viene confezionato in un contenitore resistente all'umidità e consegnato al laboratorio in contenitori metallici. Il materiale congelato viene posto in un criocontenitore.

6.3 Il materiale patologico è accompagnato da un documento contenente i seguenti dati: nome e indirizzo del mittente, tipologia di animale, dati anamnestici e clinici epizootologici.

6.4 Gli studi di laboratorio vengono eseguiti immediatamente dopo il ricevimento del materiale patologico.

6.5 Per la ricerca, vengono prelevati pezzi di tessuto da animali di grandi dimensioni da ciascuna parte del cervello (corna di Ammon, cervelletto, corteccia cerebrale, midollo allungato) di 0,5-1,0 cm di dimensione, il cervello di piccoli animali, come i topi, viene esaminato come un Totale.

Solo campioni di tessuto cerebrale freschi o appena congelati sono adatti per lo studio dell'MFA e per il metodo di isolamento del virus della rabbia in una coltura cellulare di neuroblastoma murino CCL-131 (o NGUK-1). I campioni di cervello animale in decomposizione (in fase di decadimento), conservati con glicerolo, fissati con alcol metilico, formalina o altri mezzi che promuovono la comparsa di fluorescenza aspecifica non sono ammessi alla ricerca.

Per l'impostazione di un test biologico è consentito utilizzare campioni di cervello conservati in una soluzione di glicerolo al 30%-50%. Non è consentito l'uso di altri conservanti. Per la conservazione, il materiale patologico può essere congelato a una temperatura non superiore a meno 10 °C.

7 Metodo con anticorpi fluorescenti (MFA)

7.1 Essenza del metodo

L'essenza del metodo degli anticorpi fluorescenti risiede nell'interazione specifica degli anticorpi antirabbici fluorescenti con l'antigene omologo del virus della rabbia. Il complesso risultante "antigene-anticorpo", marcato con FITC, viene rilevato visivamente da un caratteristico bagliore nel campo visivo quando osservato al microscopio a fluorescenza.

7.2 Preparazione allo studio

7.2.1 Preparazione del campione

7.2.1.1 Dai pezzi di tessuto selezionati secondo 6.5 su vetrini di vetro accuratamente sgrassati vengono preparati almeno tre preparati (impronte o strisci) da ciascuna parte del cervello. Se le condizioni del materiale patologico lo consentono, vengono preparate le stampe, in altri casi vengono realizzati degli strisci.

7.2.1.2 Preparazione delle stampe

Pezzi di tessuto selezionati secondo 6.5 vengono posti su carta da filtro piegata in quattro fino a sei strati. Il cervello di piccoli animali viene tagliato, catturando tutti i suoi dipartimenti, e posizionato con una pinzetta su carta da filtro piegata in quattro o sei strati. La superficie tagliata viene toccata con un vetrino, premendolo leggermente fino ad ottenere una sottile impronta sul vetro.

7.2.1.3 Preparazione degli strisci

Un pezzo di tessuto da ciascuna parte del cervello (nei piccoli animali l'intero cervello), prelevato secondo 6.5, viene macinato in un mortaio di porcellana con un pestello fino a formare una massa omogenea, dalla quale vengono realizzati strisci su vetrini.

7.2.1.4 Come controllo, si effettuano tamponi o impronte dal cervello di topi bianchi sani, esenti da rabbia e senza rabbia, come descritto ai punti 7.3.1.2 e 7.3.1.3.

7.2.1.5 Dopo la preparazione, gli strisci o le stampe vengono asciugati all'aria per 20-30 minuti, fissati in acetone refrigerato a una temperatura di 4 °C per 4-12 ore o a una temperatura di meno 20 °C per 1 ora, dopodiché vengono rimossi dall'acetone e asciugati all'aria per 10-15 minuti.

7.2.2 Preparazione dei reagenti

FAG, AnG e KFG vengono sciolti con acqua distillata al volume iniziale indicato sull'etichetta della fiala. La durata di conservazione di FAG, AnG e CPG disciolti a una temperatura di (5 ± 2) ° C non è superiore a due settimane.

Direttamente per lo studio, la quantità richiesta di FAG, Ang e CFG disciolti viene diluita con PBS alla diluizione di lavoro indicata sull'etichetta della fiala. Il giorno della preparazione vengono utilizzate diluizioni di lavoro di FAG, Ang e CPG disciolti.

7.3 Conduzione dello studio

I vetrini con preparati (strisci o impronte) secondo 7.2.1 vengono posti in una camera umida (piastra Petri o cuvetta con fondo inumidito). Quindi, una delle tre preparazioni preparate viene rivestita con FAG in una diluizione di lavoro uniformemente su tutta la superficie dello striscio o dell'impronta utilizzando una pipetta. Alla seconda preparazione viene applicata la diluizione di lavoro di KFG. La camera con i preparati viene chiusa, posta in un termostato ad una temperatura di (37 ± 1) °C e incubata per 30 minuti. Le preparazioni di controllo vengono colorate in parallelo. Al termine della colorazione, i preparati vengono lavati tre volte, immergendoli ogni volta per 10 minuti in un recipiente con PBS, risciacquati con acqua distillata ed essiccati all'aria per 20-30 minuti.

Alla terza preparazione viene applicata una diluizione di lavoro di Ang, posta in un termostato ad una temperatura di (37±1) °C e incubata per 30 minuti. Quindi il preparato viene lavato tre volte, immerso ogni volta per 10 minuti in un recipiente con PBS, risciacquato con acqua distillata, essiccato all'aria per 20–30 minuti e colorato con la diluizione di lavoro di FAG, come descritto sopra.

7.4 Gestione dei risultati

Nelle preparazioni colorate, il tessuto cerebrale non colpito dal virus della rabbia brilla di un colore giallo-grigiastro opaco.

L'antigene del virus della rabbia viene rilevato nei neuroni e nelle cellule esterne sotto forma di granuli verde brillante di varie forme e dimensioni, da appena percettibili a con un diametro di 15-20 micron. A volte c'è un gran numero di piccole particelle verde brillante (fino a 1 micron di dimensione) di forma rotonda e ovale.

La diagnosi di rabbia è considerata stabilita se nel preparato studiato si trovano tipici granuli verde-giallastri in diversi campi visivi del microscopio. Allo stesso tempo, nei preparati di controllo (in strisci o impronte del cervello di topi bianchi sani senza rabbia, colorati con FAG), così come nei preparati studiati, colorati con CFG e pretrattati con AnH e colorati con FAG, tali formazioni non dovrebbe essere.

I risultati dello studio vengono comunicati alle autorità competenti secondo la procedura vigente nel territorio dello Stato che ha adottato lo standard.

In caso di risultato negativo, gli studi vengono effettuati su 8 o 9.

8 Metodo per l'isolamento del virus della rabbia in colture cellulari di neuroblastoma murino CCL-131

8.1 Essenza del metodo

L'essenza del metodo è isolare il virus della rabbia in una coltura cellulare di neuroblastoma CCL31 o NGUK-1 di topo con la sua successiva identificazione mediante anticorpi fluorescenti.

Il metodo è un'alternativa al test biologico sui topi bianchi secondo 9.

8.2 Preparazione allo studio

8.2.1 Preparazione del campione

Pezzi di tessuto uguali, prelevati sterilmente da ciascuna parte del cervello di un piccolo animale (corna di Ammon, cervelletto, corteccia cerebrale, midollo allungato), o pezzi di tessuto da ciascuna parte del cervello di un animale di grandi dimensioni, prelevati secondo 6.5, vengono frantumati con le forbici e macinati in un mortaio o in un omogeneizzatore, aggiungendo gradualmente una soluzione isotonica sterile di cloruro di sodio allo 0,9% fino ad ottenere una sospensione al 10%. La penicillina e la streptomicina vengono aggiunte alla sospensione cerebrale rispettivamente a 100 U/cm e 1 mg/cm.

La sospensione risultante viene accuratamente miscelata e centrifugata per 5-10 minuti ad una velocità di 2000 giri al minuto. Il surnatante viene trasferito in una provetta sterile e conservato a una temperatura non superiore a 4°C fino al momento dell'uso.

8.2.2 Preparazione dei vetrini colturali

Una coltura giornaliera di cellule di neuroblastoma murino CCL-131 (o NGUK-1) viene rimossa dal matraccio di coltura utilizzando una soluzione di trypsin allo 0,25% e diluita con terreno DMEM con siero bovino fetale al 10% e glutammina al 3% fino ad una concentrazione di 210 cellule/cm . 0,1 cm3 della sospensione cellulare risultante vengono aggiunti ai pozzetti in vetro di coltura, coperti con un coperchio e posti in un incubatore umido con un contenuto del 5% ad una temperatura di (37 ± 1) ° C per 18-20 ore.

8.3 Conduzione dello studio

In due pozzetti di vetro di coltura secondo 8.2.2, vengono aggiunti 0,05 cm 3 di una sospensione da ciascuna parte del cervello. Su ciascun vetrino vengono lasciati due pozzetti per un controllo positivo e uno negativo. Come controllo positivo viene utilizzata una sospensione del cervello di un topo infetto dal virus della rabbia - ceppo CVS. Come controllo negativo viene introdotta una sospensione del cervello di un topo clinicamente sano. Il vetro di coltura viene posto in un incubatore umido con un contenuto del 5% ad una temperatura di (37 ± 1) °C per 42-48 ore.

Al termine dell'incubazione, il terreno viene rimosso dai pozzetti della vetro di coltura utilizzando una pipetta automatica, le cellule vengono lavate una volta con PBS (una soluzione da 0,2 cm viene aggiunta a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta automatica) ed essiccate in aria laminare flusso per 20-30 minuti. Successivamente, a ciascun pozzetto vengono aggiunti 0,1 cm 3 di acetone raffreddato a meno 20 °C e lasciati a temperatura ambiente per 30 minuti.

Dopo la fissazione delle cellule, il vetro di coltura viene capovolto e agitato per rimuovere l'acetone, quindi essiccato in un flusso d'aria laminare per 20–30 minuti. Utilizzando un bisturi e una pinzetta, rimuovere l'ugello di plastica e asciugare il vetro per altri 5-10 minuti. Aggiungere 0,05-0,10 cm FA a ciascun pozzetto in una diluizione di lavoro (selezionata sperimentalmente) preparata in PBS, posta in una piastra Petri bagnata e incubata a una temperatura di (37 ± 1) °C per 30 minuti.

Al termine della colorazione, i vetrini vengono lavati tre volte, immergendoli ogni volta per 10 minuti in un recipiente con PBS. Quindi i preparati vengono risciacquati con acqua distillata ed essiccati all'aria per 20-30 minuti.

L'olio da immersione non fluorescente viene applicato alle preparazioni colorate e osservato al microscopio a fluorescenza.

8.4 Gestione dei risultati

Nelle preparazioni colorate, la coltura cellulare non infettata dal virus della rabbia si illumina di un colore giallo-grigiastro opaco (controllo negativo). L'antigene del virus della rabbia viene rilevato nel citoplasma della coltura cellulare sotto forma di granuli verde brillante di varie forme e dimensioni con bordi chiari e definiti (controllo positivo).

La diagnosi di rabbia è considerata stabilita se nella preparazione del test si trovano tipici granuli giallo-verdi in diversi campi visivi del microscopio.

Se il virus della rabbia non viene rilevato nella coltura cellulare, viene fatta una diagnosi negativa.

I risultati dell'isolamento del virus della rabbia nella coltura cellulare sono definitivi, non vengono condotti ulteriori studi.

9 Test biologico su topi bianchi

9.1 Essenza del metodo

L'essenza del metodo risiede nell'isolamento del virus della rabbia mediante iniezione intracerebrale di materiale patologico in topi bianchi, seguito dall'identificazione del virus con il metodo degli anticorpi fluorescenti secondo 7.

9.2 Preparazione dei campioni per l'esame - secondo 8.2.1.

9.3 Conduzione dello studio

Da cinque a sei topi bianchi vengono infettati con una sospensione intracerebrale di materiale patologico al 10% in un volume di materiale di 0,02-0,03 cm. Gli animali vengono osservati per almeno 30 giorni. Nel diario viene registrato il numero di topi sani, malati e morti.

9.4 Gestione dei risultati

Nella valutazione dei risultati si tiene conto della presenza di segni clinici nei topi infetti (pelo arruffato, assunzione di cibo, compromissione della coordinazione dei movimenti, paralisi, tremore, prostrazione). La morte dei topi nei primi due giorni dopo l'infezione non viene presa in considerazione. I campioni di cervello di animali malati e morti, a partire dal terzo giorno, vengono esaminati dal MAE entro il 7.

Un test biologico è considerato positivo se, a partire dal terzo giorno dopo l'infezione, almeno un topo si è ammalato ed è morto e sono state rilevate inclusioni specifiche del virus della rabbia nel campione di cervello utilizzando l'MFA.

Una diagnosi negativa può essere data solo dopo 30 giorni di osservazione, a condizione che tutti gli animali infetti rimangano vivi e sani.

I risultati del test biologico sono considerati definitivi, non vengono effettuate ulteriori ricerche.

10 Metodo di dosaggio immunoenzimatico (ELISA)

10.1 Essenza del metodo

L'ELISA si basa sull'interazione specifica dell'antigene del virus della rabbia con un anticorpo immobilizzato su un supporto solido. L'antigene legato viene rilevato utilizzando un secondo anticorpo antirabbico marcato con perossidasi, il cui prodotto di reazione viene colorato quando viene aggiunto il cromogeno. L'intensità della colorazione del prodotto di reazione è direttamente proporzionale alla quantità di antigene.

10.2 Preparazione all'esame

10.2.1 Come materiale di prova (antigene) vengono utilizzati campioni di tessuto cerebrale di animali morti, uccisi forzatamente, sospettati di rabbia o infettati sperimentalmente dal virus della rabbia.

10.2.2 Preparazione dell'antigene del test

I campioni di tessuto cerebrale ottenuti secondo 6.5 vengono frantumati, macinati in un mortaio e le sospensioni al 10% vengono preparate in una soluzione isotonica di cloruro di sodio allo 0,9%, riscaldate a bagnomaria a una temperatura di 60 ° C per 15 minuti e centrifugate per 5-10 minimo a 2000 giri/min. Il surnatante viene utilizzato come antigene del test.

10.2.3 Preparazione dei reagenti

Tutte le soluzioni e i reagenti prima di avviare la reazione devono essere conservati per almeno 30 minuti ad una temperatura di (22 ± 1) °C.

La preparazione dei componenti del kit viene effettuata secondo le istruzioni per l'uso.

10.3 Conduzione dello studio

10.3.1 L'ELISA viene effettuato in versione sandwich utilizzando i componenti inclusi nel kit per la rilevazione dell'antigene patogeno della rabbia nel materiale patologico.

Per l'ELISA vengono utilizzate piastre per reazioni immunologiche con fondo piatto.

Il volume degli ingredienti introdotti gradualmente nei pozzetti della compressa è uguale tra loro ed è 0,1 cm3.

10.3.2 Sensibilizzazione della piastra

Nei pozzetti di una piastra di polistirolo aggiungere Ang alla diluizione di lavoro indicata in etichetta. La piastra con ANG viene coperta con un coperchio e incubata in un termostato a una temperatura di (37 ± 0,5) °C per 3 ore o a una temperatura di 4 °C per 18 ore Dopo l'incubazione, i pozzetti della piastra vengono lavati tre volte con soluzione tampone di lavaggio. Ad ogni lavaggio, il contenuto dei pozzetti viene scosso e la soluzione rimanente viene rimossa picchiettando sulla carta da filtro.

10.3.3 Applicazione degli antigeni

Nelle file della compressa A, B e C preparare il tampone di lavaggio. Gli antigeni di controllo positivi (pozzetto A1) e negativi (pozzetto A2) inclusi nel kit, nonché i campioni da testare (pozzetti A3, A4, ecc.) vengono aggiunti ai pozzetti della compressa e titolati verticalmente, ottenendo diluizioni da 1 :2 a 1:8. Con un numero elevato di campioni vengono riempite anche le altre righe della compressa. La piastra viene coperta con un coperchio e incubata per 1 ora in un termostato a una temperatura di (37 ± 0,5) ° C. Al termine dell'incubazione, i pozzetti della piastra vengono lavati tre volte dagli antigeni non legati all'immunoglobulina, come descritto in 10.3.2.

10.3.4 Applicazione del coniugato di perossidasi della rabbia

Ai pozzetti della piastra viene aggiunto un coniugato di perossidasi antirabbica nella diluizione di lavoro, dopodiché viene coperto con un coperchio e incubato in un termostato a una temperatura di (37 ± 0,5) ° C per 1 ora. della piastra vengono lavati tre volte come descritto in 10.3.2.

10.3.5 Stesura della miscela di substrato

Per la manifestazione della reazione, la miscela di substrato preparata viene aggiunta ai pozzetti della compressa. La reazione viene mostrata per 15-30 minuti ad una temperatura di (22 ± 0,5) °C al buio. La reazione viene bloccata aggiungendo una soluzione di acido solforico con concentrazione molare di 2 mol/dm.

10.4 Gestione dei risultati

La contabilità della reazione viene effettuata visivamente o su uno spettrofotometro a scansione secondo le istruzioni per l'uso del kit.

Se si utilizza OPD come cromogeno nella miscela di substrato, la densità ottica viene misurata a 490 nm, se si utilizza TMB, a 450 nm.

Una reazione viene conteggiata solo se non è presente alcuna colorazione specifica nei pozzetti con antigene di controllo negativo mentre è presente una colorazione intensa nei pozzetti con antigene di controllo positivo. Durante il conteggio visivo, il campione è considerato positivo se almeno una (prima) diluizione mostra una colorazione specifica.

Quando si tiene conto spettrofotometricamente del risultato dell'ELISA, viene calcolato il coefficiente di specificità, che è uguale al rapporto tra la densità ottica (OD) del prodotto di reazione nei pozzetti con l'antigene positivo di controllo o il materiale di prova (OD) e la densità ottica densità della miscela di substrato nei pozzetti con l'antigene di controllo negativo (OD). La reazione è considerata positiva se il coefficiente di specificità è superiore a 2,1 e negativa se è inferiore a 2,1.

Esempio

OPERAZIONE 0,641, OP 0,120, 5.34 - reazione positiva o OD 0,180, OP 0,120 1.5 - la reazione è negativa.

In caso di reazione positiva la diagnosi è considerata consolidata. Un risultato negativo deve essere confermato con altri metodi in 7-9.

11 Reazione di precipitazione diffusiva (RDP)

11.1 Essenza del metodo

L'essenza del metodo RDP risiede nella capacità degli anticorpi e dell'antigene virale di diffondersi in un gel di agar e, in seguito a un'interazione specifica, formare un complesso antigene-anticorpo, visibile ad occhio nudo sotto forma di una linea di precipitazione.

11.2 Preparazione all'esame

11.2.1 Preparazione del campione

Preparazione dei campioni per la ricerca - secondo 8.2.1.

Sono ammessi per la ricerca campioni di cervello animale stantio contaminati da microflora batterica.

11.2.2 Preparazione dell'agar

Per preparare l'agar, mescolare 1,5 g di agar Difco, 1 cm3 di una soluzione di arancio metilico all'1% in etanolo al 50%, 0,01 g di mertiolato, 100 cm3 di soluzione isotonica di cloruro di sodio. La miscela risultante viene fatta bollire fino a completo scioglimento dell'agar, versata in provette, autoclavata ad una pressione di 0,5 atm per 30 minuti e conservata in frigorifero alla temperatura di 4°C.

11.2.3 Preparazione dei vetrini (piastre Petri)

La reazione viene posta su vetrini o su piastre Petri. Una goccia di agar fuso viene applicata sul vetro sgrassato, viene distribuita uniformemente sul vetro e lasciata a temperatura ambiente per 20-30 minuti per solidificare l'agar. Quindi sul vetro vengono applicati 2,5 cm di agar fuso, formando uno strato di circa 2 mm di spessore, e lasciato per 20-30 minuti. I fori vengono praticati nello strato di agar congelato utilizzando un timbro speciale o un tubo metallico a pareti sottili con un diametro di 4-5 mm. Le colonne di agar vengono rimosse con attenzione, senza danneggiare o consentire che un sottile strato di gel di agar si stacchi dal vetro, utilizzando una pinzetta per occhi o altro strumento.

Le piastre Petri vengono preparate in modo simile, aggiungendovi 10-15 cm di agar fuso per ottenere uno strato di 2-3 mm di spessore.

11.3 Conduzione dello studio

Immediatamente prima di impostare la reazione si preparano delle diluizioni di siero antirabbico (immunoglobuline) alle quali si aggiungono in quattro provette 1,0 ml di soluzione isotonica di cloruro di sodio. Aggiungere 1,0 ml di siero antirabbico nella prima provetta per ottenere una diluizione 1:2, mescolare e trasferire 1,0 ml della miscela nella seconda provetta, ecc. Procuratevi quindi quattro provette con diluizioni 1:2, 1:4, 1:8 e 1:16.

0,05-0,07 cm 3 di un campione di cervello (ciascun campione in un pozzetto separato) ottenuto secondo 8.2.1 e diluizioni di siero o immunoglobulina antirabbica (1:2; 1:4; 1:8; 1: 16) secondo la figura 1.

Figura 1 – Schema di applicazione del materiale

Ar - Corno di Ammon; Pm - midollo allungato; A+ - antigene di controllo positivo; M - cervelletto; K - corteccia cerebrale; A- - antigene di controllo negativo

È possibile utilizzare altri schemi per l'introduzione del materiale, ma l'uso di antigeni positivi e negativi è obbligatorio.

I vetrini con il materiale da testare vengono posti in piastre Petri con fondo inumidito o in un essiccatore bagnato, quindi in un termostato a una temperatura di (37 ± 1) °C per 48 ore (le piastre Petri vengono coperte con un coperchio e poste in un termostato).

La reazione viene presa in considerazione dopo 6, 24 e 48 ore.

11.4 Gestione dei risultati

La reazione è considerata positiva quando appare anche una sola linea di precipitazione di qualsiasi intensità tra i pozzetti contenenti il ​​materiale in esame e il siero antirabbico (immunoglobulina).

In questo caso si deve osservare una linea di precipitazione evidente tra l'antigene positivo e il siero antirabbico (immunoglobulina) e non deve esserci alcuna linea di precipitazione tra l'antigene negativo e il siero antirabbico (immunoglobulina).

In caso di reazione positiva la diagnosi è considerata consolidata. Un risultato negativo deve essere confermato con altri metodi in 7-10.

Bibliografia

Guida UE alle buone pratiche di fabbricazione dei medicinali per uso umano e veterinario



UDC 619:616.98:579.852.1:615371 MKS 11.220

Parole chiave: rabbia, diagnostica, metodo con anticorpi fluorescenti, test immunoenzimatico, test biologico, reazione di precipitazione per diffusione

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Testo elettronico del documento
preparato da CJSC "Kodeks" e confrontato con:
pubblicazione ufficiale
M.: Standardinform, 2014

DIAGNOSI RAPIDA DELLA RABBIA

Metodi per la rilevazione degli antigeni. In caso di rabbia per la diagnosi rapida possono essere utilizzati metodi di anticorpi fluorescenti (MFA), reazioni di precipitazione (RP) in gel di agar, metodi di dosaggio immunoenzimatico (ELISA), reazione a catena della polimerasi (PCR). Sono necessari diversi test per diagnosticare la rabbia negli esseri umani in vivo.

Determinazione degli anticorpi contro gli antigeni del virus della rabbia. Il rilevamento degli anticorpi nel siero del sangue o nel liquido cerebrospinale è un importante metodo diagnostico. I test sierologici degli anticorpi specifici per la rabbia vengono eseguiti nel siero del sangue per determinare la vaccinazione pre e post-esposizione e determinare i tempi dell'immunizzazione di richiamo al fine di aumentare la risposta immunitaria.

Isolamento del virus. Per l'isolamento e l'identificazione del virus viene utilizzato il metodo del biotest sui topi bianchi. Il materiale in esame viene sospeso in una soluzione fisiologica contenente antibiotici e siero fetale bovino. La sospensione viene somministrata per via intracerebrale a topi bianchi del peso di 5-6 g Per dimostrare lo sviluppo dell'infezione, i topi vengono osservati quotidianamente fino al 30 ° giorno dopo l'inoculazione. I topi che sviluppano la malattia durante questo periodo vengono immediatamente soppressi e i tessuti cerebrali vengono esaminati mediante MFA diretta.

Il vantaggio di questo approccio è la capacità di rilevare piccole quantità di virus della rabbia nel materiale. Lo svantaggio del metodo è la necessità di molti giorni (7-18 giorni) di attesa tra l'inoculazione e la comparsa dei primi segni della malattia. Per ridurre il periodo di incubazione vengono utilizzati topi allattati. I topi di età inferiore a 3 giorni possono essere utilizzati per la diagnostica rapida: nei topi macellati dopo 3 giorni, l'antigene del virus è già rilevato nel cervello, che può essere rilevato dall'MFA.

Questo metodo di isolamento del virus viene praticato come test diagnostico di conferma in caso di risultati negativi per la rilevazione dell'antigene e dei corpi di Babes-Negri e in caso di morso di una persona da parte di un animale sospettato di rabbia. Fornisce sensibilità e specificità adeguate, cioè è considerato al livello di significato diagnostico del metodo di immunofluorescenza diretta. Inoltre, questo metodo è il principale per l'identificazione delle varianti virali ed è promettente per lo sviluppo di reagenti diagnostici.

Isolamento e identificazione del virus in coltura cellulare. Il principale svantaggio dell'isolamento del virus durante l'infezione degli animali da laboratorio è la durata del metodo. Ciò può essere evitato utilizzando colture cellulari. Di solito, per questi scopi viene utilizzata una coltura di cellule di neuroblastoma di topo se è necessario esaminare i tessuti cerebrali. Il cervello viene sospeso in un mezzo nutriente di coltura, la sospensione viene applicata su un monostrato di coltura cellulare e incubata per uno o più giorni.

La sensibilità di una determinata coltura al virus può essere aumentata trattandola con destrano DEAE. Il monostrato cellulare viene quindi lavato, fissato a freddo con acetone o una miscela di formalina e metanolo ed esaminato mediante immunofluorescenza. Se l'animale è stato infettato dal virus della rabbia, nel monostrato della coltura cellulare vengono rilevate inclusioni citoplasmatiche dell'antigene del virus della rabbia.

È stato dimostrato che l'antigene del virus della rabbia può essere rilevato su cellule di neuroblastoma murino Na C1 300 in combinazione con MFA dopo 2 giorni. La sensibilità del metodo è paragonabile a quella dell'isolamento del virus nei topi.

Sebbene il virus della rabbia abbia neuropatogenicità obbligata in vivo, è in grado di infettare un'ampia gamma di cellule ospiti in vitro, che possono essere utilizzate per testare la presenza del virus della rabbia in altri tessuti e organi. È stato stabilito che il virus della rabbia si moltiplica nelle cellule BHK-21 e Vero, nelle cellule primarie di embrioni di pollo o di reni di criceto. È stato dimostrato che l'adsorbimento del virus e la sua introduzione nella cellula avvengono entro 7 ore. Dopo 24-48 ore all'interno della cellula si formano nuove particelle virali, dopo 72 ore germogliano dalla membrana cellulare nello spazio intercellulare.

Metodi di ricerca

Per diagnosi espressa della rabbia può essere utilizzata:

un metodo SE UN- rilevare l'antigene del virus della rabbia nelle impronte della cornea o della parte posteriore del collo di un paziente contenenti follicoli piliferi;
b) metodo PCR- per rilevare l'RNA del virus in campioni bioptici tissutali, saliva, liquido cerebrospinale o lacrimale;
c) metodo ELISA- per rilevare anticorpi specifici (antigene) in pazienti con decorso tipico o atipico.
d) metodo saggi biologici- per isolare il virus nelle fasi iniziali della malattia o per rilevare anticorpi nel sangue o nel liquido cerebrospinale nelle fasi successive della malattia. Per la diagnosi rapida viene utilizzato un metodo complesso (biotest + MFA), che consiste nell'infettare topi neonati di 2 giorni con il materiale del test ed esaminare il loro cervello nei giorni 3-4 in MFA.

La scelta dei metodi di diagnostica in vivo dipende in gran parte dallo stadio della malattia: un metodo basato sulla rilevazione degli antigeni, di norma, è altamente sensibile alla fine del periodo di incubazione, durante i primi giorni della malattia, mentre gli anticorpi neutralizzanti il ​​virus compaiono solitamente nel liquido cerebrospinale e nel sangue dopo 7-10 giorni dall'esordio della malattia.

Reazione di immunofluorescenza. Il metodo si basa sull'uso di anticorpi legati a un colorante, ad esempio l'isotiocianato di fluoresceina. Il RIF è ampiamente utilizzato per rilevare antigeni virali nel materiale dei pazienti e per una diagnosi rapida.

Il metodo ha il più alto grado di sensibilità; costituisce la base per la diagnostica rapida e consente di rilevare gli antigeni virali entro poche ore.

I principali vantaggi dell'MFA sono: velocità di esecuzione, elevata specificità (100%). Il tempo impiegato per diagnosticare la malattia con il suo aiuto è inferiore a un giorno. Vengono utilizzate versioni dirette e indirette dell'AMF.

Immunofluorescenza diretta rimane il metodo preferito per diagnosticare la rabbia. I vetrini contenenti impronte di tessuti cerebrali o vetri con un monostrato di coltura tissutale vengono fissati in acetone per 1-4 ore. Le preparazioni vengono poi essiccate e trattate con anticorpi policlonali fluorescenti anti-nucleocapsidi (reagente immunofluorescente).

Questo reagente è un coniugato preparato da anticorpi policlonali specifici della classe IgG contro l'antigene nucleocapside del virus e l'isocianato di fluoresceina (FITC). Gli anticorpi specifici si ottengono mediante iperimmunizzazione di animali (conigli, criceti o cavalli) con una miscela di epitopi del nucleocapside del virus.

Attualmente per questi scopi vengono sempre più utilizzati anticorpi monoclonali di topo contro il nucleocapside del virus della rabbia. Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37°C, le preparazioni diagnostiche vengono ripetutamente lavate con soluzione salina e acqua distillata.

Gli anticorpi marcati con FITC vengono fissati solo nei siti di localizzazione degli antigeni nucleoproteici virali. I preparati vengono poi essiccati all'aria ed esaminati al microscopio ottico utilizzando una lampada allo xeno e un filtro appropriato come sorgente luminosa.

A versione indiretta l'antigene viene prima combinato con il siero immunitario specifico non colorato. Quindi, i complessi antigene-anticorpo non fluorescenti formati vengono esposti a siero immunitario marcato con fluorocromo contenente anticorpi contro specifiche proteine ​​sieriche. La versione indiretta dell'MFA, insieme alla rilevazione dell'antigene, consente di quantificare gli anticorpi nel siero in esame diluendolo opportunamente.

Le formazioni marcate con FITC in cellule di diversi tessuti vengono rilevate come colorazione fluorescente giallo-verde su sfondo scuro (sotto forma di inclusioni intracitoplasmatiche rotonde o ovali).

Saggio immunoassorbente collegato. Il metodo si basa sul principio dell'assorbimento delle proteine ​​sulla fase solida seguito dalla formazione di complessi antigene-anticorpo rilevati da una soluzione substrato-indicatore. L'antigene aggiunto ai pozzetti si lega specificamente agli anticorpi. I sieri del test vengono applicati sullo strato antigenico nelle diluizioni richieste. In presenza di anticorpi specifici in essi, questi ultimi si legano all'antigene. Per rilevare il legame, allo strato di anticorpi viene applicata un'immunoglobulina contro le globuline sieriche umane coniugate con perossidasi di rafano. La quantità di coniugato assorbente è proporzionale alla quantità di siero umano legato all'antigene. Questo può essere determinato utilizzando una soluzione indicatrice (ortofenililendiammina + perossido di idrogeno), i cui componenti, a seguito dell'azione della perossidasi coniugata, colorano il liquido marrone-giallo. Quando si esaminano casi poco chiari, l'uso dell'ELISA in aggiunta ai metodi RP o RSK consente di aumentare l'affidabilità della diagnosi di laboratorio della rabbia, grazie all'elevata sensibilità di questo metodo. Il metodo consente di rilevare particelle infette e difettose.

Per determinare gli anticorpi antirabbici durante la vaccinazione, è possibile utilizzare un metodo ELISA indiretto, utilizzando un virus purificato come antigene, e per determinare gli anticorpi della classe IgG nel siero umano, la proteina A dello stafilococco associata alla perossidasi di rafano. I risultati dell'ELISA sono paragonabili a quelli ottenuti nei test di neutralizzazione virale nei topi. Il metodo consente di rilevare la presenza di IgM all'inizio del processo di immunizzazione.

I metodi immunoenzimatici sono molto promettenti per il rilevamento dell'antigene nucleocapside del virus durante la diagnosi post mortem nei tessuti cerebrali. Tra questi, ad esempio, c'è un metodo ELISA rapido per la diagnosi della rabbia, basato sulla preparazione di piastre sensibilizzate con anticorpi dell'isotipo IgG al nucleocapside del primo sierotipo, diluiti in tampone carbonato.

Il materiale da testare viene omogeneizzato in tampone o terreno di coltura, chiarificato mediante centrifugazione, aggiunto ai pozzetti e incubato in piastre. L'antigene nucleocapside fissato con anticorpi specifici viene identificato aggiungendo un coniugato di perossidasi con anticorpi antirabbici antinucleocapsidici di diversa specificità di specie e un substrato cromogenico. La sensibilità del metodo è 0,8–1,0 ng/ml.

Questo metodo può rilevare antigeni di virus di vari sierotipi. L'uso di coniugati di anticorpi specifici del nucleocapside marcati con biotina aumenta la sensibilità del metodo a 0,1–0,2 ng/ml.

L'antigene nucleocapside viene rilevato con successo mediante ELISA, ma il materiale, anche decomposto, non deve essere fissato con formalina.

Metodo della reazione a catena della polimerasi. Per una diagnosi rapida del virus della rabbia e l'identificazione dei lyssavirus, il metodo più conveniente è la reazione a catena della polimerasi (PCR). Il metodo PCR è il metodo più affidabile e veloce per isolare l'RNA virionico da qualsiasi campione contenente il virus a bassa concentrazione. Con esso, puoi creare molte copie del virus RNA. Questo metodo viene utilizzato per confermare i risultati dell'MFA e per rilevare il virus nella saliva, nei follicoli piliferi della parte posteriore del collo e della testa.

La PCR si basa sul principio della replicazione naturale del DNA. L'essenza del metodo è la ripetizione ripetuta di cicli di sintesi (amplificazione) di una sequenza di DNA specifica del virus utilizzando una polimerasi Taq DNA termostabile e due primer specifici, i cosiddetti primer.

Ogni ciclo è composto da tre fasi con diverse condizioni di temperatura. In ogni ciclo, il numero di copie della regione sintetizzata viene raddoppiato. I frammenti di DNA appena sintetizzati fungono da modello per la sintesi di nuovi filamenti nel successivo ciclo di amplificazione, il che consente di accumulare un numero sufficiente di copie della regione di DNA selezionata in 25-35 cicli per la sua determinazione, solitamente mediante gel di agarosio elettroforesi.

Sensibilità particolarmente elevata della PCR quando si utilizzano primer complementari al gene N, quando è possibile rilevare l'RNA del virus in campioni contenenti il ​​virus in un titolo di 10 MLD50. Il metodo PCR può rilevare l'RNA del virus anche nel materiale patologico decomposto.

Attualmente, sono stati sviluppati e sono ampiamente utilizzati nella pratica test di conferma (conferma), come la PCR con trascrittasi inversa (RT-PCR). Il metodo RT-PCR è altamente sensibile e più efficiente. L'RNA viene estratto dai tessuti dell'organo infetto dal virus, trascritto in cDNA, che viene poi amplificato mediante PCR. La RT-PCR richiede primer ottenuti per le regioni conservatrici del genoma del virus della rabbia. Tipicamente, vengono utilizzati geni che codificano per una nucleoproteina o una N-proteina.

Il metodo PCR è altamente specifico e molto sensibile. È uno dei test più accurati per la rilevazione dell'antigene della rabbia; consente di diagnosticare la rabbia anche se nel materiale è presente almeno un virione. Il test si basa sul completamento complementare dello stampo di RNA, effettuato in vitro utilizzando l'enzima RNA polimerasi. Negli ultimi anni, la PCR è stata sempre più utilizzata per diagnosticare e monitorare le infezioni virali. Tuttavia, la tecnica è complessa, costosa e non ancora sufficientemente unificata per l’uso di routine.

I metodi citologici hanno attualmente un valore diagnostico limitato, ma dovrebbero ancora essere utilizzati in una serie di infezioni. Vengono esaminati materiali autoptici, biopsie, strisci che, dopo un'adeguata lavorazione, vengono colorati e analizzati al microscopio. Nella rabbia si tratta della rilevazione di inclusioni nel citoplasma delle cellule (corpi di Babes-Negri).

Isolamento del virus. L'isolamento del virus può essere necessario per confermare i risultati dei test antigenici e per caratterizzare ulteriormente gli isolati. E sebbene questo metodo sia uno dei metodi diagnostici più antichi e dispendiosi in termini di tempo, oggi l'isolamento del virus con successiva identificazione utilizzando uno dei metodi moderni (ELISA con anticorpi monoclonali o PCR) è il metodo diagnostico più affidabile, il cosiddetto. "standard d'oro".

L'efficacia dei metodi diagnostici della rabbia può variare in base a una serie di fattori (stadio della malattia, tempi di campionamento del materiale, qualità dei campioni ottenuti, condizioni di conservazione, esperienza del personale, qualità dei reagenti, ecc.). Se un risultato positivo conferma la rabbia, un risultato negativo non indica sempre l'assenza della malattia. Pertanto, per la rabbia, gli esperti dell'OMS raccomandano l'uso di diversi test, in particolare l'MFA in combinazione con un test biologico su topi bianchi neonati (di 2-3 giorni).

Misure di prevenzione personale

Tutti i lavori con materiale sospettato di contenere il virus della rabbia, nonché con animali sospettati di avere la rabbia, devono essere eseguiti nel rispetto delle misure di sicurezza personale. Gli operatori sanitari e i veterinari devono lavorare indossando camici, guanti e maschere.

Alla fine del lavoro le scatole vengono trattate con una soluzione di perossido di idrogeno al 3%.

Fiale, fiale e strumenti, nonché i rimanenti materiali contenenti il ​​virus della rabbia e tutti gli utensili dopo il lavoro vengono disinfettati in autoclave per 1 ora a 1,5 atm (modalità kill).

I dispositivi di protezione individuale vengono disinfettati mediante bollitura o autoclavaggio. La superficie di lavoro del tavolo e delle mani viene disinfettata con una soluzione disinfettante (soluzione di cloramina allo 0,5%).