Sifilide RPHA (reazione di emoagglutinazione passiva), titolo
Rilevazione nel siero del sangue di anticorpi specifici contro il treponema pallido (Treponema pallidum), utilizzato per confermare i risultati di test non specifici per la sifilide, screening per la sifilide, screening di contatti e donatori di sangue.
Sinonimi russi
Lues, treponema pallido.
SinonimiInglese
Sifilide, test di emoagglutinazione passiva; Sifilide, test di emoagglutinazione indiretta; Saggio di emaglutinazione del Treponema Pallidum, TPHA.
Metodo di ricerca
La reazione di emoagglutinazione indiretta (RNGA).
Quale biomateriale può essere utilizzato per la ricerca?
Sangue venoso.
Come prepararsi adeguatamente alla ricerca?
- Non fumare nei 30 minuti precedenti lo studio.
Informazioni generali sullo studio
La sifilide è un'infezione trasmessa sessualmente causata dalla spirocheta Treponema pallidum sottospecie pallidum. L'ingresso di questo batterio nell'organismo porta allo sviluppo di una risposta immunitaria, accompagnata dalla produzione di anticorpi sia aspecifici ("non treponemici") che specifici ("treponemici"). La rilevazione degli anticorpi contro T. pallidum è la base per la conferma di laboratorio della sifilide. A seconda del tipo di anticorpi determinati nella reazione, gli studi sierologici sono suddivisi in non specifici ("non treponemici") e specifici ("treponemici"). Il test di emoagglutinazione passiva (RPHA) si riferisce al test "treponemico", cioè specifico per il T. pallidum.
L'RPHA si basa sul fenomeno dell'agglutinazione, sulla cui superficie vengono adsorbiti gli antigeni di T. pallidum (reagente RPHA), quando ad essi viene aggiunto il siero di un paziente affetto da sifilide contenente anticorpi specifici contro la spirocheta. Tali anticorpi compaiono nel sangue dei pazienti affetti da sifilide 2 (IgM) e 4 (IgG) settimane dopo l'infezione. Va notato che questo periodo può essere prolungato fino a 6 settimane. Pertanto, la sensibilità dell'RPHA nel periodo primario della sifilide è leggermente inferiore alla sensibilità di questo metodo nei periodi secondario e terziario ed è pari a circa l'86%. Il vantaggio dell'RPGA è la sua elevata specificità (96-100%), che consente di utilizzare questa analisi come test di conferma dopo un risultato positivo di qualsiasi studio non specifico, "non treponemico" (ad esempio). La sensibilità dell'RPGA nel periodo secondario e terziario della sifilide, così come nella sifilide latente, è del 99-100%.
La sensibilità dell'RPHA e di altri test "treponemici" supera la sensibilità dei test non specifici ("non treponemici"), come la reazione di microprecipitazione (MRP) con l'antigene della cardiolipina. Pertanto, recentemente, i test "treponemici", compreso l'RPHA, sono diventati più spesso utilizzati come test di screening per la sifilide. Se lo screening per la sifilide con TPHA risulta positivo, deve essere eseguito un test di conferma. In questo caso, si tratta di qualsiasi altro test "treponemico", ma non del TPHA (ad esempio, test immunoenzimatico).
Di norma, il risultato dell'RPHA rimane positivo anche dopo il trattamento della sifilide. L'eccezione è la situazione in cui la terapia è stata effettuata all'inizio della malattia. Poiché il risultato rimane positivo per tutta la vita, l'RPHA non è destinato alla diagnosi differenziale della sifilide precoce e tardiva. Per lo stesso motivo, questo studio non viene utilizzato per valutare l'efficacia del trattamento della malattia.
Quando il siero di pazienti affetti da sifilide viene aggiunto al reagente RPHA, si verificano agglutinazione (incollaggio) e precipitazione degli eritrociti. Il grado di agglutinazione dipende dalla concentrazione di anticorpi nel siero, quindi l'RPGA consente non solo di rilevare la presenza di anticorpi, ma anche di determinarne la quantità. Il risultato dell'analisi viene presentato come titolo anticorpale. Qualsiasi titolo positivo indica una possibile infezione da T. pallidum, ma sono possibili reazioni false positive. Tassi significativamente aumentati sono caratteristici della sifilide precoce secondaria e latente.
Risultati falsi positivi dell'RPHA si osservano nello 0,05-2,5% dei casi e sono spesso dovuti alla presenza di autoanticorpi nel siero del paziente (con malattie sistemiche del tessuto connettivo, ad esempio con lupus eritematoso sistemico), anticorpi contro altri agenti patogeni simili nella struttura antigenica di T. pallidum (, treponema saprofito del cavo orale e dei genitali), così come in altre condizioni fisiologiche e patologiche (, malattie oncologiche,). Di regola, il titolo della reazione falsa positiva di TPHA è basso. Fanno eccezione i risultati dell'RPHA in pazienti con malattie diffuse del tessuto connettivo e neoplasie maligne, quando il titolo anticorpale può raggiungere valori molto elevati. Le reazioni false positive si negativizzano spontaneamente e senza lasciare traccia entro 4-6 mesi (reazione falsa positiva acuta, spesso durante la gravidanza) o un periodo più lungo (reazione falsa positiva cronica).
Date queste caratteristiche, il risultato dell’RPGA dovrebbe essere interpretato tenendo conto di ulteriori dati anamnestici e di laboratorio. Quando si conferma la diagnosi di sifilide, è necessario escludere la presenza di altre infezioni a trasmissione sessuale, nonché esaminare tutti i partner sessuali e i familiari del paziente.
A cosa serve la ricerca?
- Confermare la diagnosi di sifilide con un test di screening positivo non specifico;
- per lo screening della sifilide;
- per l'esame di persone che hanno avuto rapporti sessuali e stretti rapporti familiari con un paziente affetto da sifilide;
- per escludere la sifilide in un donatore di sangue.
Quando è programmato lo studio?
In esame:
- un paziente con segni clinici di sifilide (difetto erosivo o ulcerativo indolore su base dura) e linfoadenopatia regionale (sifilide primaria), rash cutaneo polimorfico, alopecia multifocale o diffusa, leucoderma sifilitico (sifilide secondaria), nodo elastico denso con decadimento o formazione di una cicatrice "secca" (sifilide terziaria);
- persone che hanno avuto rapporti sessuali e stretti rapporti familiari con un paziente affetto da sifilide;
- donatore di sangue;
- con visita preventiva annuale, ricovero in ospedale, registrazione del libretto sanitario.
Cosa significano i risultati?
Valori di riferimento: negativo.
Ragioni per un risultato positivo:
- sifilide primaria, secondaria, terziaria e latente (acquisita e congenita);
- gravidanza;
- epatite B e C;
- uso di droga per via parenterale;
- infarto miocardico acuto;
- malattie diffuse del tessuto connettivo;
- febbre ricorrente;
- borreliosi trasmessa dalle zecche;
- treponematosi tropicali (yaws, bejel, pint);
- processi infiammatori causati dal treponema saprofitico del cavo orale e dei genitali;
- neoplasie maligne;
- traumi estesi e fratture;
- endocardite batterica;
- tubercolosi;
- Mononucleosi infettiva;
- reazione post-vaccinazione.
Ragioni per un risultato negativo:
- niente sifilide;
- prime 2-4 settimane dopo l'infezione da T. pallidum.
Cosa può influenzare il risultato?
Chi ordina lo studio?
Dermatovenereologo, neurologo, medico di base, epidemiologo.
Letteratura
- French P, Gomberg M, Janier M, Schmidt B, van Voorst Vader P, Young H; IUST. IUSTI: Linee guida europee 2008 sulla gestione della sifilide. Int J AIDS. 2009 maggio;20(5):300-9.
- Seña AC, Bianco BL, Sparling PF. Nuovi test sierologici per Treponema pallidum: un cambio di paradigma nello screening della sifilide per il 21° secolo. Clin Infect Dis. 2010 settembre 15;51(6):700-8.
- Luger A. Diagnosi di sifilide. Organo Mondiale della Sanità Toro. 1981;59(5):647-54.
- Holmes K.K. Malattie sessualmente trasmissibili / K.K. Holmes, P.F. Sparling, W.E. Stamm; 4a ed. - McGraw-Hill, 2008.
Puntura dei linfonodi regionali
La pelle sopra i linfonodi viene trattata con alcol al 96% e soluzione alcolica di iodio al 3-5%. Quindi 1 e 2 dita della mano sinistra fissano il linfonodo. Con la mano destra si preleva una siringa sterile contenente alcune gocce di soluzione isotonica di cloruro di sodio, che viene iniettata parallelamente all'asse longitudinale del linfonodo. L'ago viene spinto in diverse direzioni verso la parete opposta della capsula linfonodale e il contenuto della siringa viene iniettato lentamente. Con le dita della mano sinistra si massaggia leggermente il linfonodo. Con il lento ritiro dell'ago, contemporaneamente viene fatto avanzare lo stantuffo della siringa, aspirando il contenuto del linfonodo. Il materiale viene applicato su un vetrino (con una piccola quantità di materiale viene aggiunta una goccia di soluzione isotonica di cloruro di sodio), coperto con un vetrino coprioggetto. Lo studio del farmaco nativo viene effettuato nel campo visivo oscuro utilizzando un microscopio ottico con condensatore a campo oscuro (obiettivo 40, 7x, 10x o 15x). Treponemi chiari si possono trovare anche nelle preparazioni colorate. Se colorati secondo Romanovsky-Giemsa, i treponemi chiari sono colorati in rosa, secondo Fontan e Morozov in marrone (nero), secondo il metodo Burri, i treponemi non colorati vengono rilevati su uno sfondo scuro.Diagnosi sierologica
L'importanza nella diagnosi della sifilide, nella valutazione dell'efficacia del trattamento, nella definizione di un criterio di cura, nell'identificazione di forme latenti e resistenti è data alle reazioni sierologiche standard (classiche) e specifiche. I test sierologici standard o classici (SSR) includono:- Reazione di Wasserman (RV),
- reazioni sedimentarie di Kahn e Sachs-Vitebsky (citocoliche),
- reazione su vetro (metodo espresso),
- reazione di immobilizzazione del treponema pallido (RIBT),
- reazione di immunofluorescenza (RIF).
Reazione di Wasserman (RV)
- sviluppato da A. Wasserman insieme ad A. Neisser e C. Bruck nel 1906. La reazione di Wasserman si basa sul fenomeno della fissazione del complemento (reazione di Borde-Gangu) e permette la determinazione di anticorpi antilipidi (reagine). Secondo i concetti moderni, la reazione di Wasserman determina anticorpi contro i lipidi dei macroorganismi e non contro il treponema pallido, e la reazione rivela un processo autoimmune causato dalla denaturazione dei tessuti dei macroorganismi da parte dei treponemi pallidi con la formazione di un complesso lipoproteico (coniugato), in cui i lipidi (apteni) sono il determinante.Di solito il RV viene posizionato con due o tre antigeni. I più comunemente usati sono l'antigene cardiolipina altamente sensibile (estratto di cuore bovino arricchito con colesterolo e lecitina) e l'antigene treponemico (sospensione sonicata di treponema pallidum coltivato anatogenico). Insieme alle reazioni del siero sanguigno del paziente, questi antigeni formano un complesso immunitario capace di adsorbire e legare il complemento. Per la determinazione visiva del complesso formato (reagine + antigene + complemento), come indicatore viene utilizzato un sistema emolitico (una miscela di eritrociti di montone con siero emolitico). Se nella prima fase della reazione (reagne + antigene + complemento) si lega il complemento, non si verifica emolisi: gli eritrociti precipitano in un precipitato facilmente visibile (PB positivo). Se il complemento non si lega nella fase 1 a causa dell'assenza di reagine nel siero in esame, verrà utilizzato dal sistema emolitico e si verificherà l'emolisi (PB negativo). Il grado di gravità dell'emolisi nel contesto del RV è stimato dai vantaggi: completa assenza di emolisi ++++ o 4+ (RV nettamente positivo); emolisi appena iniziata +++ o 3+ (PB positivo); emolisi significativa ++ o 2+ (PB debolmente positivo); quadro incomprensibile dell'emolisi ± (RV dubbio); emolisi completa - (la reazione di Wassermann è negativa).
Oltre alla valutazione qualitativa del RV, esiste una formulazione quantitativa con varie diluizioni del siero (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Il titolo delle reagine è determinato dalla diluizione massima, che dà comunque un risultato nettamente positivo (4+). La formulazione quantitativa del RV è importante nella diagnosi di alcune forme cliniche di infezione sifilitica, nonché nel monitoraggio dell'efficacia del trattamento. Attualmente, la reazione di Wasserman viene messa in scena con due antigeni (cardiolipina e ceppo di Reiter con suono treponemico). Di norma, il RV diventa positivo 5-6 settimane dopo l'infezione nel 25-60% dei pazienti, 7-8 settimane nel 75-96%, 9-19 settimane nel 100%, anche se negli ultimi anni a volte prima o più tardi. Allo stesso tempo, il titolo delle reagine aumenta gradualmente e raggiunge un valore massimo (1:160-1:320 e oltre) in caso di comparsa di eruzioni cutanee generalizzate (sifilide fresca secondaria). Quando RV è positivo, viene fatta una diagnosi di sifilide sieropositiva primaria.
Con secondario fresco e sifilide ricorrente secondaria, il RV è positivo nel 100% dei pazienti, ma un risultato negativo può essere osservato nei pazienti malnutriti immunocompromessi. Successivamente, il titolo delle reagine diminuisce gradualmente e nella sifilide secondaria ricorrente di solito non supera 1:80-1:120.
Con la sifilide terziaria Il RV è positivo nel 65-70% dei pazienti e solitamente si osserva un basso titolo di reagine (1:20-1:40). Nelle forme tardive di sifilide (sifilide degli organi interni, sistema nervoso), si osserva un RV positivo nel 50-80% dei casi. Il titolo della reazione varia da 1:5 a 1:320.
Con la sifilide latente RV positivo si osserva nel 100% dei pazienti. Il titolo della reazione va da 1:80 a 1:640 e con la sifilide latente tardiva da 1:10 a 1:20. Una rapida diminuzione del titolo delle reazioni (fino alla completa negatività) durante il trattamento indica l'efficacia del trattamento.
Svantaggi della reazione Wassermann- sensibilità insufficiente (negativa nella fase iniziale della sifilide primaria). Risulta negativo anche in 1/3 dei pazienti, se trattati in passato con antibiotici, nei pazienti con sifilide terziaria attiva con lesioni della pelle e delle mucose, dell'apparato osteoarticolare, degli organi interni, del sistema nervoso centrale, con sifilide congenita tardiva .
Mancanza di specificità- La reazione di Wasserman può essere positiva in persone che non si sono mai ammalate in precedenza e non soffrono di sifilide. In particolare, si osservano risultati RV falsi positivi (non specifici) in pazienti che soffrono di lupus eritematoso sistemico, lebbra, malaria, neoplasie maligne, danni epatici, infarti miocardici estesi e altre malattie, e talvolta in persone completamente sane.
Viene rilevata una reazione Wasserman falsa positiva a breve termine in alcune donne prima o dopo il parto, nelle persone che abusano di farmaci, dopo l'anestesia, l'assunzione di alcol. Di norma, il RV falso positivo è debolmente espresso, spesso con un titolo basso di reagine (1:5-1:20), positivo (3+) o debolmente positivo (2+). Con gli esami sierologici di massa, la frequenza dei risultati falsi positivi è dello 0,1-0,15%. Per sopperire alla mancanza di sensibilità si utilizza la fissazione al freddo (reazione di Collard) e contemporaneamente la si fissa con altre reazioni sierologiche.
Reazioni sedimentarie di Kahn e Sachs-Vitebsky
La reazione Wasserman viene utilizzata in combinazione con due reazioni sedimentarie (Kahn e Zaks-Vitebsky), durante la cui produzione vengono preparati antigeni più concentrati. Metodo Express (microreazione su vetro) - si riferisce alle reazioni lipidiche e si basa su una reazione di precipitazione. Viene posto con uno specifico antigene cardiolipina, 1 goccia del quale viene miscelata con 2-3 gocce del siero sanguigno studiato nei pozzetti di una speciale lastra di vetro.Vantaggio- la velocità con cui si ottiene una risposta (in 30-40 minuti). I risultati vengono valutati in base alla quantità di precipitato e alla dimensione dei fiocchi. La gravità è definita come CSR: 4+, 3+, 2+ e negativa. Va notato che i risultati falsi positivi si osservano più spesso che con RV. Di norma, il metodo espresso viene utilizzato per esami di massa per la sifilide, durante gli esami nei laboratori diagnostici clinici, nei reparti somatici e negli ospedali. Sulla base dei risultati del metodo express, la diagnosi di sifilide è vietata, è escluso il suo uso nelle donne in gravidanza, nei donatori e anche per il controllo dopo il trattamento.
Reazione di immobilizzazione del Treponema pallido (RIBT)
Reazione di immobilizzazione del Treponema pallido (RIBT)- proposto nel 1949 da R.W.Nelson e M.Mayer. È il test diagnostico più specifico per la sifilide. Tuttavia, la complessità e l’alto costo dell’impostazione ne limitano l’applicazione. Nel siero del sangue dei pazienti vengono determinati anticorpi video-specifici (immobilisine), che portano all'immobilità dei treponemi pallidi in presenza di complemento. L'antigene è il treponema pallidum patogeno vivo isolato da conigli infetti da sifilide. Con l'aiuto di un microscopio si conta il numero di treponemi pallidi immobilizzati (immobilizzati) e si valutano i risultati del RIBT: l'immobilizzazione dei treponemi pallidi dal 51 al 100% è positiva; dal 31 al 50% - debolmente positivo; dal 21 al 30% - dubbio; dallo 0 al 20% - negativo.Il RIBT è importante nella diagnosi differenziale per distinguere le reazioni sierologiche false positive dalle reazioni dovute alla sifilide. Diventa positivo più tardi di RV, RIF e quindi non viene utilizzato per diagnosticare forme infettive di sifilide, sebbene nel periodo secondario della sifilide sia positivo nell'85-100% dei pazienti.
Nel periodo terziario della sifilide con danni agli organi interni, al sistema muscolo-scheletrico e al sistema nervoso, il RIBT è positivo nel 98-100% dei casi ( Il RV è spesso negativo).
Va ricordato che il RIBT può risultare falso positivo se nel siero in esame sono presenti farmaci treponemocidi (penicillina, tetraciclina, macroliti, ecc.) che causano l'immobilizzazione aspecifica del treponema pallido. A questo scopo, il sangue per RIBT viene esaminato non prima di 2 settimane dopo la fine dell'assunzione di antibiotici e altri farmaci.
RIBT, come RIF, diventa lentamente negativo durante il trattamento, quindi non viene utilizzato come controllo durante il trattamento.
Reazione di immunofluorescenza (RIF)
Reazione di immunofluorescenza (RIF)- sviluppato nel 1954 da A.Coons e utilizzato per la prima volta per diagnosticare l'infezione sifilitica da Deacon, Falcone, Harris nel 1957. Il RIF si basa su un metodo indiretto per la determinazione degli anticorpi fluorescenti. L'antigene per la stadiazione è costituito da treponemi pallidi tissutali fissati su vetrini su cui viene applicato il siero del test. Se il siero in esame contiene anticorpi anti-treponema correlati a IgM e IgG, questi si legano fortemente all'antigene - treponema, che viene rilevato al microscopio a fluorescenza utilizzando siero fluorescente anti-specie ("anti-umano").Risultati RIF vengono presi in considerazione dall'intensità del bagliore del treponema pallido nella preparazione (bagliore giallo-verde). In assenza di anticorpi anti-treponema nel siero, non vengono rilevati treponemi pallidi. In presenza di anticorpi, viene rilevato il bagliore del treponema pallido, il cui grado è espresso in vantaggi: 0 e 1+ - una reazione negativa; da 2+ a 4+ - positivo.
RIF si riferisce a reazioni treponemiche di gruppo e viene posto in una diluizione del siero in esame da 10 a 200 volte (RIF-10 e RIF-200). RIF-10 è considerato più sensibile, ma i risultati positivi non specifici spesso cadono rispetto a RIF-200 (ha una specificità più elevata). Generalmente, RIF diventa positivo prima di RW- positivo nella sifilide primaria sieronegativa nell'80% dei pazienti, nel 100% nel periodo secondario della sifilide, sempre positivo nella sifilide latente e nel 95-100% dei casi nelle forme tardive e nella sifilide congenita.
Specificità del RIF aumenta dopo il pretrattamento del siero in esame con un antigene treponemico assorbente-ultrasonico che lega gli anticorpi del gruppo (RIF - abs).
Indicazioni per la stadiazione di RIBT e RIF- diagnosi di sifilide latente per confermare la specificità del complesso di reazioni lipidiche in caso di infezione sifilitica sulla base di un RV positivo. RIBT e RIF positivi sono la prova di sifilide latente. Con RV falso positivo in varie malattie (lupus eritematoso sistemico, neoplasie maligne, ecc.) e se i risultati ripetuti di RIBT e RIF sono negativi, ciò indica la natura aspecifica del RV. Sospetto di lesioni sifilitiche tardive degli organi interni, del sistema muscolo-scheletrico, del sistema nervoso in presenza di RV negativo nei pazienti. Sospetto di sifilide sieronegativa primaria, quando in pazienti con esami ripetuti di secrezione erosiva dalla superficie (ulcera), con puntura da linfonodi regionali ingrossati, non viene rilevato treponema pallido - in questo caso viene posizionato solo RIF - 10.
Quando si esaminano individui con un RV negativo che hanno avuto contatti sessuali e domestici prolungati con pazienti affetti da sifilide, data la probabile possibilità di trattarli nel recente passato con farmaci antisifilitici che hanno causato RV negativo. Saggio immunoassorbente legato all'enzima (ELISA, ELISA - saggio immunoassorbente legato all'enzima) - il metodo è stato sviluppato da E.Engvall et al., S.Avrames (1971). L'essenza consiste nella combinazione di un antigene sifilitico adsorbito sulla superficie di un portatore in fase solida con un anticorpo del siero sanguigno studiato e nel rilevamento di uno specifico complesso antigene-anticorpo utilizzando siero sanguigno anti-specie marcato con enzima. Ciò consente di valutare visivamente i risultati dell'ELISA in base al grado di variazione del colore del substrato sotto l'azione dell'enzima che fa parte del coniugato. Risultati ELISA inaffidabili possono verificarsi a causa di un'insufficiente diluizione degli ingredienti, violazione dei regimi di temperatura e tempo, incoerenza del pH delle soluzioni, contaminazione della vetreria da laboratorio e tecnica di lavaggio impropria del veicolo.
Reazione di emoagglutinazione passiva (RPHA)
Proposto come test diagnostico per la sifilide T. Rathlev (1965.1967), T. Tomizawa (1966). La macromodificazione della reazione si chiama TRHA, la micromodifica è MHA-TR, la versione automatizzata è AMNA-TR, la reazione con macrocapsule di poliurea al posto degli eritrociti è MSA-TR. La sensibilità e la specificità dell'RPHA sono simili a RIBT, RIF, ma l'RPHA è meno sensibile nelle forme precoci di sifilide rispetto ai RIF-abs e più sensibile nelle forme tardive, con sifilide congenita. RPGA è disponibile in versioni qualitative e quantitative.Tecnica di prelievo del sangue per reazioni sierologiche
Per la ricerca su RV, RIF, RIBT, il sangue viene prelevato dalla vena cubitale a stomaco vuoto o non prima di 4 ore dopo il pasto con una siringa sterile o un ago (per gravità). Nel sito del prelievo, la pelle viene pretrattata con alcol al 70%. La siringa e l'ago devono essere lavati con una soluzione isotonica di cloruro di sodio. 5-7 ml del sangue da analizzare vengono versati in una provetta pulita, asciutta e fredda. Sulla provetta viene incollato un foglio bianco con il cognome del paziente, le iniziali, il numero dell'anamnesi o della scheda ambulatoriale, la data del prelievo di sangue. Dopo il prelievo del sangue, la provetta viene posta in frigorifero con temperatura di +4°+8°C fino al giorno successivo. Il giorno successivo, il siero viene drenato per la ricerca. Se il sangue non viene utilizzato il giorno successivo, il siero deve essere drenato dal coagulo e conservato in frigorifero per non più di 1 settimana. Per la ricerca sul RIBT, la provetta deve essere appositamente preparata e sterile. In caso di violazione delle regole per il prelievo di sangue a scopo di ricerca, il mancato rispetto delle condizioni può comportare una distorsione dei risultati.Non è consigliabile prelevare il sangue per la ricerca dopo aver mangiato, alcol, vari farmaci, dopo l'introduzione di vari vaccini, durante il ciclo mestruale nelle donne.
Per la ricerca sul metodo express, il sangue è stato prelevato dal polpastrello, come avviene quando viene prelevato per la VES, ma il sangue viene prelevato da 1 capillare in più. Il metodo express può essere eseguito anche con siero sanguigno ottenuto mediante venipuntura. Se sono necessari esami del sangue in laboratori remoti, è possibile inviare siero secco al posto del sangue (metodo goccia secca). Per fare ciò, il giorno successivo al prelievo del sangue, il siero viene separato dal coagulo e aspirato in una siringa sterile nella quantità di 1 ml. Quindi il siero viene versato sotto forma di 2 cerchi separati su una striscia di carta da lettere spessa (carta oleata o cellophane) di dimensioni 6x8 cm, sul bordo libero sono scritti il cognome, le iniziali del soggetto e la data del prelievo di sangue. la carta. La carta sierica viene protetta dalla luce solare diretta e lasciata a temperatura ambiente fino al giorno successivo. Il siero si asciuga sotto forma di piccoli cerchi di una pellicola vitrea giallastra lucida. Successivamente, le strisce di carta con siero essiccato vengono arrotolate come polvere farmaceutica e inviate al laboratorio, indicando la diagnosi e per quale scopo viene studiato.
Resistenza sierologica
In una parte (2% o più) dei pazienti affetti da sifilide, nonostante la terapia antisifilitica completa, si osserva un rallentamento (assenza) di reazioni sierologiche negative dopo la fine del trattamento fino a 12 mesi o più. Esiste una cosiddetta resistenza sierologica, che negli ultimi anni è stata osservata frequentemente. Esistono forme di resistenza sierologica:- VERO(assoluto, incondizionato) - è necessario effettuare un ulteriore trattamento antisifilitico, combinato con una terapia non specifica per aumentare le forze immunitarie del corpo.
- Parente- dopo il trattamento completo, i treponemi pallidi formano cisti o forme L, che si trovano nel corpo in uno stato di bassa virulenza e, di conseguenza, un trattamento aggiuntivo non modifica gli indicatori delle reazioni sierologiche, in particolare RIF e RIBT.
Pseudoresistenza- dopo il trattamento, nonostante le reazioni sierologiche positive, nel corpo non è presente alcun treponema pallido. Non c'è antigene nel corpo, ma continua la produzione di anticorpi, che vengono fissati quando si instaurano reazioni sierologiche.
La resistenza sierologica può svilupparsi a causa di:
- trattamento inadeguato senza tener conto della durata e dello stadio della malattia;
- dose insufficiente e in particolare a causa della mancata considerazione del peso corporeo dei pazienti;
- violazioni dell'intervallo tra l'introduzione dei farmaci;
- conservazione dei treponemi pallidi nel corpo nonostante il trattamento specifico a tutti gli effetti, a causa della loro resistenza alla penicillina e ad altri farmaci chemioterapici in presenza di lesioni nascoste e incistate negli organi interni, nel sistema nervoso, nei linfonodi, che sono inaccessibili ai farmaci antibatterici (spesso si riscontrano treponemi pallidi nei tessuti della cicatrice molti anni dopo la fine della terapia, nei linfonodi a volte è possibile rilevare treponemi pallidi 3-5 anni dopo la terapia antisifilitica);
- riduzione delle forze protettive in varie malattie e intossicazioni (endocrinopatia, alcolismo, tossicodipendenza, ecc.);
- esaurimento generale (mangiare povero di vitamine, proteine, grassi).
- concomitanti malattie non specifiche degli organi interni, disturbi del sistema cardiovascolare, reumatismi, disfunzioni del sistema endocrino e nervoso, gravi dermatosi croniche, neoplasie maligne;
- lesioni del sistema nervoso (lesioni gravi, commozioni cerebrali, traumi mentali);
- gravidanza intossicazione cronica da alcol, droghe alla nicotina; malattie infettive (malaria, tubercolosi, epatite virale, dissenteria, tifo, febbre tifoide e ricorrente).
La diagnosi di sifilide è un compito estremamente importante per i medici infettivi, poiché non viene effettuato un esame completo dei pazienti per determinare l'entità della prevalenza della malattia. Ciò richiede ingenti costi finanziari e di tempo, inoltre i metodi clinici sono spesso poco informativi. Oggi la medicina dispone di moderni metodi diagnostici. Al momento, nella pratica di laboratorio sono diffusi i cosiddetti test rapidi basati sulla determinazione degli anticorpi sifilitici nel sangue. Questi includono RMP (reazione di microprecipitazione) e RPHA (reazione di emoagglutinazione passiva).
Reazioni nelle diverse fasi della malattia
Treponema pallidum - l'agente eziologico della sifilide
La sifilide è una malattia a trasmissione sessuale a lungo termine caratterizzata da un decorso graduale e dalla capacità di colpire assolutamente tutti gli organi e tessuti umani. L'agente eziologico è il microrganismo Treponema pallidum - treponema pallido.
La fonte dell'infezione è una persona malata.
In base alle modalità di infezione da sifilide (sessuale, contatto domestico, trasfusione di sangue, trapianto e transplacentare), possono essere prescritti test rapidi:
- dopo un contatto sessuale casuale con un partner non esaminato;
- se il medico curante viene a conoscenza del contagio di un membro della famiglia, il partner sessuale della persona esaminata;
- se il paziente ha recentemente ricevuto trasfusioni di sangue intero o trapianti di organi;
- in caso di rilevamento dell'agente eziologico della malattia nella madre che ha partorito.
Secondo i principi d'azione su cui si basano le reazioni di emoagglutinazione passiva e microprecipitazione, un determinato test sarà efficace in ogni fase del decorso della sifilide.
| Palcoscenico | Descrizione | Immagine |
| Primario | Il principale criterio diagnostico è la presenza di un duro ciclo. È una sorta di indicatore che consente di determinare la porta d'ingresso dell'infezione. Nel caso in cui si verifica nella zona genitale, si dovrebbe giudicare la via sessuale di penetrazione dell'agente patogeno nel corpo umano. Se sul bordo rosso delle labbra appare un'ulcera dura, significa che c'è stato un contatto tra una persona sana e una persona infetta. La formazione è un focolaio infiammatorio (erosione o ulcera) indolore alla palpazione, situato su una base densa. I cambiamenti duri contengono un gran numero di treponemi pallidi. 3-5 settimane dopo, nel siero del sangue compaiono anticorpi - composti del plasma sanguigno di natura proteica che impediscono la riproduzione dei microrganismi. È sulla determinazione di anticorpi specifici contro la sifilide nel siero del sangue che viene costruita la maggior parte dei metodi diagnostici espressi. La definizione della malattia nella fase primaria di sviluppo viene effettuata utilizzando la reazione di microprecipitazione |
Duro chancre sulla lingua, che indica la penetrazione dell'agente patogeno attraverso un bacio - una via di trasmissione domestica |
| Secondario | È caratterizzata dall'aspetto della "collana di Venere", un'eruzione cutanea pallida e maculata che si verifica a seguito di una lesione generalizzata della pelle e delle mucose. È possibile la caduta locale dei capelli, fino alla calvizie. In questa fase della malattia, i pazienti lamentano spesso un lieve malessere, febbre fino a 37,7 ° C, debolezza, naso che cola, tosse o congiuntivite. Molto spesso non esiste una "collana di Venere" e la sifilide secondaria praticamente non si manifesta in alcun modo, contribuendo alla transizione allo stadio cronico successivo. Positive anche le reazioni sierologiche. Per determinare la malattia in questa fase, vengono utilizzati sia RMP che RPHA. |
"Collana di Venere" |
| Terziario | È la fase più grave, soggetta a ricadute con un decorso prolungato nel corso di molti anni. Questo periodo è caratterizzato dallo sviluppo delle gengive: granulomi sifilitici, soggetti a necrosi e cicatrici grossolane. Le gomme possono formarsi in qualsiasi tessuto e organo, compresi quelli interni. I treponemi non vengono sempre rilevati: i test sierologici sono positivi in circa il 70% dei casi. La risposta più univoca sulla presenza di anticorpi è data dal test di emoagglutinazione diretta. |
|
Esame del sangue per la sifilide - reazione di Wasserman
RPGA
Il test di emoagglutinazione passiva è uno dei metodi sierologici più specifici e sensibili per la diagnosi della sifilide.
Valutazione del risultato di RPHA
Le principali caratteristiche e peculiarità dell'RPGA sono riportate nella tabella.
| Caratteristica | Descrizione |
| Materiale di ricerca | Campione di sangue venoso |
| Meccanismo di azione | La reazione di emoagglutinazione indiretta si sviluppa se gli eritrociti - globuli rossi, sulla cui superficie si trovano gli antigeni del treponema pallido, si uniscono al contatto con il siero del sangue di una persona infetta da sifilide |
| Efficienza | Gli studi hanno dimostrato che in termini di specificità e sensibilità della reazione all'agente patogeno, questo metodo è uno dei test sierologici più accurati. |
| Quando il siero con anticorpi contro il treponema viene aggiunto al materiale biologico studiato, si osserva l'agglutinazione (incollaggio) degli eritrociti precipitati sotto forma di un ombrello. La concentrazione degli anticorpi sierici influisce anche sul numero di eritrociti agglutinati. Una reazione positiva al TPHA indica la presenza di Treponema pallidum nel sangue del soggetto | |
| Indicazioni per lo studio | Il medico curante prescrive un esame del sangue per RPHA nei seguenti casi:
|
| Sensibilità |
|
| Specificità | L'elevata specificità (98-100%) consente di prescrivere un'analisi per confermare la sifilide in caso di reazione positiva di microprecipitazione o altri esami simili |
| Risultati falsi | La frequenza dei risultati falsi positivi è relativamente bassa e, secondo vari ricercatori, è di circa lo 0,05-2,5%. Il verificarsi di risultati falsi positivi in persone che non sono infette da sifilide è associato ai seguenti fattori:
|
| Risultato negativo | Può essere ottenuto se:
|
Se una persona è stata malata di sifilide almeno una volta, la reazione dell'RPGA rimarrà positiva per tutta la sua vita.
Per evitare risultati falsi positivi, è necessario attenersi alle seguenti raccomandazioni durante la preparazione all'analisi:
- il campionamento del materiale viene effettuato rigorosamente a stomaco vuoto;
- il giorno della donazione del sangue è consentito bere acqua minerale non gassata in quantità minima;
- prima di effettuare l'analisi per diverse ore, smettere di fumare ed escludere completamente l'assunzione di bevande alcoliche;
- se il paziente sta assumendo farmaci dovrà comunicarlo al proprio medico.
Dopo aver ricevuto un risultato positivo, è indicato un esame immediato dei familiari e dei partner sessuali delle persone infette per prevenire un'ulteriore diffusione dell'infezione.
RMP
Reazione di microprecipitazione (RMP) di varia intensità
Utilizzando un test chiamato reazione di microprecipitazione (RMP), uno specialista determina gli anticorpi che si formano nella fase della sifilide primaria. Il titolo di anticorpi contro l'infezione viene rilevato nel sangue del paziente già 7-10 giorni dopo l'inizio del duro cancro.
Le caratteristiche e gli aspetti dell'RMP sono riportati in tabella.
| Criterio | Descrizione |
| Materiale per l'esame | Siero sanguigno, raschiature dalle superfici di ulcere ed erosioni, liquido dai linfonodi |
| Sensibilità | Oscilla nell'intervallo 80-95%, dipende anche dallo stadio della malattia |
| Decifrazione e risultato positivo | Al campione di sangue da analizzare viene aggiunto un antigene, una cardiolipina fosfolipidica ottenuta da un cuore bovino. Gli anticorpi non specifici della sifilide formano una reazione con i lipidi. Un risultato positivo indica la presenza di Treponema Pallidum o agenti patogeni simili nel materiale del test. L'intensità della reazione (da 1 a 4) indica il grado di infezione |
| Efficienza | Il vantaggio del metodo RMP è che consente di diagnosticare la sifilide nella fase iniziale dell'infezione. |
| Indicazioni per l'appuntamento dello studio | L’analisi viene effettuata nei seguenti casi:
|
| Risultato falso positivo | Il verificarsi di risultati falsi positivi è possibile nei seguenti casi:
|
| Risultato negativo | Indica l'assenza della malattia, oppure è possibile nei primi giorni, quando non è ancora presente il titolo anticorpale |
Esattamente come nel caso dell'RPHA, per escludere risultati falsi positivi, prima di effettuare il test è necessario:
- prima del prelievo di sangue si consiglia di bere acqua rigorosamente non gassata e non zuccherata;
- alla vigilia del test, escludere l'uso di cibi grassi, piccanti e fritti;
- non bere mai alcolici;
- evitare un aumento dello stress fisico ed emotivo;
- in presenza di un farmaco che il paziente è costretto ad assumere in concomitanza con una qualsiasi terapia, è opportuno avvisare il medico che ha inviato per tale esame.
La reazione di microprecipitazione è uno dei primi test prescritti per la diagnosi della malattia. Per ottenere dati più accurati, viene assegnato uno studio simile, ad esempio RPGA.
In ogni caso l'interpretazione delle analisi viene valutata in combinazione con i risultati dell'esame clinico principale.
Test treponemici per la sifilide. Descrizione generale.
Per diagnosticare in modo affidabile la sifilide e identificare gli anticorpi antisifilitici nel corpo del paziente (nel siero del sangue o nel liquido cerebrospinale), vengono utilizzate speciali tecnologie di ricerca di laboratorio: i cosiddetti metodi sierologici.
Quando si eseguono test diagnostici per la sifilide, vengono utilizzate varie reazioni sierologiche: agglutinazione, precipitazione, immunofluorescenza, fissazione del complemento, dosaggio immunoenzimatico, ecc. Tutte queste reazioni sierologiche si basano sull'interazione di antigeni e anticorpi.
Vengono chiamati test sierologici specifici treponemale perché questi test utilizzano il treponema pallidum o i suoi antigeni, cioè antigeni di origine treponemica. Lo scopo dei test treponemici è identificare anticorpi specifici contro le strutture antigeniche dell'agente eziologico della sifilide, cioè anticorpi diretti specificamente contro i batteri T. Pallidum stessi e non contro i tessuti corporei danneggiati dal treponema. Gli anticorpi antitreponemici specifici della classe IgM possono essere rilevati già alla fine della seconda settimana di malattia.
7. Risultati falsi positivi e falsi negativi
Un test PB positivo per la sifilide in persone che non hanno la malattia è chiamato falso positivo. La frequenza dei risultati falsi positivi negli individui sani è dello 0,2-0,25%. Se la percentuale di risultati falsi positivi aspecifici del RV nelle persone sane è molto bassa, in alcune malattie può essere elevata.
Tutti i risultati non specifici delle reazioni sierologiche possono essere suddivisi nei seguenti gruppi principali:
1. Malattie causate dalla presenza di antigeni comuni in agenti patogeni simili (spirochete): febbre ricorrente, framboesia, bejel, pinta, treponema orale, leptospira.
2. Reazioni positive dovute a cambiamenti nel metabolismo dei lipidi e cambiamenti nelle globuline sieriche. Questi includono risultati positivi in donne incinte con gotta, disturbi della composizione lipidica a seguito di avvelenamento con piombo, fosforo, dopo l'assunzione di salicilato di sodio, digitale, ecc. Queste reazioni dovrebbero includere anche reazioni positive in alcune malattie infettive (tifo, malaria, polmonite, lebbra, endocardite, collagenosi, infarto del miocardio, commozione cerebrale, cancro, cirrosi epatica, ecc.)
3. Errori tecnici di condotta. Scelta errata della dose del complemento, mancato rispetto delle condizioni e dei termini di conservazione dei reagenti, esclusione dei campioni di controllo del siero sanguigno dalla reazione, uso di provette e strumenti contaminati.
8. Modifica della reazione di Wassermann
Esistono modifiche della reazione Wasserman in versioni qualitative e quantitative, al freddo, con liquido cerebrospinale.
Modifica del camper al freddo sembrava essere più sensibile. Una caratteristica del metodo di impostazione della reazione Wasserman al freddo sono i regimi di temperatura trifase ai quali procede il legame del complemento. Questa reazione è anche associata alla cardiolipina e all'antigene treponemico.
Oltre alla valutazione qualitativa del RW, esiste un metodo per farlo impostazione quantitativa con varie diluizioni di siero sanguigno (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Il titolo della reazione è determinato dalla diluizione massima, che dà comunque un risultato nettamente positivo (4+). La formulazione quantitativa del RV è importante nella diagnosi di alcune forme di sifilide e nel monitoraggio dell'efficacia della terapia.
9. Campo di applicazione
In Russia, RSKt fa parte del complesso dei test sierologici standard per la sifilide (SSR).
Viene utilizzata la reazione Wasserman con antigene treponemico e cardiolipina (RSKt).
- diagnosi di tutte le forme di sifilide,
- controllo sull’efficacia del trattamento,
- esami di persone che hanno avuto rapporti sessuali con un paziente affetto da sifilide,
- esami di persone con sospetto clinico e anamnestico di sifilide
- durante l'esame preventivo per la sifilide di pazienti in ospedali psichiatrici e neurologici, donatori e donne incinte, comprese le persone indirizzate all'interruzione artificiale della gravidanza.
Attualmente, per ordine del Ministero della Salute della Federazione Russa, si raccomanda di sostituire l'RSKT con metodi treponemici più sensibili (ELISA o RPHA).
All'estero, la reazione Wasserman con antigene treponemico non è stata utilizzata nella pratica clinica di laboratorio da molto tempo e non è inclusa nell'elenco dei test standard raccomandati dall'Organizzazione Mondiale della Sanità.
Complesso di reazioni sierologiche classiche (CSR)
DAC- Questo complesso di reazione utilizzato per la sierodiagnosi della sifilide come metodo standard. Questo complesso di reazioni comprende la reazione Wassermann con l'antigene cardiolipina (un estratto dal cuore di un toro arricchito con lecitina e colesterolo) e l'antigene treponemico (una sospensione di treponemi pallidi culturali apatogeni trattati con ultrasuoni), nonché una reazione di microprecipitazione (RMP ) con plasma o siero inattivato, a cui viene aggiunto l'antigene cardiolipina
La CSR diventa positiva a metà del periodo primario (la sua divisione in sieronegativi e sieropositivi è determinata con precisione dalla CSR), nel periodo secondario la CSR è positiva nel 98-100% dei pazienti e nel periodo terziario - solo nel 60-70 %. Cioè all’aumentare della durata della malattia la positività della CSR diminuisce gradualmente.
Vantaggi del KSR:
1) Economicità, semplicità e velocità di impostazione. Ciò è particolarmente caratteristico della reazione di microprecipitazione: RMP è attualmente il principale metodo di screening (selezione);
2) I test non treponemici sono convenienti da utilizzare per monitorare la guarigione della sifilide.
Svantaggi della CSR:
1) Soggettività della valutazione dei risultati delle reazioni ("a occhio");
2) Bassa sensibilità nelle forme tardive di sifilide;
3) Mancanza di specificità rispetto ai test più moderni. Quando vengono eseguiti, si notano spesso reazioni false positive (LPR).
La LPR può essere dovuta alla reattività crociata tra la spirocheta pallida e altri microbi, a disturbi del metabolismo dei lipidi e delle proteine, all'instabilità della membrana cellulare e alla formazione di autoanticorpi. Le LPR sono note nelle infezioni acute (malaria, mononucleosi infettiva, ecc.) e croniche (tubercolosi, lebbra, epatite, borreliosi, ecc.), infarto del miocardio, cirrosi epatica, collagenosi (soprattutto nel LES), oncopatologia, vaccinazione, uso di farmaci, abuso di alcol e cibi grassi. Un falso positivo può essere una CSR nelle ultime settimane di gravidanza, dopo il parto e in alcune donne durante le mestruazioni. Risultati CSR falsi negativi possono essere associati all’infezione da HIV.
RIT, RIBT - Reazione di immobilizzazione del treponema pallido
Il test di immobilizzazione del Treponema pallidum (TPI; Treponema pallidum immobilization test, TPI) è un metodo classico che serve per rilevare anticorpi treponemici specifici. La reazione RIBT utilizza come antigene il treponema pallidum patogeno T. pallidum (ceppo Nichols) coltivato nei testicoli di coniglio. Il RIBT si basa sulla perdita di mobilità dei treponemi pallidi vivi dopo l'esposizione agli anticorpi del siero sanguigno e del complemento del paziente. I risultati vengono valutati mediante microscopia in campo scuro. Nonostante il fatto che il test RIBT sia stato introdotto nella pratica clinica come test specifico per la sifilide, è laborioso, tecnicamente complesso, dispendioso in termini di tempo e costoso da utilizzare.
1. Storia del metodo RIBT
Il test di immobilizzazione del Treponema pallidum (TPRT) è in realtà il primo test specifico per la diagnosi della sifilide. Questa reazione fu presentata nel 1949 dai ricercatori americani Nelson e Mayer (R. W. Nelson e M. M. Mayer) e discussa in dettaglio in articoli scientifici nei decenni successivi. In precedenza sono stati effettuati tentativi infruttuosi di utilizzare treponemi vivi nei test. Poiché Nelson è riuscito a creare un ambiente in cui i treponemi sono rimasti vitali fino a 8 giorni, la sua ricerca è stata coronata dal successo.
2. Principio del metodo RIBT
Il metodo si basa sul fenomeno della perdita di mobilità da parte di treponemi pallidi in presenza di anticorpi antitreponemici immobilizzanti del siero sanguigno studiato e del complemento in condizioni anaerobiche. L'antigene è il treponema pallido patogeno vivo ottenuto da conigli infettati artificialmente con la sifilide.
3. Impostazione del test RIBT
Il siero del test, il complemento e l'antigene partecipano alla reazione. Al treponema vivo ottenuto dai tessuti del testicolo di un coniglio dopo un'infezione artificiale, aggiungere il siero del sangue del soggetto del test. In presenza di anticorpi anti-treponema-immobilizine nel siero, i treponemi pallidi smettono di muoversi (immobilizzati). Gli anticorpi immobilisina sono anticorpi antitreponemici tardivi.
La reazione viene effettuata con sieri inattivati al calore o con campioni di sieri essiccati su carta cerata (gocce secche). L'inattivazione del siero mediante riscaldamento viene effettuata per 30 minuti ad una temperatura di 56°C. Prima del prelievo di sangue, il soggetto non deve ricevere farmaci, in particolare preparati a base di penicillina. La ricezione dei farmaci viene annullata per il periodo del loro possibile ritardo nel corpo.
Come antigene vengono utilizzati batteri del ceppo Nichols, ottenuti da un'orchite sifilitica di coniglio di 7-10 giorni (infiammazione testicolare). Il periodo dal momento in cui è stata impostata la reazione alla registrazione dei suoi risultati dura 18-20 ore, pertanto è necessario un ambiente di sopravvivenza per mantenere la vitalità e una buona mobilità dei microrganismi.
RIBT utilizza il complemento di cavia. Per ottenere il complemento, il sangue deve essere prelevato in condizioni sterili da diverse cavie.
In caso di contaminazione batterica il complemento viene scartato. Non può essere utilizzato nella reazione di immobilizzazione del complemento conservato del treponema pallido, tk. è tossico per i microrganismi.
Nella reazione di immobilizzazione viene utilizzato un eccesso di complemento. La sua quantità dipende in gran parte dall'ambiente di sopravvivenza del treponema pallido.
Il RIBT viene posto in scatole sterili, precedentemente irradiate con lampada al quarzo battericida per 45-60 minuti. Ogni siero sanguigno viene esaminato in due provette: esperto E controllo. In entrambe le provette, il siero in esame e l'antigene vengono aggiunti nelle quantità richieste. Il complemento attivo viene versato nella provetta e la stessa quantità di siero di sangue di cavia inattivato viene versata nella provetta di controllo. Dopo il riempimento, il contenuto delle provette viene miscelato agitando delicatamente.
Il RIBT procede in condizioni anaerobiche. Le provette con gli ingredienti vengono poste in un microanaerostato, dal quale viene aspirata l'aria atmosferica mediante una pompa a vuoto e da una bombola viene iniettata una miscela di gas (95 parti di azoto e 5 parti di anidride carbonica). Il microanaerostato con provette viene posto in un termostato (35°C) per 18-20 ore.
La valutazione dei risultati del RIBT viene effettuata dopo aver rimosso le provette dal termostato e dal microanaerostato (cioè dopo 18-20 ore di esperienza). Con una pipetta Pasteur, una goccia del contenuto della provetta viene applicata su un vetrino, che viene coperto con un vetrino coprioggetto ed esaminato nel campo scuro di un microscopio (obiettivo 40, oculare 10X). Vengono esaminati diversi campi visivi in diverse parti della preparazione, contando in ciascuno il numero di treponemi pallidi mobili e immobili. Il conteggio inizia con il farmaco dal controllo e poi dalla provetta.
Per l'impostazione della reazione vengono utilizzati 5 studi di controllo: con sieri di sangue ovviamente positivi e negativi, con complemento attivo e inattivato e terreno di sopravvivenza per treponema pallido. In questo esperimento per giudicare il grado di mobilità del treponema pallido viene utilizzato il siero sanguigno di controllo negativo. Siero sanguigno positivo di controllo: per valutare il grado di attività immobilizzante nelle condizioni di questo esperimento. Lo studio del complemento attivo e inattivato e dell'ambiente viene effettuato per determinare il loro effetto sulla mobilità del treponema pallido.
In mancanza di complemento nell'esperimento, gli anticorpi immobilizzanti non mostrano correttamente la loro attività e i treponemi rimangono mobili. Pertanto, dopo l'esperimento, viene effettuata la determinazione del complemento residuo per valutare se la mobilità dei treponemi pallidi nelle provette fosse dovuta alla mancanza di complemento. Per questo viene utilizzato un sistema emolitico: una miscela di una sospensione di eritrociti di montone e siero emolitico diluito conservato in un termostato.
Il complemento residuo viene determinato aggiungendo il sistema emolitico nel volume richiesto a ciascuna provetta. Le provette vengono poste in termostato a 37° per 45 minuti. Nelle provette sperimentali dovrebbe verificarsi l'emolisi degli eritrociti, nelle provette di controllo dovrebbe esserci un ritardo nell'emolisi. L'assenza di emolisi nelle provette indica una quantità insufficiente di complemento, in questi casi è opportuno ripetere lo studio. L'esame ripetuto del siero del sangue non viene eseguito solo se si nota l'immobilizzazione del 100% dei treponemi pallidi.
4. Contabilità dei risultati del RIBT
I treponemi immobilizzati vengono contati al microscopio utilizzando la microscopia a campo scuro. Il ricercatore deve avere la capacità di valutare il movimento dei treponemi. Dovrebbe prestare attenzione all'intensità dei movimenti effettuati dal treponema pallido. In questo batterio non è sempre possibile osservare contrazioni ondulatorie e movimenti di flessione, a volte solo rotatori. Dovresti anche essere in grado di distinguere i movimenti attivi dei treponemi dai movimenti con flusso di liquidi.
Per valutare i risultati della reazione, si calcola la percentuale di immobilizzazione dei treponemi pallidi, ovvero il rapporto tra treponemi mobili e immobili nell'esperimento (con complemento attivo) e nel controllo (con complemento inattivo) secondo la formula:
X \u003d (M - C) × 100 / M
dove M è il numero di treponemi mobili nel controllo; C - il numero di treponemi mobili nell'esperimento; X -% immobilizzazione. Nel lavoro pratico, la percentuale di immobilizzazione viene determinata secondo una tabella precompilata utilizzando la formula sopra.
La reazione di immobilizzazione del treponema pallido è stimata come
- positivo durante l'immobilizzazione 51 - 100% treponem,
- debolmente positivo: 31 - 50% treponemi immobili,
- dubbioso: 21 - 30% treponemi immobili,
- negativo: 0 - 20% treponemi immobili.
La reazione di immobilizzazione del treponema pallido diventa positiva alla fine del periodo primario - l'inizio del periodo secondario della sifilide (dalla 7-8a settimana dal momento dell'infezione e oltre). Allo stesso tempo, RIBT è di scarsa utilità per diagnosticare le fasi iniziali della sifilide, poiché gli anticorpi che immobilizzano il treponema pallido e sono determinati nella reazione compaiono solo 3-6 settimane dopo l'infezione. Gli anticorpi-immobilisine appartengono alla classe delle immunoglobuline IgG. Compaiono nel sangue più tardi delle reagine (anticorpi anticardiolipina), più tardi degli anticorpi fluoresceina (vengono rilevati RIF ed ELISA) e delle precipitine (vengono rilevati RMP).
In futuro, il RIBT rimane positivo. C'è un'elevata sensibilità della reazione nelle forme tardive di sifilide. Con la sifilide secondaria, tardiva, la neurosifilide, la sifilide congenita, un risultato RIBT positivo viene registrato nel 95-100% dei casi. Nella sifilide terziaria, con lesioni specifiche degli organi interni, del sistema nervoso, quando RV è spesso negativo, la RIBT dà risultati positivi nel 98-100% dei casi.
Il RIBT è da tempo riconosciuto come il test più specifico per la sifilide. Secondo la letteratura la specificità del RIBT è del 99%, la sensibilità varia dal 79 al 94%. Secondo TsNIKVI, la sensibilità del RIBT (in totale, per tutti gli stadi della sifilide) è dell'87,7%.
7. Ambito del metodo
L'ambito del RIBT si sta gradualmente restringendo a causa della durata dell'impostazione, dei costi elevati e dell'intensità della manodopera. La RIBT è un'analisi piuttosto complessa e costosa che richiede personale altamente qualificato e la presenza di un vivaio. A questo proposito, l'uso di questo metodo negli ultimi anni è stato notevolmente ridotto. Negli Stati Uniti, questo test è attualmente utilizzato solo nei laboratori di ricerca.
Considerando la complessità e il costo elevato di RIF e RIBT, ha senso utilizzarli per la diagnosi delle forme tardive e latenti di sifilide. Il RIBT mantiene la sua posizione di "arbitro della reazione" nella diagnosi differenziale delle forme precoci latenti di sifilide e dei risultati falsi positivi. Questa reazione può essere utile nella diagnosi della neurosifilide e quando altri test sierologici non sono coerenti.
RIBT diventa positivo molto più tardi di RIF e RV. Pertanto, non viene utilizzato per diagnosticare forme infettive di sifilide.
RIBT, come RIF, si negativizza molto lentamente nel processo di terapia antisifilitica. Di conseguenza, non è adatto per monitorare l’andamento della terapia antisifilitica.
Risultati falsi positivi (FPR) nel RIBT sono rari e sono stati osservati principalmente in una serie di treponematosi (framboesia, pinta, bejel), che non si trovano in Russia, così come nella lebbra, nella sarcoidosi, nel LES, nella tubercolosi, nella cirrosi del il fegato e alcune altre malattie rare di natura non sifilitica. Con l’età dei pazienti, aumenta il numero di risultati falsi positivi del RIBT.
Il RIBT può risultare falso positivo se il siero del test contiene sostanze treponemiche (ad esempio penicilline, tetracicline, eritromicina) che provocano l'immobilizzazione aspecifica del treponema pallido, ciò potrebbe essere dovuto al fatto che il paziente assume antibiotici treponemocidi e pertanto l'esame non viene effettuato nelle persone che hanno ricevuto antibiotici nell’ultimo mese. Il sangue per RIBT può essere esaminato non prima di 2 settimane dopo la fine degli antibiotici e di altri farmaci antisifilitici.
9. Modificazioni della reazione di immobilizzazione dei treponemi pallidi
Oltre alla tecnica microanaerostatica è prevista l'impostazione melange del RIBT secondo N.M. Ovchinnikov. Le condizioni anaerobiche durante la formulazione della reazione vengono create ponendo la miscela reagente in un menger (miscelatore di leucociti), entrambe le estremità del quale sono chiuse con un anello di gomma. La tecnica della reazione melanger consente di rinunciare ad una pompa a vuoto, ad una bombola con una miscela di azoto e anidride carbonica e ad un microanaerostato. In uno studio comparativo su un ampio materiale clinico sono stati ottenuti risultati non inferiori alla tecnica anaerostatica classica.
10. Caratteristiche, vantaggi e svantaggi del RIBT
La RIBT è un metodo diagnostico tecnicamente complesso e costoso. La tecnologia richiede fondi significativi per il mantenimento dei conigli e i test. Questo test che richiede molto tempo è attualmente utilizzato principalmente per scopi scientifici. Nella maggior parte dei paesi stranieri, da quasi 40 anni, il RIBT è stato praticamente utilizzato non per scopi diagnostici, ma solo per lavori di ricerca.
Svantaggi della reazione:
- Il RIBT richiede il lavoro con il treponema pallidum patogeno vivo del ceppo Nichols, che rimane infettivo per l'uomo nonostante l'adattamento ai conigli
- la reazione è complessa, lunga e costosa
- è necessario un vivaio
- è necessario personale altamente qualificato per impostare la reazione, registrare i risultati e mantenere il vivario
- soggettività della valutazione dei risultati
- mancanza di automazione
- non c’è modo di standardizzare questo metodo sierologico.
- la reazione non è applicabile nel contesto della terapia antisifilitica in corso
- incapacità di utilizzare per controllare la cura. Il RIBT nei pazienti affetti da sifilide può rimanere positivo per molti anni (e anche per tutta la vita), nonostante il trattamento completo ricevuto.
- la reazione può dare risultati falsi positivi in pazienti affetti da tumori maligni, diabete, lebbra, malattie autoimmuni, polmonite, grave patologia cardiovascolare.
I vantaggi del RIBT sono:
1) Sensibilità sufficientemente elevata;
2) Alta specificità.
RIF (reazione di immunofluorescenza)
La reazione di immunofluorescenza (RIF) è un metodo diagnostico rapido per rilevare antigeni microbici o rilevare anticorpi. I test basati sulla rilevazione di un segnale fluorescente sono considerati tra i migliori test per la sifilide.
1. Storia del metodo
L'anticorpo treponemico fluorescente (FTA) è stato sviluppato per la prima volta nel 1957 da Deacon e colleghi (Deacon, Falcone e Harris).
2. Il principio del metodo
Il metodo RIF si basa sul fatto che gli antigeni tissutali o i microbi trattati con sieri immunitari con anticorpi marcati con fluorocromi possono brillare ai raggi UV di un microscopio a fluorescenza. I batteri in uno striscio, trattati con un siero così luminescente, brillano lungo la periferia della cellula sotto forma di un bordo verde
Come antigene nel RIF, viene utilizzata una sospensione di treponemi pallidi patogeni vivi del ceppo Nichols dell'orchite di coniglio, che viene essiccata su un vetrino e fissata con acetone. Il siero sanguigno del paziente viene aggiunto ai treponemi pallidi essiccati e fissati con acetone sul vetro.
Dopo il lavaggio, il preparato viene trattato con siero contenente anticorpi contro immunoglobuline umane marcate con fluoresceina. Ancora una volta, la preparazione viene lavata e osservata al microscopio a fluorescenza. Se il siero in esame contiene anticorpi anti-fluoresceina treponema, si noterà un bagliore giallo-verde di treponemi.
3. Il metodo di conduzione della ricerca secondo il metodo RIF
L'antigene fissato sul vetrino (treponema pallidum patogeno) viene processato dal siero del test. Dopo il lavaggio, la preparazione viene trattata con siero immunoglobulinico antiumano fluorescente marcato con fluorocromo. In questo caso, il complesso fluorescente risultante (globulina antiumana + tioisocianato di fluoresceina) si lega alla globulina umana sulla superficie del treponema pallido, fornendo un bagliore del treponema pallido al microscopio a fluorescenza.
Per rilevare i complessi antigene-anticorpo, viene utilizzato il siero luminescente, che rappresenta le immunoglobuline anti-specie (anti-umane) coniugate con FITC. La presenza di anticorpi contro i treponemi nel siero è determinata dal bagliore dei treponemi quando esaminati al microscopio a fluorescenza. Il test viene effettuato in versione qualitativa e semiquantitativa.
4. Contabilità dei risultati
La visualizzazione dei risultati RIF viene effettuata utilizzando un microscopio a fluorescenza. I risultati vengono valutati in base al grado di luminescenza dei treponemi presenti nella preparazione. In presenza di anticorpi, il bagliore dei treponemi è visibile, ma se nel siero non erano presenti anticorpi antitreponemi, i treponemi non sono visibili. Il grado di luminescenza del treponema pallido essiccato fissato al vetro è indicato in “più” (da “–” a “++++”). Risultato negativo - nessun bagliore o livello di sfondo - 1+.
5. In quali periodi della malattia è meglio usare
La reazione di immunofluorescenza (RIF) è abbastanza sensibile in tutte le fasi dell'infezione, dalla fine del periodo di incubazione alla sifilide tardiva. Il periodo primario della sifilide nel decorso classico inizia 3-4 settimane dopo l'infezione. Il RIF diventa positivo nei primi giorni del ciclo primario o anche alla fine del periodo di incubazione, a partire dalla 3a settimana dopo l'infezione. I risultati del RIF rimangono positivi in tutti i periodi, anche nelle forme tardive.
RIF diventa positivo un po’ prima di RW. Secondo alcuni rapporti, il RIF positivo si verifica nell'80% dei pazienti con sifilide sieronegativa primaria. Nel periodo secondario il RIF è positivo in quasi il 100% dei casi. È sempre positivo nella sifilide latente e dà risultati positivi al 95-100% nelle forme tardive della malattia e nella sifilide congenita.
6. Sensibilità e specificità
La reazione di immunofluorescenza (RIF) è un gruppo di metodi con elevata sensibilità e specificità. Il RIF è sensibile a tutte le fasi dell'infezione, dal periodo di incubazione alla sifilide tardiva. Secondo l'OMS, la sensibilità del RIF nella sifilide primaria è del 70-100%, nella sifilide secondaria e tardiva - 96-100%, la specificità - 94-100%. Secondo TsNIKVI, la sensibilità del RIF in tutte le forme di sifilide è del 99,1%.
La specificità del RIF può essere aumentata pretrattando il siero del test con un antigene treponemico assorbente - ultrasonificato che lega gli anticorpi del gruppo (RIF-abs).
7. Ambito del metodo
Il RIF si applica:
- come reazione di conferma nella sifilide precoce e latente
- per la diagnosi retrospettiva
- per differenziazione delle forme latenti di sifilide e risultati falsi positivi di ricerche su sifilide.
- come test di conferma per la neurosifilide.
Il RIF è ampiamente utilizzato come test di conferma, ma non è destinato all'uso di routine o allo screening perché è tecnicamente difficile da impostare. Per eseguire la RIF è necessario disporre di un vivaio o acquistare una sospensione di treponemi pallidi patogeni, che limita la possibilità di reazione. Tuttavia, negli ultimi anni, sul mercato interno hanno cominciato ad apparire sistemi di test che consentono di effettuare la reazione in assenza di un vivaio e di un proprio ceppo di laboratorio di treponema pallidum patogeno.
8. Fonti e cause degli errori di stadiazione, falsi positivi e falsi negativi
LPR quando si imposta RIF è raro (con collagenosi, borreliosi).
Il RIF è ancora considerato uno dei migliori test per la sifilide, il “gold standard” della sierodiagnosi. RIF rispetto a RIBT è più facile da impostare,
Nonostante l’alto valore diagnostico, la necessità di utilizzare T. pallidum vivo, l’alto costo e la durata dello studio ostacolano l’introduzione diffusa del RIF nella pratica quotidiana. L'impostazione della reazione è laboriosa. Inoltre, la valutazione dei risultati del RIF è soggettiva.
I vantaggi del RIF e RIBT sono:
1) Alta sensibilità (soprattutto per RIF);
2) Elevata specificità (specialmente per RIBT).
Svantaggi del RIF e RIBT:
1) Complessità tecnica, costo elevato dei metodi.
2) Soggettività della valutazione dei risultati, mancanza di automazione;
3) RIF e RIBT nei pazienti con sifilide possono rimanere positivi per molti anni (e anche per tutta la vita), nonostante il trattamento completo ricevuto. Pertanto, queste reazioni non possono essere utilizzate per controllare la cura.
10. Modifiche al metodo
In pratica, per la sierodiagnosi della sifilide vengono utilizzate e sono state utilizzate diverse modifiche della reazione di immunofluorescenza:
- RIF-abs- il metodo più sensibile per la sierodiagnosi della sifilide, diventa positivo prima di altre reazioni (dalla 3a settimana dall'infezione);
- RIF-200(il siero del paziente viene diluito 200 volte alla presentazione) è un metodo altamente specifico per la sierodiagnosi della sifilide.
- RIF-10(diluizione 10 volte del siero del test) - un metodo più sensibile del RIF-200.
- RIF-ts effettuato con liquore.
- RIF-abs-IgM- rilevazione degli anticorpi antitreponemici precoci della classe IgM.
1. La modifica più diffusa RIF-abs- reazione di immunofluorescenza con assorbimento. Prima di impostare la reazione, il siero del soggetto viene depleto con una miscela di treponemi non patogeni per escludere reazioni crociate. Gli anticorpi del gruppo vengono rimossi dal siero studiato utilizzando treponemi culturali distrutti dagli ultrasuoni, che aumentano significativamente la specificità della reazione. Poiché il siero del test viene utilizzato in una diluizione 1:5, RIF-abs è altamente sensibile.
Le principali indicazioni per l’utilizzo dei RIF-abs nella pratica clinica sono:
- diagnosi di forme latenti e tardive di sifilide,
- rilevamento di risultati falsi positivi di CSR e RMP, soprattutto in pazienti in gravidanza e somatici con sospetta sifilide,
- per stabilire una diagnosi retrospettiva della malattia.
Il RIF-abs non è molto informativo nel valutare i risultati del trattamento: nell'85% dei pazienti che hanno ricevuto un'adeguata terapia antisifilitica, i risultati positivi del RIF persistono per molti anni.
Questa reazione è chiamata il "gold standard" per la sierodiagnosi della sifilide. Viene utilizzato per i casi arbitrali, ma per un risultato affidabile è necessaria una sospensione fresca concentrata di T. pallidum ceppo Nichols da orchite di 7 giorni in un coniglio, che non deve essere congelata.
2. In URSS è stato installato in due versioni: RIF-10 E RIF-200, cioè con una diluizione del siero in esame di 10 e 200 volte. RIF-200: il siero del test viene diluito 200 volte per ridurre il numero di risultati falsi positivi. Ciò fornisce un'elevata specificità della reazione, ma la sua sensibilità diminuisce leggermente. RIF-10 è più sensibile, ma dà più spesso risultati positivi non specifici, rispetto a RIF-200, che è caratterizzato da un'elevata specificità. RIF-10 è più sensibile, RIF-200 e RIF-abs sono più specifici.
La sensibilità di RIF-200 e RIF-abs è stimata tra l'84 e il 99% e la specificità è tra il 97 e il 99%.
3. RIF-ts effettuato con liquore. La reazione viene impostata utilizzando l'intero liquido cerebrospinale per identificare lesioni specifiche del sistema nervoso centrale.
4. Reazione RIF-abs-IgM proposto per la rilevazione degli anticorpi antitreponemici precoci della classe IgM. Questa reazione può essere utilizzata per diagnosticare la sifilide congenita, le forme precoci di sifilide e per distinguere tra casi di reinfezione e sierorecidiva.
Sono note due modifiche di questa reazione:
– FTA-ABS-IgM, basato sull'uso di un coniugato anti-IgM (anticorpi anti-IgM umani marcati con fluoresceina) nella seconda fase della reazione al posto della globulina fluorescente anti-umana;
- la versione russa di RIF-abs-IgM, caratterizzata dal fatto che un assorbente viene aggiunto al siero del sangue in esame, rimuovendo gli anticorpi IgG, e RIF-abs viene posto con i rimanenti anticorpi IgM.
Principali indicazioni alla formulazione di RIF-abs-IgM sono:
- sierodiagnosi della sifilide congenita in assenza di manifestazioni manifeste di sifilide congenita sulla pelle e sulle mucose del bambino;
- diagnosi differenziale di reinfezione e recidiva clinico-sierologica o sierologica della sifilide, in cui RIF-abs-IgM sarà negativo e RIF-abs - positivo;
- valutazione dell'efficacia della terapia per la sifilide acquisita precoce o congenita: dopo adeguato trattamento, RIF-abs-IgM diventa negativo entro i successivi 3-6 mesi.
Questa reazione può essere utilizzata per rilevare la sifilide congenita. È noto che le grandi molecole IgM non possono passare attraverso una placenta sana. Pertanto, gli anticorpi di classe M contro il treponema pallidum possono comparire nel corpo del bambino a causa di una violazione della funzione barriera della placenta, oppure sono prodotti dal corpo di un bambino affetto da sifilide. Gli anticorpi della classe IgM compaiono nel sangue di un paziente affetto da sifilide già nelle prime settimane della malattia e gli anticorpi della classe IgG compaiono più tardi. La determinazione separata degli anticorpi di entrambe le classi è estremamente utile nella diagnosi della sifilide congenita nei bambini, poiché la presenza di anticorpi della classe IgM in un bambino nel primo mese di vita indicherà che sono formati dal corpo di un bambino affetto da sifilide, mentre la rilevazione dei soli anticorpi IgG indicherà l'origine materna di questi ultimi.
Dichiarazione della reazione 19S(IgM)-RIF-ass comporta la separazione preliminare mediante filtrazione su gel delle molecole IgM 19S più grandi da
frazioni di molecole IgG 7S più piccole. Ulteriori studi sulla reazione RIF-abs del siero sanguigno contenente solo la frazione IgM 19S,
elimina tutte le possibili fonti di errore. Ma la tecnica per impostare questa reazione è complessa e richiede tempo, richiede attrezzature speciali e la formazione di specialisti.
Reazione di adesione immunitaria (RIP, TPIA - Treponema pallida immunoadesione).
Questa reazione si basa sull'utilizzo di un fenomeno descritto da Rieckenberg nel 1912. Il RIP si basa sul fatto che i treponemi tissutali virulenti, sensibilizzati dal siero di un paziente affetto da sifilide, aderiscono alla superficie degli eritrociti in presenza di complemento ed eritrociti e, durante la centrifugazione, vengono portati via con essi nel sedimento, scomparendo da il surnatante.
Per impostare la reazione vengono utilizzati i seguenti ingredienti: siero del test, antigene, complemento, eritrociti del donatore, soluzione isotonica di cloruro di sodio. Come antigene viene utilizzata una sospensione di treponema pallido del ceppo Nichols.
Soprattutto in relazione alla sierodiagnosi della sifilide, questo test è stato studiato da autori nazionali e stranieri negli anni '50 e '60. I dati sul valore del RIP come test diagnostico sono contrastanti. La reazione richiedeva la massima precisione, poiché con il versamento impreciso degli ingredienti, con un eccesso o una carenza del materiale di prova nella preparazione, si ottenevano risultati inaffidabili.
In Russia, ricerche approfondite sono state condotte da L.V. Sazonova, che ha ottenuto risultati simili in RIP e RIT utilizzando una sospensione appena preparata di treponemi pallidi patogeni del ceppo Nichols. Tuttavia, l'uso di un antigene riscaldato o conservato con fenolo distorceva drasticamente i risultati della reazione e rendeva l'antigene instabile. Consiglia questo test per sostituire il RIT L.V. Sazonova lo considerava impossibile.
G.P. Avdeeva, utilizzando altri regimi di temperatura e tempo nella preparazione dell'antigene, ha ottenuto risultati diversi nello studio della RIP. Secondo lei, la sensibilità di questa reazione è superiore alla sensibilità di KCP e RIT, ma leggermente inferiore a RIF, e la specificità di RIP, RIT e RIF è vicina.
Tuttavia, la mancata produzione dell'antigene per la RIP non ha consentito uno studio più ampio di questo test e la sua introduzione nella pratica.
Reazione RPHA di emoagglutinazione passiva
Reazione di emoagglutinazione passiva (RPHA)è un test sierologico comune saldamente radicato nella pratica di laboratorio. ha un livello abbastanza elevato di efficienza nello studio.
1. Storia del metodo RPGA
Per la prima volta G.Blumental e W.Bachman (1932) riferirono sull'uso dell'RPGA per la diagnosi della sifilide. Nel 1965 fu proposto un test di emoagglutinazione indiretta o passiva per la diagnosi della sifilide. La modificazione della reazione utilizzando vari antigeni è stata segnalata da T. Ratlev nel 1965-1967. La micromodifica dell'RPGA è stata proposta da Sokh R.M. e coautori nel 1969. Il primo sistema di test commerciale è stato sviluppato dagli scienziati giapponesi Tomisava et. al. nel 1969
2. Principio del metodo RPGA
Da una sospensione omogenea preparata di eritrociti "caricati" con antigeni, quando viene aggiunto il siero in esame contenente anticorpi, precipita un precipitato sotto forma di scaglie. Il precipitato risultante è costituito da eritrociti "incollati" da anticorpi e viene chiamato "emoagglutinato". Una sospensione di eritrociti viene preparata in anticipo e fornita come parte dei sistemi di test diagnostici.
Il processo di incollaggio dei globuli rossi, sulla cui superficie sono presenti gli antigeni, è chiamato "emoagglutinazione". Il legame avviene sotto l'azione di anticorpi specifici (agglutinine). La reazione viene chiamata "passivo", Perché i propri antigeni degli eritrociti non reagiscono e gli eritrociti stessi svolgono una funzione di indicatore esclusivamente ausiliaria.
La reazione di emoagglutinazione passiva (indiretta) è un tipo di reazione di agglutinazione in cui come trasportatori di antigeni vengono utilizzati gli eritrociti (dal greco háima - sangue) e non altre particelle. In generale, nella reazione di agglutinazione sotto l'azione di anticorpi, microbi o altre cellule si uniscono e precipitano - non necessariamente eritrociti, ma, ad esempio, particelle di lattice, batteri o altre particelle corpuscolari che trasportano l'antigene.
Nella reazione di emoagglutinazione passiva per la diagnosi della sifilide, come antigene vengono utilizzati eritrociti di montone o di uccello rivestiti con antigeni di treponema pallido. Quando viene aggiunto siero contenente anticorpi specifici, gli eritrociti si uniscono (agglutinazione).
La reazione dell'RPHA viene definita metodi immunologici, perché. si basa sull'interazione specifica dell'antigene del treponema pallidum patogeno con un anticorpo. Secondo la "teoria del reticolo" l'agglutinazione è il risultato della "reticolazione" delle molecole dell'antigene di superficie con le molecole dell'anticorpo (immunoglobuline).
3. Dichiarazione della reazione di emoagglutinazione passiva
L'RPHA viene posto in compresse di plastica o in provette con diluizioni del siero del sangue del paziente, a cui viene aggiunto un diagnostico eritrocitario.
Il processo di combinazione di un antigene con gli eritrociti è chiamato sensibilizzazione e l'antigene corpuscolare artificiale ottenuto in questo modo è chiamato eritrociti sensibilizzati. I diagnostici eritrocitari sono chiamati eritrociti sensibilizzati da un antigene.
Per preparare il diagnosticum si utilizzano eritrociti di montone o di uccello (solitamente pollo) trattati prima con formalina, poi con tannino, che vengono sensibilizzati con l'antigene ecografico del treponema pallido patogeno (ceppo Nichols) o con le proteine ricombinanti del treponema pallido (TpN15, TpN17, TpN47). Possono essere utilizzati anche eritrociti di pecora sensibilizzati con l'antigene ultrasonificato di treponema pallidum in coltura.
Solo siero (non usare plasma). I campioni emolizzati e torbidi non sono adatti. Gli eritrociti non sensibilizzati servono come controllo negativo (per escludere la presenza di anticorpi anti-eritrociti). In ogni serie di produzioni vengono utilizzati controlli positivi e negativi.
Campioni del siero sanguigno studiato e degli eritrociti testati vengono introdotti nei pozzetti (cellule) della compressa immunologica. Se il siero del paziente contiene anticorpi antitreponemici specifici, quando il siero in esame viene aggiunto al pozzetto con l'antigene si formano complessi antigene-anticorpo associati alla superficie dei trasportatori (eritrociti). Visivamente ciò si manifesta con l'incollaggio dei globuli rossi, cioè l'emoagglutinazione, visibile ad occhio nudo. I complessi immunitari "anticorpo-antigene-eritrocito", che scendono gradualmente sotto l'influenza della gravità, sono distribuiti su tutta la superficie del fondo del pozzetto e formano un'immagine caratteristica di un "ombrello rovesciato".
A seconda della quantità di anticorpi contenuti nel campione da analizzare, l'immagine dell'“ombrello rovesciato” varia dal massimo, occupando l'intera superficie del fondo del pozzetto, a una piccola area nella parte centrale più bassa dello stesso (con illuminazione in centro e la formazione di un anello più intenso di eritrociti sedimentati lungo la periferia).
Gli immunocomplessi non si formano se non sono presenti anticorpi specifici nel campione o quando alla reazione vengono aggiunti eritrociti di controllo (intatti). Allo stesso tempo, gli eritrociti si riuniscono gradualmente nel punto più basso del fondo del pozzetto, formando una figura a forma di punto compatto o "bottone", a volte con una leggera illuminazione al centro.
Se il siero del sangue umano contiene anticorpi antieritrociti, si formerà comunque un "ombrello", sia in reazione con gli eritrociti di prova che con gli eritrociti di controllo. In questo caso, si consigliano altre tecnologie mediche per rilevare anticorpi antitreponemici specifici.
È possibile il fenomeno della prozona (impossibilità di reazione a causa di un eccesso di anticorpi), che viene eliminato mediante diluizione del siero.
4. Contabilità dei risultati della reazione di emoagglutinazione passiva
I risultati dell'RPGA vengono presi in considerazione visivamente dopo 60-120 minuti quando si imposta il micrometodo e dopo 2–4 ore o il giorno successivo quando si imposta la macrovariante. Quando si utilizzano eritrociti di uccello più grandi (nucleati), si ottiene un quadro più chiaro e i risultati vengono registrati in una data precedente.
È possibile determinare il titolo (titolo alto TPHA ≥ 1:2 560).
I risultati dello studio vengono valutati secondo il sistema 4+ (da "-" a "++++") in base alla dimensione del film formato. Quando si verifica l'agglutinazione, gli eritrociti si trovano sulla superficie del pozzetto sotto forma di un "ombrello" e, con un risultato negativo, gli eritrociti scivolano liberamente verso il basso e si accumulano sul fondo al centro del pozzetto sotto forma di un "pulsante". ".
La valutazione generalmente accettata dei risultati di RPGA:
4+ - RPHA positivo. Gli eritrociti agglutinati a forma di "ombrello" rivestono uniformemente l'intera superficie del foro;
3+ - RPHA positivo. Gli eritrociti rivestono l'intera superficie del foro, ma alcuni di essi "scivolano" al centro. Contemporaneamente si forma un anello evidente lungo la periferia del deposito;
2+ - RPHA debolmente positivo. Gli eritrociti formano una pellicola su una piccola area della parte inferiore del pozzetto, formando un denso anello di sedimento eritrocitario con una notevole illuminazione al centro;
1+ - RPHA indeterminato, gli eritrociti formano un sedimento sciolto sul fondo del pozzetto con bordi sfocati e un leggero lume al centro;
(–) - RPHA negativo, tutti gli eritrociti giacciono sul fondo del pozzetto sotto forma di sedimento compatto ("bottoni" o riccioli) su uno sfondo circostante pulito (senza sedimentazione granulare circostante).
Nella pratica straniera, i risultati dell'RPGA vengono anche valutati come reattivi (in caso di formazione di agglutinati), debolmente reattivi (se le formazioni sono insignificanti) e non reattivi (se non si osserva agglutinazione).
La contabilità dei risultati della reazione può essere eseguita automaticamente utilizzando analizzatori speciali. Oltre ad uno studio qualitativo, tutti i sistemi di analisi prevedono un'analisi quantitativa con determinazione del titolo.
5. In quali periodi della malattia è meglio usare RPHA
L'RPHA diventa positivo a metà del periodo primario (7-8 settimane dal momento dell'infezione, 3-4 settimane dopo la comparsa di un'ulcera dura) e rimane positivo per anni dopo il trattamento.
Con un livello molto elevato di anticorpi contro il treponema nel siero studiato (che è più caratteristico della sifilide secondaria), è possibile un risultato falso negativo di TPHA (il cosiddetto fenomeno "prozona").
Anticorpi specifici per l'agglutinina vengono rilevati nel sangue di persone che hanno avuto la sifilide per molto tempo, quindi l'RPGA non può essere raccomandato per la diagnosi differenziale di reinfezione o per determinare la gravità del processo infettivo.
L'RPGA non viene utilizzato per controllare la cura, perché. può rimanere positivo molti anni dopo la guarigione. Allo stesso tempo, può essere utilizzato come metodo aggiuntivo (a RMP o RPR) nel monitoraggio dell'efficacia del trattamento, indagando la dinamica della diminuzione dei titoli anticorpali. Un prerequisito per questo è l'uso dello stesso sistema di test RPGA utilizzato nel primo esame (prima del trattamento) del paziente, nonché lo studio nello stesso laboratorio.
6. Sensibilità e specificità dell'RPHA
L'RPHA è considerato un test altamente sensibile e specifico. Questa reazione è un test diagnostico prezioso in tutte le forme di sifilide, ma è particolarmente sensibile nelle forme avanzate della malattia. La sensibilità dell'RPHA varia a seconda dello stadio della malattia. Con la sifilide primaria, la sensibilità dell'RPHA è del 76% (e superiore), con la sifilide secondaria - fino al 100%. Con latente precoce - 97%, con sifilide tardiva - 94%, con una specificità del 98-100%. La minore sensibilità nelle forme fresche della malattia è dovuta alla successiva formazione di agglutinine.
Secondo l'istituto statale "TsNIKVI Roszdrav", la sensibilità dell'RPHA nella diagnosi di varie forme di sifilide era del 99,4%. La maggior parte dei ricercatori nota una specificità del 98-99% dell'RPHA.
In termini di sensibilità e specificità, l'RPHA non è inferiore e, nelle forme tardive e nella sifilide congenita, supera addirittura RIF e RIBT.
7. Ambito di applicazione del metodo RPGA
Il TPHA può essere utilizzato sia come test di screening che di conferma; può essere utilizzato in variante semiquantitativa con il calcolo del titolo anticorpale. Sono stati sviluppati un metodo quantitativo per la preparazione dell'RPHA, un micrometodo e una reazione di microemoagglutinazione automatizzata.
8. Caratteristiche, vantaggi e svantaggi dell'RPGA
Secondo la letteratura, l’RPGA ha costantemente assunto una posizione di leadership nella pratica clinica nella maggior parte dei paesi del mondo. Il TPHA è il test più utilizzato nelle cliniche IST all'estero.
La tecnica RPGA è di facile esecuzione, non richiede attrezzature particolari: per allestirla è necessaria solo una piastra di emoagglutinazione. Lo studio non richiede molto tempo; la reazione è altamente sensibile e specifica. L'approvazione del metodo nella pratica clinica ha dimostrato che è estremamente semplice, economico e sensibile. Come ELISA, RPHA è semplice da eseguire, non richiede personale altamente qualificato e attrezzature speciali e la sua automazione è possibile.
Vantaggi del test RPGA:
- facile da configurare e interpretare,
- non richiede attrezzature speciali,
- tempo per ottenere il risultato: 45 minuti,
- adatto per lo screening di massa (sono necessari solo 25 µl di siero con una diluizione di 1:20),
- elevato grado di standardizzazione,
- la presenza di controlli interni,
- lunga durata
- prezzo accettabile
- la possibilità di automatizzare la contabilità.
Va anche notato gli svantaggi dell'RPGA:
- la possibilità di reazioni aspecifiche in presenza di anticorpi anti-eritrociti,
- mancanza di correlazione tra titolo e stadio della sifilide,
- successiva reazione positiva nelle prime fasi della sifilide,
- la possibilità di reazioni false positive in persone che hanno assunto alcol, tossicodipendenti,
- sensibilità alle vibrazioni e alla temperatura in laboratorio.
I vantaggi di RPGA rispetto a RIBT e RIF sono:
- utilizzo di sistemi di test industriali,
- la possibilità di automatizzare la reazione,
- non è necessario lavorare con treponema pallido vivo,
- elimina la necessità di un vivaio.
9. Fonti e cause di errori nell'impostazione dell'RPHA, risultati falsi positivi e falsi negativi
La reazione dell'emoagglutinazione passiva è uno studio relativamente semplice; durante l'esecuzione è necessario seguire tutte le raccomandazioni dei produttori del diagnosticum e le regole di lavoro nel laboratorio diagnostico clinico. Gli errori commessi possono portare alla comparsa e alla registrazione di risultati sia falsi negativi che falsi positivi della reazione. I risultati falsi positivi dell'RPGA possono essere dovuti all'influenza del fattore umano e dei fattori biologici.
Si possono ottenere risultati falsi positivi
- nello studio dei sieri sanguigni di pazienti affetti da treponematosi non veneree,
- a causa del fattore reumatoide
- a causa della reazione crociata degli anticorpi con l'antigene treponemico, che si formano durante vari disturbi metabolici sistemici o indotti da farmaci e indotti da farmaci,
- a causa di livelli anormali di immunoglobuline;
- nei neonati - a causa della formazione nel corpo del feto o del bambino di anticorpi IgM contro le IgG materne, che complica l'interpretazione dei risultati e la diagnosi di sifilide congenita.
Errori causati dall'influenza del fattore di partecipazione umana sullo studio:
- micropiastre contaminate
- pipettaggio errato
- vibrazioni in laboratorio
- la temperatura dell'aria nel laboratorio non rientra nell'intervallo di temperatura: 18–25 gradi
Gli errori tecnici più tipici nell'impostazione di RPGA, che portano a risultati inaffidabili, includono:
- diluizione imprecisa degli ingredienti,
- violazione della temperatura,
- violazione del tempo di incubazione dei reagenti,
- violazione dei termini di applicazione dei reagenti al tablet,
- incoerenza del pH delle soluzioni con quelle richieste,
- contaminazione della vetreria da laboratorio.
Anche i seguenti punti tecnici possono essere fonte di errori durante la configurazione di RPGA:
- esclusione dalla formulazione della reazione dei sieri di sangue di controllo;
- concentrazione irregolare di eritrociti nel diagnosticum a causa di una miscelazione insufficiente prima dell'uso;
- violazione dei termini e delle condizioni di conservazione del diagnosticum e degli eritrociti di controllo; utilizzo di kit scaduti;
- l'uso di provette, puntali di pipette, pipette, piastre immunologiche, soluzioni contaminate durante l'impostazione delle reazioni;
- imprecisioni nella diluizione iniziale di un campione di siero sanguigno;
- accuratezza insufficiente nell'eseguire doppie diluizioni consecutive;
- mancato rispetto del regime di temperatura e del tempo di incubazione;
- la presenza di vibrazioni estranee e scuotimento della piastra immunologica durante l'incubazione;
- violazione del metodo di impostazione dell'RPGA, espressa nel rifiuto di eseguire lo studio con eritrociti di controllo.
L'uso di plasma sanguigno contenente anticoagulanti in grado di provocare agglutinazione eritrocitaria non specifica (RPHA) può portare a risultati non interpretabili.
Il numero di risultati falsi positivi e falsi negativi è inferiore rispetto ad altri test sierologici. LPR nel contesto di RPHA sono rari e possibili con treponematosi (framboesia, bejel, pinta). Inoltre, sono stati registrati risultati falsi positivi (meno dell'1% in totale) nei tossicodipendenti, nei pazienti con mononucleosi infettiva, borreliosi, lebbra, con collagenosi, cirrosi epatica, linfosarcoma e anche nelle donne in gravidanza.
Risultati falsi negativi della reazione possono essere dovuti alla competizione tra anticorpi IgM e IgG. Risultati falsi negativi sono possibili anche in pazienti affetti da HIV.
10. Modifiche al metodo RPHA
Esistono modifiche micro e macro dell'impostazione RPGA, la prima è utilizzata più spesso a causa dell'economia, della velocità di impostazione e della considerazione dei risultati.
Inoltre, è stato sviluppato un complesso diagnostico automatico per l'analisi delle immagini, che ha permesso di eseguire una valutazione automatica quantitativa dei risultati ed eliminare la soggettività nell'interpretazione dei dati ottenuti. Il complesso hardware-software riconosce l'immagine, elabora i dati e fornisce la risposta in unità relative.
Lettori e analizzatori automatici vengono utilizzati anche per automatizzare la registrazione dei risultati RPGA.
TPPA (agglutinazione di particelle di Treponema pallidum) - un test di agglutinazione di particelle artificiali per rilevare gli anticorpi contro il Treponema pallidum
Breve descrizione del test TPPA
Attualmente, per diagnosticare la sifilide viene utilizzata anche una modifica del metodo di emoagglutinazione passiva - TPRA (agglutinazione delle particelle di Treponema pallidum), in cui l'antigene del treponema pallido è fissato su particelle di gelatina. Poiché le particelle polimeriche artificiali non hanno i propri antigeni che determinano l'attività biologica, i kit per la sierodiagnosi della sifilide basati su di essi hanno motivo di essere considerati più avanzati. L'uso di particelle artificiali biologicamente inerti riduce al minimo l'agglutinazione non specifica comunemente osservata con altri vettori.
Il TPPA viene utilizzato per la diagnosi sierologica degli anticorpi contro vari tipi e sottospecie di treponemi patogeni. Questo test può essere utilizzato per rilevare gli anticorpi contro gli agenti causali di sifilide, pinta, bejel e framboesia.
La procedura di studio è molto semplice e non richiede attrezzature speciali: vengono utilizzate micropiastre standard a forma di "U". Il test si basa sull'agglutinazione di particelle di gelatina sensibilizzate con antigeni di T. pallidum, anticorpi presenti nel siero del paziente.
Il TPPA è un test treponemico di conferma utile sia per piccoli numeri di campioni che per screening di massa. Il TPPA viene utilizzato all'estero come test di conferma e in sostituzione del test di microemoagglutinazione MHA-TP (test di microemoagglutinazione per anticorpi contro T. pallidum).
La sensibilità del test TPPA è compresa tra l'85% e il 100%, mentre la specificità è compresa tra il 98% e il 100%. La sensibilità del TPPA per la sifilide primaria è dell'88%, per la sifilide secondaria e tardiva latente del 98%-100%.
Se il TPPA viene utilizzato per diagnosticare la sifilide, gli anticorpi contro altri tipi di treponema (come T. pallidum endemicum, pertenue o carateum) possono causare risultati falsi positivi. Esistono numerosi metodi per rimuovere questi anticorpi dai campioni di siero prima di iniziare il test.
Principio del test TPPA
Il TPPA è un metodo di agglutinazione passiva per particelle di gelatina nel siero o plasma umano. Il siero contenente anticorpi contro il treponema patogeno reagisce con particelle di gelatina sensibilizzate con l'antigene del treponema pallido del ceppo Nichols, sottoposto ad ultrasuoni. Come risultato della reazione, nel pozzetto della piastra per microtitolazione si forma una pellicola liscia di particelle di gelatina agglutinate.
Se non sono presenti anticorpi, le particelle si depositano sul fondo del pozzetto della piastra, formando un “bottone” compatto di particelle non agglutinate. Anche i pozzetti di controllo con particelle di gelatina non sensibilizzate dovrebbero mostrare un "bottone" così compatto per ciascun siero, cioè nessuna agglutinazione.
Applicazione del test TPPA
Il TPRA è un test universale che può essere utilizzato con uguale successo sia nell'esame preventivo obbligatorio di gruppi di popolazione per la sifilide (screening) sia in istituti dermatovenereologici specializzati. Il vantaggio del test TPPA è la sua elevata sensibilità, che non è inferiore ai test classici, che fino a poco tempo fa rappresentavano il "gold standard" per la sierodiagnosi della sifilide. Altri vantaggi del test includono l'elevata riproducibilità, nonché la semplicità e la velocità di preparazione della reazione.
Il test TPPA viene utilizzato per confermare i risultati positivi dei test di screening non treponemici per la sifilide, come il test VDRL, e per valutare i pazienti con test non treponemici negativi ma che presentano segni o sintomi suggestivi di sifilide tardiva. L’uso del TPPA come unico test di screening per la sifilide non è raccomandato.
Inoltre, il test di agglutinazione TPPA può essere utilizzato per esaminare campioni di liquido cerebrospinale nella diagnosi di neurosifilide. In questo caso, come con altri test sierologici, l'interpretazione dei risultati deve essere effettuata in combinazione obbligatoria con altri indicatori e sintomi della malattia.
Risultati del test TPPA
Il risultato viene valutato secondo il sistema dei "più" - da (-) a (2+). I risultati del test sono visibili ad occhio nudo e vengono interpretati come segue:
| Grado di agglutinazione | Punteggio del test | Interpretazione |
|---|---|---|
| Le particelle agglutinate rivestono uniformemente il fondo della piastra | 2+ | Positivo |
| Anello ampio e significativo con margini esterni irregolari e agglutinazione periferica | 1+ | Positivo |
| Le particelle formano un anello compatto con uno spazio vuoto al centro e liscio frontiere esterne | ± | debolmente positivo |
| Le particelle formano un anello compatto al centro del pozzo con un leggero spazio al centro e un confine esterno liscio. | – | Negativo |
| Le particelle formano un "bottone" al centro del foro con un confine esterno liscio | – | Negativo |
I risultati vengono registrati per determinare la conformità con la descrizione di cui sopra. I campioni che mostrano un risultato indeterminato (±) devono essere rianalizzati. Nel caso in cui un campione mostri un risultato indeterminato in diversi test TPPA, si consiglia di condurre uno studio utilizzando altri metodi.
I risultati dell’analisi non dovrebbero essere considerati isolatamente. Ad esempio, nella fase iniziale dell'infezione, il numero di anticorpi è ancora troppo piccolo, per cui il TPPA e molti altri metodi mancano di sensibilità. Pertanto, se si sospetta la sifilide, anche se i risultati del test sono negativi, i campioni devono essere riesaminati. Per fare una diagnosi è necessario tenere conto dei sintomi clinici che il paziente presenta, della storia clinica e di altri dati.
Come nel test TPHA, anche per il TPPA è possibile osservare il fenomeno della prozona e un risultato falso negativo se il campione di siero contiene un titolo anticorpale troppo elevato.
ELISA-ELISA
Il test immunoenzimatico (ELISA; test immunoassorbente legato all'enzima, ELISA) è uno dei tanti metodi per la diagnosi sierologica delle malattie infettive. Il test immunoenzimatico (ELISA) nella sierodiagnosi della sifilide è un test per gli anticorpi delle classi M, G e A (IgM, IgG, IgA) contro gli antigeni del treponema pallido. È possibile eseguire l'ELISA con il liquido cerebrospinale.
L'introduzione nella pratica del test immunoassorbente enzimatico (ELISA) al posto della reazione di Wasserman e di altri test sulla cardiolipina ha migliorato significativamente la qualità della diagnosi di laboratorio della sifilide. Un vantaggio significativo di questo metodo è la possibilità di automatizzare il processo di ricerca, riducendo così l’influenza del fattore umano.
1. Storia del metodo ELISA
I principi di base del dosaggio immunoenzimatico sulla superficie di un supporto in fase solida sono stati sviluppati da E. Engvar et al. (1971), B.Van Weeman e A.Schuurs (1971). Il test immunoenzimatico da loro sviluppato fu proposto per la prima volta per la diagnosi della sifilide nel 1975 da J. Veldkamp e A. Visser, che apprezzarono il potenziale di questo test automatizzato. L'ELISA ha iniziato ad essere ampiamente utilizzato nella diagnosi della sifilide negli anni '80, quando sono stati sviluppati e certificati test diagnostici e i metodi di test sono stati standardizzati. Nell'URSS, la tecnica ELISA per la diagnosi della sifilide è stata sviluppata da V.N. Bednova, A.V. Babiy e A.V. Kotrovsky (1982, 1983).
2. Principio del metodo ELISA
Il test immunoassorbente legato all'enzima (ELISA) secondo il meccanismo di reazione è vicino al RIF (vengono rilevati gli stessi anticorpi). La reazione immunoenzimatica è classificata come reazione immunologica basata sull'interazione altamente specifica degli antigeni del treponema pallidum con gli anticorpi di un paziente affetto da sifilide.
Nella pratica sifilidologica viene utilizzata principalmente una variante indiretta dell'ELISA. Il principio della variante di reazione indiretta più comunemente utilizzata è il seguente. Sulla superficie dei pozzetti di una piastra di polistirolo sono fissati immunocomplessi che si formano durante l'interazione degli anticorpi di un paziente affetto da sifilide con antigeni di treponema pallido. Successivamente vengono rilevati in una reazione cromatica utilizzando coniugati specifici e additivi cromogenici del substrato appropriati.
La procedura per eseguire il test è la seguente: il siero del paziente viene posto su un supporto in fase solida su cui è attaccato un antigene. In presenza di anticorpi, sulla superficie del trasportatore si forma un complesso antigene-anticorpo. Per "manifestare" i risultati della reazione vengono utilizzati anticorpi anti-specie anti-Ig umane coniugati con marcatori enzimatici. In caso di reazione positiva, l'enzima legato al complesso antigene-anticorpo decompone il substrato aggiunto al sistema, provocando lo sviluppo di macchie colorate di diversa intensità.
Nella reazione, la determinazione del complesso di AG e AT adsorbito sulla fase solida viene effettuata utilizzando anticorpi antiglobulina marcati con l'enzima, a seconda della reazione cromatica dell'enzima con il substrato.
Nella reazione, la determinazione del complesso di antigeni e anticorpi adsorbiti sulla fase solida viene effettuata utilizzando anticorpi antiglobulina marcati con enzima.
L'ELISA offre la possibilità di rilevare Ig sieriche di diverse classi. Esistono sistemi sul mercato che consentono di determinare separatamente le IgM e le IgG e gli anticorpi totali.
Gli antigeni specifici utilizzati per l'ELISA possono avere un'origine diversa:
ultra-vocale- sono ottenuti a seguito della distruzione della cellula batterica T.pallidum mediante ultrasuoni o altro metodo;
ricombinante- si ottengono mediante tecnologie di ingegneria genetica introducendo nel genoma di una cellula batterica (ad esempio Escherichia coli E.Coli) il gene responsabile della sintesi di un determinato antigene di T.pallidum, seguita dalla crescita della massa batterica di il microrganismo produttore, la distruzione di queste cellule, l'isolamento e la purificazione dell'antigene;
peptide- ottenuto come risultato della sintesi chimica sequenziale di epitopi antigenici delle proteine di T.pallidum.
Il corpo è in grado di formare anticorpi contro quasi ogni parte della molecola dell'antigene. In una risposta immunitaria normale, questo di solito non si verifica. Uno o più peptidi immunogenici isolati da un antigene proteico hanno un'antigenicità speciale e la maggior parte degli anticorpi si formano specificamente per essi. Sviluppano la risposta immunitaria più intensa. Il più informativo in ELISA ha mostrato regioni immunodominanti delle proteine del treponema pallido con un peso molecolare di 15 kD, 17 kD e 47 kD. Come antigene è stato utilizzato un estratto detergente o sonicato di treponemi patogeni del ceppo Nichols.
3. Il metodo per condurre la ricerca secondo il metodo
Il principio del metodo è quello di identificare uno specifico complesso antigene-anticorpo adsorbito sulla fase solida (la superficie dei pozzetti di una piastra di plastica) con anticorpi antiglobulina marcati con un enzima (perossidasi) mediante una reazione cromatica con un substrato, che è quantificato spettrofotometricamente.
Gli antigeni utilizzati per sensibilizzare i pozzetti della piastra in polistirolo possono essere:
- lisato- ottenuto a seguito della distruzione del treponema pallido mediante ultrasuoni;
- peptide- ottenuto come risultato della sintesi chimica di frammenti di proteine del treponema pallido e aventi reattività antigenica simile alle proteine originali dell'agente patogeno;
- ricombinante- ottenuto utilizzando metodi di ingegneria genetica, portando determinanti antigenici identici al treponema pallido.
Nella pratica sifilidologica viene solitamente utilizzata una variante indiretta dell'ELISA.
4. Contabilità dei risultati
Nell'ELISA, per visualizzare la reazione antigene-anticorpo, viene utilizzata una reazione enzimatica (fosfatasi alcalina o perossidasi di rafano) con un substrato, che cambia colore. L'intensità del colore determina la positività della reazione (da "-" a "++++"). I risultati dell'ELISA possono essere valutati visivamente su un sistema a 4 punti o strumentalmente sotto forma di indicatori digitali di densità ottica ottenuti su appositi lettori (come Multiscan) alla lunghezza d'onda di 492 nm. Perché la valutazione dei risultati viene effettuata spettrofotometricamente, ciò esclude un'interpretazione soggettiva.
5. In quali periodi della malattia è meglio usare
Termini di positività ELISA - dalla 4a settimana dall'infezione. I risultati dell'ELISA (così come del RIF) diventano positivi nei primi giorni del periodo primario o alla fine dell'incubazione e rimangono positivi in tutti i periodi. L'ELISA è particolarmente utile nella diagnosi precoce della sifilide: risultati positivi agli anticorpi possono essere ottenuti già alla fine del periodo di incubazione della malattia (cioè 4-6 settimane dopo l'infezione).
6. Sensibilità e specificità
L'ELISA è un test altamente sensibile e specifico, questo è il suo vantaggio. ELISA in termini di meccanismo di reazione, sensibilità e specificità è vicino al RIF, tk. gli stessi anticorpi prendono parte ad entrambe le reazioni. La maggior parte dei ricercatori nota un'elevata specificità e sensibilità in tutte le fasi della malattia. La sensibilità di varie varianti ELISA, secondo G. A. Dmitriev, raggiunge il 98-100% e la specificità è del 96-100%. Secondo TsNIKVI, la sensibilità dell'ELISA per la sifilide è del 99,1% (ordine n. 87 M3 della Federazione Russa).
La variante ELISA (saggio immunoassorbente legato all'enzima, ELISA) in fase solida è uno dei test sierologici più sensibili, poiché consente il rilevamento di 0,0005 µg/ml di anticorpi e 0,000005 µg/ml di antigeni.
7. Ambito del metodo
Si consiglia di utilizzare il metodo durante l'esame di donne incinte, persone di contatto, donatori e rappresentanti di gruppi a rischio. L'ELISA può essere utilizzato sia come test di screening che di conferma. In un periodo relativamente breve della sua storia, l'ELISA si è evoluto da test indicativo a test di conferma. Nella diagnosi della sifilide, il test viene utilizzato anche come test di conferma per campioni che mostrano risultati positivi utilizzando vari test non treponemici e TPHA.
Il metodo ELISA può essere utilizzato quantitativamente con il calcolo dell'indice di positività, o di reattività, che permette di valutare il livello di anticorpi nel campione.
Attualmente, in Russia, l'uso del test immunoenzimatico per la diagnosi della sifilide è regolato dall'Ordine del Ministero della Salute della Federazione Russa n. 87 del 26 marzo 2001 "Sul miglioramento della diagnosi sierologica della sifilide" (Appendice n. 1 “Istituzione di esami di screening e diagnostici per la sifilide”). Nell'ordine è prevista la sostituzione di RSK nel complesso delle sieroreazioni (SSR) con ELISA e RPHA.
8. Fonti e cause degli errori di stadiazione, falsi positivi e falsi negativi
Il test immunoenzimatico è uno studio complesso in più fasi, in cui è necessario seguire rigorosamente tutte le raccomandazioni dei produttori di kit diagnostici, le regole per la regolazione e la configurazione dell'attrezzatura utilizzata nello studio.
I seguenti punti possono essere fonte di errori durante l'impostazione di un ELISA:
Uno studio sulla reazione del siero sanguigno iperlipidemico, emolizzato o di campioni con segni di crescita batterica;
Non praticare un doppio o più congelamento di un campione di materiale biologico; se necessario, per il riesame, utilizzare siero proveniente da una provetta duplicata;
Violazione dei termini e delle condizioni di conservazione della soluzione immunoassorbente e di lavaggio; utilizzo di kit di test scaduti;
Applicazione di componenti di reazione da altri kit diagnostici;
Violazione del tempo delle fasi di reazione;
Asciugatura dei pozzetti della piastra immunologica durante le fasi di reazione;
Riutilizzo di piastre in plastica (vassoi in plastica) per la preparazione di una miscela di cromogeno e substrato;
Mancato rispetto della frequenza del controllo metrologico dei parametri di funzionamento dei dispositivi utilizzati (lavatrice e spettrofotometro);
L'uso di vetreria da laboratorio contaminata durante la preparazione delle reazioni: matracci, cilindri graduati, provette, pipette, puntali per pipette;
Insufficiente accuratezza nell'eseguire diluizioni di campioni di materiale biologico;
Errori durante l'introduzione di un campione di materiale biologico nel corrispondente pozzetto della compressa;
Errori durante il trasferimento dei risultati dello studio al registro di registrazione, al protocollo dello studio o al modulo di risposta.
L'attenta attuazione delle raccomandazioni delle istruzioni per l'uso dei kit di test diagnostici, la verifica regolare dell'accuratezza dei dispensatori di pipette e dei dispositivi automatici, l'uso di controlli interni positivi e negativi consentono di ottenere risultati ELISA altamente riproducibili.
9. Caratteristiche, vantaggi e svantaggi
ELISA è uno dei metodi moderni e promettenti per la sierodiagnosi della sifilide grazie alla sua semplicità, riproducibilità e disponibilità. La rilevazione degli anticorpi mediante ELISA è un metodo diagnostico ideale adatto per l'esame simultaneo di un gran numero di campioni. Grazie ai suoi vantaggi, ha guadagnato popolarità in tutti i paesi.
La tecnologia della ricerca ELISA prevede il rispetto di tutte le raccomandazioni dei produttori di kit di test diagnostici commerciali e la completezza della procedura di ricerca. Per condurre ricerche nell'ELISA, è necessario acquistare ulteriori attrezzature speciali. La tecnica di impostazione richiede più tempo rispetto a RMP, RPR e RPGA.
La presenza di automazione di più fasi o dell'intero processo nel suo complesso consente di esaminare contemporaneamente un elevato numero di campioni di materiale biologico con un elevato grado di standardizzazione dello studio, riducendo al minimo l'elemento soggettivo nella valutazione dei risultati, la possibilità di memorizzare protocolli di studio fissi, il che rende possibile archiviare i dati dello studio e farvi nuovamente riferimento per analisi retrospettive.
Vantaggi:
- Consente la determinazione differenziata e totale degli anticorpi IgM e IgG contro l'agente eziologico della sifilide.
- elevata sensibilità e specificità prossime al 100%,
- riproducibilità
- possibilità di automazione
I vantaggi dell'ELISA includono elevata specificità (96-100%) e sensibilità (98-100%) notate dalla maggior parte dei ricercatori.
La presenza di automazione di più fasi o dell'intero processo nel suo complesso consente di esaminare contemporaneamente un flusso con un numero elevato di campioni di materiale biologico con un elevato grado di standardizzazione dello studio, minimizzando l'elemento soggettivo nella valutazione dei risultati, la possibilità di memorizzare protocolli di studio fissi che consentono di archiviare i dati di studio e di accedervi nuovamente per analisi retrospettive.
Svantaggi significativi dei metodi manuali, inclusa la determinazione degli anticorpi contro gli antigeni di T. pallidum mediante ELISA, sono:
~ possibili errori del personale durante lo studio (svista, negligenza, violazione della tecnologia);
~ l'impossibilità di una completa standardizzazione del processo di ricerca con una versione manuale dell'ELISA;
~ aumento del rischio di infezione del personale.
10. Modifiche al metodo
Insieme al classico ELISA indiretto, è noto anche il metodo. intrappolando l'ELISA. È stato proposto nel 1989 da O. E. Ijsselmudien et al. per rilevare gli anticorpi della classe IgM contro gli antigeni Tr. pallido. Il metodo ha elevata specificità e sensibilità.
Gli anticorpi purificati contro le immunoglobuline umane di classe M vengono assorbiti sulla superficie dei pozzetti della compressa e, dopo l'incubazione del siero in esame, tutte le IgM si legano al trasportatore. La presenza tra le associate di IgM specifiche per gli antigeni Tr. pallidum viene rilevato utilizzando gli antigeni Tr. pallidum coniugato con un enzima.
Questo metodo consente di rilevare gli anticorpi non solo della classe IgM, ma anche delle classi IgG e IgA. A tale scopo, i pozzetti delle piastre vengono sensibilizzati con anticorpi purificati per affinità di una determinata classe contro le immunoglobuline umane. In questo caso, gli anticorpi di questa classe vengono catturati dal siero e il rilevamento degli anticorpi treponemici specifici viene effettuato combinandoli con un coniugato, che è una combinazione dell'antigene treponemico con un enzima.
L'uso di un ELISA intrappolato riduce il rischio di reazioni false positive mediate dal fattore reumatoide del sangue, reazioni crociate tra immunoglobuline delle classi M e G. Quando si esaminano i neonati, in questo caso, risultati del test falsi positivi associati al rilevamento di IgM dirette contro sono escluse anche le IgG antitreponemiche materne.
Poiché le varianti ELISA sono ampiamente utilizzate all'estero test immunitario enzimatico (EIA) e sistema Sifilide ICE. In quest'ultima, una miscela di anticorpi IgM e IgG, nonché tre proteine ricombinanti di T. pallidum, sono state adsorbite nei pozzetti della piastra. I risultati positivi vengono testati nello stesso sistema di test in due ripetizioni per fornire il risultato finale.
In Russia sono stati sviluppati numerosi sistemi di test per la sierodiagnosi della sifilide mediante ELISA con reagenti domestici. Questi sistemi hanno elevata specificità e sensibilità.
Oltre a quanto sopra, ci sono anche altre opzioni ELISA, tra cui quelle che consentono la rilevazione diretta dell'agente patogeno nel sangue (ELISA diretto), dot-ELISA con la reazione su strisce di nitrocellulosa, ELISA con sangue capillare, nonché immunoblotting, o Western Blot, con rilevamento simultaneo di anticorpi contro vari componenti dell'agente patogeno.
Una moderna modifica migliorata dell'ELISA è l'immunoblotting.
ICA (analisi immunochemiluminescente), ICL (immunochemiluminescenza)
Con lo sviluppo della diagnostica di laboratorio nel contesto della modernizzazione dell'assistenza sanitaria nella Federazione Russa, l'automazione della ricerca di laboratorio è entrata nella pratica dei laboratori, il che consente di standardizzare le fasi analitiche della ricerca. Ciò migliora la qualità della diagnostica. Con l'introduzione dell'automazione, iniziarono ad essere applicati nuovi metodi high-tech con elevata sensibilità e specificità, come il test immunologico in chemiluminescenza (CLIA)
La chemiluminescenza è il processo di emissione di fotoni durante la transizione dei prodotti elettronicamente eccitati delle reazioni chimiche ossidative allo stato energetico iniziale. Durante la reazione di chemiluminescenza viene rilasciata una quantità significativa di energia e la resa quantica della luce emessa è piuttosto elevata. Di tutti i metodi non isotopici, la chemiluminescenza fornisce la sensibilità più elevata. Per i metodi immunometrici, la sensibilità della chemiluminescenza è di ordini di grandezza superiore a quella del dosaggio radioimmunometrico.
Il metodo dell'immunochemiluminescenza (ICL) ha ora trovato la sua applicazione nella diagnosi di marcatori tumorali, malattie autoimmuni, diabete, marcatori cardiaci, ormoni (tiroide, surrenali, ormoni sessuali femminili e maschili), infezioni da torcia, epatite virale, virus del gruppo dell'herpes.
Sulla base del metodo dell'immunochemiluminescenza sono stati sviluppati numerosi sistemi di test altamente sensibili e specifici (98-100%) per la diagnosi della sifilide, utilizzati principalmente all'estero.
Nel metodo, come antigeni vengono utilizzate lipoproteine ricombinanti ottenute mediante metodi di ingegneria genetica, che sono analoghi completi degli antigeni di T.pallidum.
Sulla base dei risultati di uno studio clinico, il metodo ICA è stato riconosciuto e raccomandato per l'uso nella diagnosi di laboratorio della sifilide nella Federazione Russa come test di screening e di conferma se i laboratori dispongono delle attrezzature adeguate. Nel 2012, l’ICA è stato incluso come test di screening e conferma per la diagnosi di sifilide nelle Linee guida cliniche per la gestione dei pazienti con infezioni sessualmente trasmissibili e infezioni urogenitali.
Pertanto, l'uso dell'ICA ad alta tecnologia, che è entrato nella pratica della diagnostica di laboratorio sia mondiale che domestica con l'introduzione dell'automazione, offre i seguenti vantaggi:
- esclusione dell'influenza di fattori soggettivi nella fase analitica dello studio
- sicurezza del personale durante l’esecuzione di studi su materiale biologico potenzialmente infetto
- aumentare la velocità di ottenimento dei risultati da parte del paziente
- standardizzazione della ricerca e controllo della qualità della ricerca
- fornitura di risultati affidabili e affidabili ai pazienti
- ricerca clinica di laboratorio di alta qualità.
In termini di sensibilità, il metodo ICA è paragonabile al metodo radioimmunologico e in termini di facilità di esecuzione, sicurezza per il personale e molti altri parametri lo supera.
Il metodo ICA, che ha elevata sensibilità e specificità (98-100%), consente di quantificare il livello di anticorpi contro l'agente eziologico della sifilide e può essere utilizzato per confermare l'infezione sifilitica e lo screening. Limitazioni d'uso: non può essere utilizzato per monitorare l'efficacia della terapia, può dare un risultato falso positivo.
Immunocromatografia (ICH).
Relativamente nuovi per l'uso nella Federazione Russa sono i metodi per il rilevamento degli anticorpi specifici del treponema basati sui metodi dell'immunocromatografia (ICH). Come nel metodo ICA, come antigeni vengono utilizzate lipoproteine ricombinanti ottenute con metodi di ingegneria genetica (ad esempio: antigeni Tp15, Tp17, Tp47) e il peptide biosintetico TmpA. Gli antigeni elencati vengono anche utilizzati in varie combinazioni come parte di immunoassorbenti nell'ELISA e nell'immunoblotting.
Il metodo ICG consente di determinare rapidamente il contenuto di anticorpi specifici del treponema contro l'agente eziologico della sifilide in campioni di siero e di sangue intero senza l'uso di speciali apparecchiature di laboratorio e viene utilizzato nella fornitura di assistenza sanitaria di base, comprese le indicazioni epidemiologiche.
Limitazioni d'uso: non può essere utilizzato per monitorare l'efficacia della terapia, può dare un risultato falso positivo.
PBT (test rapidi semplici al letto del paziente)
Relativamente recentemente, nella sierodiagnosi della sifilide, si è iniziato a svilupparsi una direzione per lo sviluppo dei cosiddetti test rapidi semplici (PBT), o test al capezzale del paziente (Point-of-care - ROC). Semplici test rapidi al capezzale, o test immunocromatografici, consentono di determinare rapidamente il contenuto di anticorpi specifici del treponema contro l'agente eziologico della sifilide in campioni di siero e di sangue intero senza l'uso di speciali apparecchiature di laboratorio e di essere utilizzati nell'assistenza sanitaria di base, compreso indicazioni epidemiologiche. Limitazioni d'uso: non può essere utilizzato per monitorare l'efficacia della terapia, può dare un risultato falso positivo.
Questi test si basano sulla rilevazione immunocromatografica degli anticorpi contro gli antigeni treponemici del treponema pallido e vengono eseguiti su strisce; in questo caso è possibile utilizzare sia sangue intero che siero (Herring A., Ballard R. et al, 2006). Il formato dei test consente di condurre ricerche in assenza di attrezzature speciali e senza l'uso di elettricità. Tuttavia, a causa della sensibilità e specificità relativamente basse, questi test non sono ancora ampiamente utilizzati nella pratica.
Immunoblotting (Western Blot)
Negli ultimi anni sono apparsi metodi di ricerca volti a rilevare e analizzare il contenuto di anticorpi. per ciascun antigene treponema pallido separatamente. Uno di questi metodi è il metodo dell'immunoblotting (o blotting, immunoblotting, Western blot), che viene utilizzato per determinare gli anticorpi IgG o IgM contro il treponema pallido. Il metodo dell'immunoblotting è una modifica del test immunoenzimatico, una variante dell'ELISA.
L'immunoblotting è uno dei metodi più moderni per la sierodiagnosi della sifilide ed è utilizzato attivamente all'estero. Ha preso il nome ("Western Blotting") come risposta umoristica ai nomi delle tecniche di rilevamento del DNA ("Southern Blotting") e dell'RNA ("Northern Blotting").
1. Storia del metodo
L'immunoblotting (Western blot) viene utilizzato per determinare gli anticorpi IgG o IgM contro gli antigeni del treponema pallido (Herremans M. et al., 2007).
2. Immunoblot classico
Immunoblot classico(Analisi Western Blot) combina il dosaggio immunoenzimatico e l'uso di un metodo elettroforetico. Gli antigeni proteici dell'agente eziologico della sifilide vengono preliminarmente separati mediante elettroforesi e trasferiti su un supporto: una membrana di nitrocellulosa (striscia). Questo trasferimento è chiamato blotting. Quindi questo supporto con punti separati (macchie) viene trattato con il siero in esame e gli anticorpi IgG o IgM marcati con enzimi o sostanze radioattive. Il metodo prevede l'utilizzo di proteine del treponema naturali o ricombinanti.
elettroforesiè la separazione dei composti carichi in base alla loro mobilità in un campo elettroforetico. Quando viene applicata una differenza di potenziale in un mezzo, le molecole caricate positivamente si muovono verso un elettrodo carico negativamente e le molecole cariche negativamente si muovono verso un elettrodo positivo.
La maggior parte delle proteine globulari sono assemblate in modo tale che la maggior parte dei gruppi carichi, cioè quelli idrofili, si trovano sulla superficie della proteina, mentre i residui idrofobici non carichi sono immersi all'interno del globulo. In un campo elettrico, a seconda della loro carica, le proteine migrano verso un elettrodo di carica opposta.
La separazione elettroforetica delle proteine viene effettuata in un mezzo gel sintetico a base di poliacrilammide. Per separare le proteine in base al loro peso molecolare, prima dell'elettroforesi, la miscela proteica viene preincubata in presenza di sodio dodecil solfato (SDS).
Studi dettagliati condotti da scienziati stranieri Weber e Osborn (1969) hanno dimostrato che dopo tale trattamento, l'unico fattore che può influenzare la mobilità delle proteine nel gel di poliacrilammide (PAAG) è la dimensione della proteina, o meglio il suo peso molecolare. Ciò ha permesso di applicare il metodo dell'elettroforesi in SDS-PAGE in presenza di SDS per una determinazione abbastanza accurata del peso molecolare di proteine e peptidi. Nella letteratura straniera, questo metodo era chiamato SDS-PAGE (elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide).
Profilo di reattività nel classico test WB con antigeni naturali (metodo di elettroforesi su gel di poliacrilammide con sodio dodecil solfato). (1) - risultato positivo del controllo, (2) - risultato negativo del controllo, (3-6) - campioni clinici.
Nei test per la sifilide utilizzando questo metodo, pre-purificato e distrutto nei suoi componenti costitutivi, il treponema pallido viene sottoposto ad elettroforesi in un gel di poliacrilammide o di agarosio. Allo stesso tempo, gli antigeni inclusi nella sua composizione vengono separati in base al peso molecolare.
Quindi, mediante elettroforesi verticale, gli antigeni vengono trasferiti su una striscia di nitrocellulosa, che ora contiene uno spettro invisibile di bande antigeniche caratteristiche del treponema pallido.
Durante l'analisi, il materiale da testare (siero, plasma sanguigno del paziente, ecc.) viene applicato su una striscia di nitrocellulosa (striscia). Se nel campione sono presenti anticorpi specifici, nel processo di incubazione si legano fortemente alle bande antigeniche che corrispondono strettamente ad esse (complementari) e formano un complesso “antigene-anticorpo”.
Dopo la rimozione delle immunoglobuline non legate durante il lavaggio della striscia, segue l'incubazione con un coniugato - anticorpi marcati con enzima anti-immunoglobuline umane (anticorpi anti-IgG o IgM umani), durante la quale gli anticorpi marcati con l'enzima vengono attaccati all'antigene-anticorpo esistente complessi sulla superficie della membrana.
Dopo la rimozione del coniugato non legato durante l'incubazione con la soluzione substrato, l'enzima interagisce con il substrato, provocando una reazione colorata - colorazione delle sezioni della membrana (sotto forma di bande) dove si trovano i singoli antigeni del treponema pallido, anticorpi contro che erano nel siero in esame. L'intensità della colorazione dipende dalla quantità di anticorpi legati dal siero. Il risultato della reazione viene valutato visivamente.
La presenza di bande in alcune aree della piastra di nitrocellulosa conferma la presenza nel siero studiato di anticorpi contro antigeni strettamente definiti del treponema pallido.
Gli immunodeterminanti 15, 5, 17, 44,5, 47 kD determinati utilizzando questo metodo hanno significato diagnostico nella sifilide. L'immunoblotting delle Ig G è simile in sensibilità e specificità al RIF con assorbimento (RIF abs). L'immunoblotting Ig M può servire come test diagnostico per la sifilide congenita.
3. Immunoblot in formato immunologico lineare
Il test immunologico lineare (line immunoassay, LIA) consente di determinare contemporaneamente gli anticorpi contro gli antigeni del treponema pallido nel siero o nel plasma umano. Gli antigeni vengono preapplicati alle strisce reattive (strisce), fornite come parte di kit diagnostici commerciali.
Le strisce sono realizzate con membrana di nitrocellulosa, membrana di poliammide con supporto in plastica o membrana di nylon con supporto in plastica. Durante la produzione, diversi antigeni distinti vengono posizionati sulla striscia reattiva come linee antigeniche separate. Oltre a questi antigeni della sifilide, su ciascuna corsia vengono applicate altre quattro linee di controllo: streptavidina e controlli (3+, 1+ e ± linea di taglio).
Per le strisce vengono utilizzati antigeni artificiali ottenuti mediante ingegneria genetica: proteine ricombinanti o costrutti polipeptidici sintetici. Questi sono analoghi degli antigeni di superficie del treponema pallido - TpN15, TpN17, TpN47 e TmpA con un peso molecolare di 15, 17, 47 kDa e 44,5 (TmpA), dove kDa=kiloDalton. Con il loro aiuto vengono determinati gli anticorpi sierici contro vari componenti immunodominanti dell'agente patogeno.
L'incubazione del campione da analizzare avviene in una cuvetta, dove viene posizionata anche la striscia indicatrice. Gli anticorpi contro T. pallidum vengono determinati legandosi agli antigeni stampati sulle strisce reattive. Se nel campione sono presenti anticorpi specifici per T. pallidum, questi formano legami con le singole linee antigeniche. Quando gli anticorpi contenuti nel siero del test interagiscono con gli antigeni distinti di T. pallidum posizionati sulla striscia reattiva, si forma un complesso antigene-anticorpo sotto forma di bande colorate rilevabili visivamente.
Quando si prendono in considerazione i risultati dell'immunoblotting, la reattività del siero a ciascuno degli antigeni viene valutata separatamente. Viene emessa una risposta positiva totale quando si ottiene un risultato contemporaneamente con due o tre degli antigeni presentati.
Le procedure di ricerca vengono eseguite manualmente o su un analizzatore speciale, con l'interpretazione dei risultati utilizzando un programma informatico specializzato per le malattie infettive.
A causa dell'elevato grado di purificazione degli antigeni ricombinanti e del rilevamento simultaneo di anticorpi contro i determinanti più immunogenici dell'agente eziologico della sifilide, il metodo ha un'elevata sensibilità e specificità.
4. Contabilità dei risultati
Per leggere l'intensità della colorazione delle bande antigeniche sulle strisce sono stati sviluppati dei fotometri, il cui funzionamento si basa sulla riflessione del segnale, che elimina la valutazione soggettiva e fornisce una potenziale opportunità di automazione.
5. In quali periodi della malattia è meglio usare
I test che utilizzano il metodo Western blot possono rilevare anticorpi specifici contro gli antigeni del Treponema pallidum in una fase molto precoce della malattia. I più significativi nella diagnosi della sifilide sono gli anticorpi contro gli antigeni del treponema pallido TpN15, TpN17, TmpA e TpN47. Questi antigeni sono proteine di membrana aventi pesi molecolari rispettivamente di 15, 17, 44,5 e 47 kDa.
Quando il treponema pallidum viene introdotto nel corpo umano, gli anticorpi antisifilitici compaiono in questo ordine: prima si sviluppa una risposta immunitaria agli antigeni TpN17, poi a TpN47, dopo TpN15 e successivamente a tutti i TmpA. Quando si prendono in considerazione i risultati del test, viene valutata la reattività del siero a ciascuno di essi separatamente. Ad esempio, quando in un linear blot si riscontra reattività solo alla linea antigenica TpN17 e TpN47, ciò significa che la malattia è in uno stadio iniziale. Più le linee antigeniche diventano reattive, più l’infezione progredisce. Nel trattamento della sifilide, il modello di reattività in questo test cambia.
La determinazione delle IgM alle proteine con un peso molecolare di 15,17, 41, 47 kDa consente di identificare il 29,2% dei pazienti con sifilide secondaria, il 12,5% con sifilide latente precoce e l'8,0% con sieroresistente. La ricerca di IgG verso le stesse molecole è caratterizzata da una sensibilità del 61,6% per la sieroresistente e del 100% per la sifilide secondaria e latente precoce.
6. Sensibilità e specificità
Secondo la letteratura, la sensibilità e la specificità del test sono molto elevate: rispettivamente 99,6-100% e 99,3-99,5%. Nel metodo classico, ciò si ottiene attraverso la separazione elettroforetica di proteine, glico- e lipoproteine e la massima specificità nel rilevamento di sieri immunitari o anticorpi monoclonali. In condizioni ottimali, l'immunoblotting può rilevare l'antigene in quantità inferiori a 1 ng nel volume del test.
Anche la sensibilità del linear blot è del 99,6% e la specificità è compresa tra il 99,3% e il 99,5%.
Secondo gli esperti, l'immunoblotting con antigeni ricombinanti altamente specifici è simile per sensibilità e specificità al RIF abs.
Secondo i dati della letteratura straniera e i risultati di uno studio presso TsNIKVI, il metodo immunoblotting ha un'elevata sensibilità (98,8-100%) e specificità (97,1-100%) nella diagnosi della sifilide.
7. Ambito del metodo
L'immunoblotting (immunoblot) è un metodo di riferimento altamente specifico e altamente sensibile. L'elevata sensibilità e specificità consentono di considerare questo metodo come un test di conferma per la sifilide. Il metodo può essere utilizzato per confermare la diagnosi, così come nel caso in cui altri test treponemici forniscano risultati discutibili e contrastanti. Il Western blotting può confermare la diagnosi in pazienti con risultati del test positivi o indeterminati, compresi quelli ottenuti utilizzando TPHA o ELISA.
8. Fonti e cause degli errori di stadiazione, falsi positivi e falsi negativi
I risultati falsi positivi sono molto rari. Anche i risultati falsi negativi sono piuttosto rari e si osservano in pazienti con immunodeficienze - più spesso in persone con infezione da HIV e con l'effetto di una "finestra" diagnostica dovuta a un ritardo nella sintesi degli anticorpi, nonché a errori nella fase di stadiazione.
L'uso di moderni sistemi di test impone l'esatto rispetto di tutti i requisiti sia per il materiale che per le prestazioni della reazione. Fondamentalmente, la fonte degli errori è una violazione dell'ordine e della tecnologia dello studio (soprattutto per il classico Western blot), il mancato rispetto delle raccomandazioni dei produttori dei kit di test. . Errori possono essere commessi anche nella raccolta, consegna, conservazione dei campioni di siero sanguigno, nonché nell'esecuzione dei test. Oltre ai campioni contaminati, altre possibili cause includono l'uso di kit di test scaduti ed errori nell'analisi dei risultati dei test.
9. Caratteristiche, vantaggi e svantaggi
L'unicità dell'immunoblot risiede nel suo elevato contenuto di informazioni e nell'affidabilità dei risultati.
Il test non richiede antigeni altamente purificati, sieri di riferimento e di controllo. L'identificazione di un bersaglio anticorpale si basa sul peso molecolare della proteina con cui reagiscono gli anticorpi del siero del paziente. In una reazione è possibile rilevare il legame degli anticorpi con diversi antigeni, ciascuno dei quali può essere caratterizzato con precisione. Per questo motivo, l'immunoblotting presenta numerosi vantaggi rispetto ad altri metodi per la rilevazione degli anticorpi, i cui risultati dipendono dalla standardizzazione, sensibilità, qualità del substrato, instabilità o insolubilità di alcuni antigeni.
Il metodo è facilmente riproducibile, relativamente facile da eseguire e interpretare i risultati, consente di determinare contemporaneamente lo spettro degli anticorpi contro diversi antigeni di T. pallidum e di valutare il contributo di anticorpi di diversa specificità alla reazione complessiva.
L'uso di antigeni ricombinanti e peptidici altamente purificati riduce al minimo la reattività non specifica dei sieri. L'uso del metodo consente di evitare metodi soggettivi e ad alta intensità di lavoro che sono pericolosi per il ricercatore (trapianto di ceppi di G. pallidum, lavoro con T. pallidum patogeno durante l'impostazione di una reazione). Ciò determina la preferenza per il metodo dell'immunoblotting rispetto ad altri test treponemici (RIF e soprattutto RIBT) per la diagnosi della sifilide.
10. Modifiche al metodo
Esistono diversi sistemi di test commerciali basati su questo metodo. Alcuni di essi sono nel formato macchia occidentale, sono costituiti da strisce sulle quali vengono trasferite le componenti proteiche di T. pallidum, precedentemente separate mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide.
Altri sono nel formato macchia lineare, sono costituiti da strisce su cui i polipeptidi ricombinanti e sintetici sono adsorbiti sotto forma di linee discrete - analoghi degli antigeni di superficie di T. pallidum, TpN15, TpN17, TpN47 e TmpA.
I risultati del Western blot sono più difficili da interpretare perché le strisce mostrano un'ampia varietà di anticorpi, molti dei quali sono gruppo-specifici. Al contrario, l'interpretazione dei risultati della macchia lineare è semplice; inoltre, ulteriori linee di controllo stampate sulla striscia consentono la valutazione semiquantitativa del livello di anticorpi contro i quattro antigeni di T. pallidum.
Tecnologia xMAP
xMAP è una tecnologia all'avanguardia che consente di effettuare studi multiparametrici rilevando simultaneamente più analiti in un singolo campione biologico. Come fase solida vengono utilizzate microsfere colorate rivestite con reagenti di cattura (oligonucleotidi, anticorpi, antigeni).
Il campione da analizzare viene aggiunto alla soluzione contenente le microsfere. Gli analiti rilevati nel campione si legano alla microsfera corrispondente, dopodiché nella soluzione viene introdotto un agente di rilevamento (anticorpi di rilevamento, etichetta fluorescente). Per rilevare l'analita da determinare viene utilizzato un sistema di due laser, che consente sia una valutazione qualitativa della presenza di un analita in un campione (per questo viene utilizzato un laser rosso che classifica le microsfere per colore) sia una valutazione quantitativa del contenuto dell'analita in un campione (per questo viene utilizzato un laser verde).
Lo studio viene effettuato in automatico su analizzatori quali Bio-Plex 200 (bio-rad), Bio-Plex2200 (bio-rad), Luminex100 (luminex), Luminex200 (luminex) dotati di software.
Le prestazioni della tecnologia xMAP superano significativamente le prestazioni del classico test immunoassorbente legato a un enzima (ELISA) con una quantità significativamente inferiore di biomateriale.
La tecnologia xMAP, che ha un'elevata sensibilità analitica, è attualmente utilizzata per risolvere un'ampia gamma di problemi clinici. Con il suo aiuto, in un campione di materiale biologico, viene effettuata la rilevazione simultanea di marcatori oncologici noti, marcatori cardiaci, marcatori della fase acuta e diabete mellito, un'ampia gamma di citochine, chemochine e fattori di crescita. Il rilevamento simultaneo di più analiti in un campione biologico può ridurre significativamente il tempo di esame del paziente. Finora sono stati sviluppati numerosi sistemi di test per la rilevazione di anticorpi contro gli agenti patogeni IST, in particolare l'infezione sifilitica, utilizzando il metodo xMAP.
"Su Samotechnaya"Ricevimento su appuntamento! Sabato domenica.
Forse ti è stato assegnato un rinvio al laboratorio per l'analisi dell'RPHA, ma non capisci veramente cosa significhi questa abbreviazione. Cos'è e quanto è serio tutto, imparerai in dettaglio da questo articolo.
Oltre ai pazienti con sintomi gravi di malattie sessualmente trasmissibili, l'invio per l'analisi RPHA può essere dato alle persone che si sottopongono a una visita medica per trovare lavoro, prima di un intervento chirurgico o quando una donna viene registrata per la gravidanza. Non c'è nulla di terribile e vergognoso qui, semplicemente, in questo modo, gli esperti analizzano la popolazione per gravi malattie sessuali, il che consente di identificare tempestivamente i portatori dell'infezione e fornire loro cure mediche adeguate anche prima dello sviluppo di complicanze.
Se pratichi rapporti sessuali non protetti (indipendentemente da quanto conosci il tuo partner sessuale, perché molte persone stesse non sono consapevoli della loro infezione) o sospetti il tuo partner abituale, puoi donare il sangue in modo sicuro e scoprire presto il risultato e dissipare la paura dall'incertezza. Per ottenere un rinvio per le analisi di laboratorio, non è necessario rivolgersi a un venereologo. È sufficiente rivolgersi con questa richiesta al proprio terapeuta o parlare di sospetti inquietanti a un ginecologo o un urologo.
Decifrare l'analisi
RPHA sta per reazione di emoagglutinazione passiva. Conoscere il suo valore è necessario per determinare la presenza dell'agente eziologico di una grave malattia a trasmissione sessuale: la sifilide. Se il corpo umano è stato colpito da un'infezione, questo può essere identificato con precisione in base ai risultati di un esame del sangue.
Durante lo studio, uno specialista può rilevare l'agglutinazione degli eritrociti, il che significa che i globuli rossi hanno iniziato ad aderire e precipitare sotto una sorta di influenza negativa. In questo caso si tratta di un treponema pallido che vive negli strati superiori e provoca danni all'organismo con la sifilide.
Il meccanismo dell’infezione è abbastanza semplice:
- C'è un organismo sano;
- Entra un microrganismo patogeno: treponema pallido;
- Si sviluppa una risposta immunitaria;
- Ciò, a sua volta, provoca la produzione di anticorpi, che sono un segno di una malattia a trasmissione sessuale esistente.
Per un esame del sangue per TPHA, sono caratteristici due tipi di anticorpi, che indicano la presenza o l'assenza dell'agente eziologico della sifilide:
- Non specifico e non treponemico;
- Specifico e treponemico.
Questa metodologia di ricerca è stata applicata per la prima volta nel 1965. Da allora, è stato utilizzato attivamente per diagnosticare la sifilide. La sua elevata sensibilità consente non solo di rilevare l'agente patogeno, ma anche di determinare lo stadio in cui procede la malattia.
Si conoscono quattro forme di sifilide:
- primario;
- secondario;
- Terziario;
- Latente.
Con lo sviluppo di patologie autoimmuni, sullo sfondo di alcune malattie virali, il numero di anticorpi non specifici può aumentare nel corpo del paziente, il che verrà percepito dall'analisi del TPHA come una falsa reazione.
L'esame del sangue RPGA è indicato per tutti i pazienti che hanno avuto disturbi simili ai segni della sifilide o quando il medico sospetta qualcosa di simile a causa della sua grande esperienza pratica.
È anche molto importante sottoporsi a tale esame per alcune donne che pianificano una gravidanza presto. Perché nel loro caso devi essere curato e poi pensare solo alla nascita di un bambino, a meno che, ovviamente, la sua salute non sia importante per loro.
Questa analisi è spesso inclusa nel gruppo degli esami obbligatori prima dell'intervento chirurgico. Grazie ad una diagnosi completa del corpo è possibile pianificare il corso dell'operazione e il suo esito favorevole.
Come sostenere questo test
Probabilmente capisci quanto seria possa essere fatta la diagnosi sulla base dei risultati dell'analisi RPGA.
A volte la conclusione è errata a causa della scarsa preparazione del paziente allo studio, motivo per cui una risposta falsa positiva diventa motivo per prescrivere trattamenti inutili o, al contrario, dannosi.
Per evitare di falsare i risultati del test è sufficiente seguire le raccomandazioni di seguito riportate:
- Nessun cibo dovrebbe essere consumato alla vigilia della donazione di sangue per RPHA. Questa analisi, come la maggior parte delle altre, viene eseguita rigorosamente a stomaco vuoto;
- Anche qualsiasi bevanda diversa dalla semplice acqua pulita non dovrebbe entrare nel corpo nel giorno previsto per l'analisi. Se bevi il liquido consentito, il suo volume dovrebbe essere minimo in modo da non influenzare in alcun modo la composizione del sangue;
- Di solito, affinché una persona non muoia di fame e di sete, il prelievo di sangue avviene al mattino;
- La stessa mattina è meglio non fumare affatto. Le sostanze contenute nei fumi e nei vapori possono dare una reazione negativa, per cui i risultati verranno interpretati in modo errato dall'assistente di laboratorio;
- Il divieto vale anche per gli alcolici. Inoltre, è meglio smettere di bere alcolici qualche giorno prima dello studio.
Arrivando in una stanza speciale, il paziente deve esporre la mano dagli indumenti in modo che l'infermiera possa prelevare il sangue da una vena. Questa procedura è nota a quasi tutti. È relativamente indolore e veloce. Al termine ti verrà comunicato quando i risultati dell'analisi RPGA saranno pronti per poter essere ritirati.
- In contatto con 0
- Google+ 0
- OK 0
- Facebook 0
