38. Uso pratico dei batteriofagi. Diagnostica dei fagi, tipizzazione dei fagi, terapia dei fagi. Metodi per la titolazione dei batteriofagi.
Applicazione pratica dei batteriofagi. La rigorosa specificità dei batteriofagi consente di utilizzarli per la tipizzazione dei fagi e la differenziazione delle colture batteriche, nonché per la loro indicazione nell'ambiente esterno, ad esempio nei corpi idrici.
Il metodo di tipizzazione dei batteri è ampiamente utilizzato nella pratica microbiologica. Permette non solo di determinare l'appartenenza alla specie della cultura in studio, ma anche il suo fagotipo (fagovar). Ciò è dovuto al fatto che i batteri della stessa specie hanno recettori che assorbono fagi rigorosamente definiti, che poi ne provocano la lisi. L'uso di set di tali fagi tipo-specifici consente di effettuare la fagotipizzazione delle colture studiate ai fini dell'analisi epidemiologica delle malattie infettive: stabilire la fonte dell'infezione e le modalità della sua trasmissione.
Inoltre, dalla presenza di fagi nell'ambiente esterno (corpi idrici), si può giudicare il contenuto in essi dei batteri corrispondenti, che rappresentano un pericolo per la salute umana. Questo metodo l'indicazione dei batteri patogeni viene utilizzata anche nella pratica epidemiologica. La sua efficacia è migliorata avviando una reazione di aumento del titolo dei fagi, che si basa sulla capacità di specifiche linee fagiche di riprodursi su colture batteriche rigorosamente definite. Quando un tale fago viene introdotto nel materiale di prova contenente l'agente patogeno desiderato, il suo titolo aumenta. L'uso diffuso della reazione di aumento del titolo dei fagi è complicato dalla difficoltà di ottenere set di indicatori di fagi e da altri motivi.
L'uso dei fagi per scopi terapeutici e profilattici è relativamente raro. Ciò è dovuto a un gran numero di risultati negativi, che sono spiegati dai seguenti motivi:
1) la rigorosa specificità dei fagi che lisano solo quelle cellule della popolazione batterica dotate dei recettori appropriati, per cui gli individui fagoresistenti presenti in ciascuna popolazione mantengono pienamente la loro vitalità;
2) l'uso diffuso di agenti etiotropici più efficaci: antibiotici che non hanno la specificità dei batteriofagi.
Attualmente, i preparati di batteriofagi vengono utilizzati per trattare la dissenteria, la salmonellosi e le infezioni purulente causate da batteri resistenti agli antibiotici. In ciascun caso, viene preliminarmente determinata la sensibilità degli agenti patogeni isolati a un determinato preparato di batteriofago.
I fagi della Salmonella vengono utilizzati per prevenire la malattia con lo stesso nome nei gruppi di bambini.
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CM. ZAKHARENKO, candidato in scienze mediche, professore associato, Accademia Medica Militare. CM. Kirov, San Pietroburgo
I batteriofagi sono microrganismi unici, sulla base dei quali è stato creato un gruppo speciale di preparati terapeutici e profilattici in termini di proprietà e caratteristiche. Le loro azioni sottostanti sono naturali meccanismi fisiologici le interazioni tra fagi e batteri consentono di prevedere l'infinita diversità sia dei batteriofagi stessi che dei batteriofagi modi possibili le loro applicazioni. Con l'espansione delle collezioni di batteriofagi appariranno senza dubbio nuovi patogeni bersaglio, la gamma di malattie in cui i fagi possono essere utilizzati sia in modalità monoterapia che come parte di schemi complessi trattamento.
Pertanto, l'uso del piobatteriofago polivalente Sextaphage nel trattamento della necrosi pancreatica infetta (Accademia medica statale di Perm intitolata all'accademico E.A. Wagner) ha permesso di ripristinare rapidamente i principali parametri dell'omeostasi e le funzioni di organi e sistemi nei pazienti. C'è stata anche una significativa diminuzione del numero complicanze postoperatorie E deceduti: nel gruppo di pazienti che ricevono terapia standard, la mortalità è stata del 100%, mentre nella troupe che ha ricevuto BF - 16,6%.
A causa dell'innocuità e della reattogenicità dei preparati BP, è possibile utilizzarli pratica pediatrica, anche nei neonati. Interessante l'esperienza dell'Ospedale clinico regionale pediatrico di Nizhny Novgorod, dove durante il periodo di complicazione della situazione epidemiologica, insieme alle consuete misure antiepidemiche, sono stati utilizzati BP - Intesti-bacteriophage e BP Pseucfomonas aeruginosa. È stata dimostrata una diminuzione di 11 volte dell’incidenza dell’infezione nosocomiale ad eziologia da Pseudomonas aeruginosa alta efficienza Applicazioni BF. I preparati BF possono essere prescritti sia per il trattamento della disbatteriosi che dei disturbi apparato digerente e per prevenire la colonizzazione della mucosa tratto gastrointestinale batteri patogeni opportunisti. Le preparazioni multicomponente di BF sono ideali per il sollievo immediato dei primi segni di disturbi gastrointestinali.
Ad oggi l'azienda sta progettando intera linea aree prioritarie per lo sviluppo e la produzione di batteriofagi terapeutici e profilattici, che sono correlati alle nuove tendenze globali emergenti. Vengono creati e introdotti nuovi preparati: sono stati sviluppati BF contro dentellature ed enterobatteri, sono in corso lavori per creare un preparato fagico contro Helicobacter pylori.
Solo un produttore di questi farmaci - NPO Microgen, secondo il rapporto del vice capo del dipartimento di scienza e sviluppo innovativo Alla Lobastova, produce più di 2 milioni di confezioni all'anno. Sfortunatamente, le idee di molti medici sui batteriofagi sono lungi dall'essere obiettive. Non molti sanno che i batteriofagi attivi contro lo stesso agente patogeno possono appartenere a famiglie diverse, avere cicli vitali diversi, ecc. Ad esempio, i batteriofagi P. aeruginosa appartengono alle famiglie Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae, ciclo vitale o moderato. Ceppi diversi dello stesso agente patogeno possono avere una diversa suscettibilità ai batteriofagi. La maggior parte degli esperti sa (sentito, qualcuno lo usa) dell'esistenza del liquido e della compressa forma di dosaggio preparazioni terapeutiche e profilattiche di batteriofagi. Tuttavia, la loro gamma è molto più ampia, il che può essere attribuito a vantaggi incondizionati, soprattutto in combinazione con una varietà di vie di somministrazione (somministrazione orale, clisteri, applicazioni, irrigazione di ferite e mucose, introduzione nelle cavità della ferita, ecc.). A evidenti benefici tradizionalmente si parla di batteriofagi impatto specifico su una popolazione di batteri piuttosto limitata, di esistenza limitata nel tempo (fino alla scomparsa della popolazione bersaglio di microrganismi), l'assenza di tali effetti collaterali come tossico e reazioni allergiche, reazioni disbiotiche, ecc. Questi farmaci possono essere utilizzati in una varietà di gruppi di età e durante la gravidanza. I batteriofagi stessi non lo sono allergeni significativi. I casi di intolleranza ai preparati batteriofagi sono per lo più associati a una reazione ai componenti del mezzo nutritivo. Tutti i principali produttori di questo gruppo di farmaci puntano alla massima qualità dei componenti utilizzati, il che riduce la probabilità di tali reazioni. Nel contesto della crescente resistenza agli antibiotici, alcuni autori propongono di considerare i batteriofagi come la migliore alternativa antibiotici. I preparati terapeutici e profilattici dei batteriofagi sono un cocktail di combinazioni appositamente selezionate (un complesso di virus batterici policlonali altamente virulenti appositamente selezionati contro i gruppi più comuni di agenti patogeni di infezioni batteriche) basati sulle raccolte di fagi del produttore. Filiali dell'impresa unitaria dello Stato federale NPO Microgen a Ufa, Perm e Nizhny Novgorod – centri moderni produzione di tali farmaci. Possibilità di creare su misura microrganismi patogeni I preparati terapeutici e profilattici di batteriofagi rappresentano un altro grande vantaggio di questo gruppo di preparati. La crescita della resistenza batterica ai farmaci antimicrobici e la frequente polieziologia moderna malattie infettive richiedono una terapia antibiotica combinata (due, tre e talvolta più farmaci antimicrobici). Per la selezione schema efficiente Nella terapia antibiotica, oltre all'effettiva sensibilità dei batteri al farmaco, è necessario tenere conto di un numero abbastanza elevato di fattori. Anche la terapia fagica presenta alcuni vantaggi in questo senso. Da un lato, l'uso di una combinazione di batteriofagi non è accompagnato dalla loro interazione tra loro e non porta a un cambiamento negli schemi della loro applicazione. All'interno della serie esistente di batteriofagi terapeutici, esistono una serie di combinazioni ben collaudate: batteriofago coliproteus, piobatteriofago polivalente, intesti-batteriofago. I batteri invece no meccanismi comuni resistenza agli antibiotici e ai fagi, quindi, possono essere utilizzati sia quando il patogeno è resistente ad uno dei farmaci, sia nella combinazione “antibiotico + batteriofago”. Questa combinazione è particolarmente efficace per distruggere i biofilm microbici. L’esperimento lo dimostra in modo convincente applicazione combinata gli antagonisti del ferro e i batteriofagi possono interrompere la formazione dei biofilm di Klebsiella pneumoniae. Allo stesso tempo, si nota sia una diminuzione significativa del numero di popolazioni microbiche sia una diminuzione del numero di cellule "giovani". Ancora uno caratteristica importante l'azione dei batteriofagi è un fenomeno come l'induzione dell'apoptosi. Alcuni ceppi di E. coli hanno geni causando la morte cellule dopo l'introduzione del batteriofago T4 al suo interno. Pertanto, in risposta all'espressione dei geni tardivi del fago T4, il gene lit (codifica una proteasi che distrugge il fattore di allungamento EF-Tu necessario per la sintesi proteica) blocca la sintesi di tutte le proteine cellulari. Il gene prrC codifica per una nucleasi che scinde il tRNA della lisina. La nucleasi viene attivata dal prodotto del gene stp del fago T4. Nelle cellule infette dai fagi T4, i geni rex (appartenenti al genoma dei fagi ed espressi nelle cellule lisogeniche) provocano la formazione di canali ionici, portando alla perdita di ioni vitali da parte delle cellule e, successivamente, alla morte. Lo stesso fago T4 può prevenire la morte cellulare chiudendo i canali con le sue proteine, prodotti dei geni rII. Nel caso in cui si formi resistenza batterica ad un antibiotico, si devono cercare nuove opzioni per modificare la molecola attiva o sostanze fondamentalmente nuove. Sfortunatamente per l'anno scorso il ritmo di introduzione di nuovi antibiotici è rallentato in modo significativo. La situazione con i batteriofagi è fondamentalmente diversa. Le collezioni dei principali produttori comprendono dozzine di ceppi di batteriofagi già pronti e vengono costantemente rifornite con nuovi fagi attivi. Grazie al monitoraggio costante della sensibilità degli agenti patogeni isolati ai batteriofagi, i produttori adeguano le composizioni dei fagi forniti alle regioni. Grazie a batteriofagi adattati è possibile eliminare le epidemie di infezioni nosocomiali causate da ceppi resistenti agli antibiotici. 
A assunzione orale i batteriofagi raggiungono rapidamente i focolai di localizzazione dell'infezione: se assunti per via orale da pazienti con malattie infiammatorie purulente, dopo un'ora, i fagi entrano nel flusso sanguigno, dopo 1–1,5 ore vengono rilevati dall'essudato broncopolmonare e dalla superficie delle ferite da ustione, dopo 2 ore - dall'urina e anche dal liquido cerebrospinale di pazienti con lesioni cerebrali traumatiche.
Pertanto, i batteriofagi sono microrganismi unici, sulla base dei quali è stato creato un gruppo speciale di preparati terapeutici e profilattici in termini di proprietà e caratteristiche. I naturali meccanismi fisiologici di interazione tra fagi e batteri alla base della loro azione consentono di prevedere un'infinita varietà sia dei batteriofagi stessi che delle possibili modalità di utilizzo degli stessi. Man mano che le collezioni di batteriofagi si espandono, appariranno senza dubbio nuovi agenti patogeni bersaglio e si amplierà la gamma di malattie in cui i fagi possono essere utilizzati sia come monoterapia che come parte di regimi di trattamento complessi. Una visione moderna del futuro destino della terapia fagica dovrebbe basarsi su entrambi elevata specificità le loro azioni e la necessità di rispettare rigorosamente tutte le regole della terapia fagica. Contrastare i batteriofagi con qualsiasi mezzo terapia etiotropicaè errato.
Per la prima volta è stato ipotizzato che i batteriofagi siano virus. D. Errel. In futuro furono scoperti virus di funghi, ecc., Cominciarono a essere chiamati fagi.
Morfologia dei fagi.
Dimensioni: 20 - 200 nm. La maggior parte dei fagi hanno la forma di girini. I fagi più complessi sono costituiti da una testa poliedrica contenente acido nucleico, un collo e processi. Alla fine del processo si trova la placca basale, da cui si estendono filamenti e denti. Questi fili e denti servono per attaccare il fago al guscio batterico. I fagi organizzati in modo più complesso nella parte distale del processo contengono un enzima - lisozima. Questo enzima contribuisce alla dissoluzione della membrana batterica dopo la penetrazione del fago NK nel citoplasma. In molti fagi l'appendice è circondata da una guaina, che in alcuni fagi può contrarsi.
Ci sono 5 gruppi morfologici
- Batteriofagi con processo lungo e guaina contraente
- Fagi con un processo lungo ma senza guaina contrattile
- Fagi con una coda corta
- Fagi con un processo analogo
- Fagi filamentosi
Composizione chimica.
I fagi sono costituiti da acido nucleico e proteine. La maggior parte di essi contiene DNA a 2 filamenti chiusi in un anello. Alcuni fagi contengono un singolo filamento di DNA o RNA.
Guscio dei fagi - capside, è costituito da subunità proteiche ordinate - capsomeri.
I fagi organizzati in modo più complesso nella parte distale del processo contengono un enzima - lisozima. Questo enzima contribuisce alla dissoluzione della membrana batterica dopo la penetrazione del fago NK nel citoplasma.
I fagi tollerano bene il congelamento, il riscaldamento fino a 70 e l'essiccazione. Sensibile agli acidi, ai raggi UV e all'ebollizione. I fagi infettano batteri strettamente definiti interagendo con specifici recettori cellulari.
Secondo la specificità dell'interazione -
Polifagi: interagiscono con diverse specie batteriche correlate
I monofagi - specie fagi - interagiscono con un tipo di batteri
Tipo fagi: interagiscono con varianti individuali di batteri all'interno di una specie.
Secondo l'azione dei tipici fagi, le specie possono essere suddivise in fila dei fagi. L'interazione dei fagi con i batteri può procedere di tipo produttivo, aproduttivo e integrativo.
tipo produttivo- si forma la progenie fagica e la cellula viene lisata
Con un produttivo- la cellula continua ad esistere, il processo di interazione viene interrotto nella fase iniziale
Tipo integrativo- il genoma fagico si integra nel cromosoma batterico e convive con esso.
A seconda del tipo di interazione, ci sono fagi virulenti e temperati.
Virulento interagire con i batteri in modo produttivo. Inizialmente il fago viene assorbito sulla membrana batterica grazie all'interazione di recettori specifici. C'è penetrazione o penetrazione dell'acido nucleico virale nel citoplasma dei batteri. Sotto l'azione del lisozima, si forma un piccolo foro nel guscio del batterio, il guscio del fago viene ridotto e viene iniettato NK. Il guscio del fago all'esterno del batterio. La prossima è la sintesi delle prime proteine. Forniscono la sintesi delle proteine strutturali dei fagi, la replicazione dell'acido nucleico dei fagi e la repressione dell'attività dei cromosomi batterici.
Segue la sintesi componenti strutturali replicazione dei fagi e degli acidi nucleici. Da questi elementi viene assemblata una nuova generazione di particelle fagiche. L'assemblaggio è chiamato morfogenesi, nuove particelle, di cui 10-100 possono formarsi in un batterio. Ulteriore lisi del batterio e rilascio di una nuova generazione di fagi nell'ambiente esterno.
batteriofagi temperati interagire in modo produttivo o integrativo. Il ciclo produttivo va allo stesso modo. Con l'interazione integrativa, il DNA di un fago temperato, dopo essere entrato nel citoplasma, si integra nel cromosoma in una determinata area e durante la divisione cellulare si replica in modo sincrono con DNA batterico e queste strutture vengono trasmesse alle cellule figlie. Questo DNA fagico incorporato... profago, e un batterio contenente un profago è chiamato lisogenico, e il fenomeno è chiamato lisogenia.
Spontaneamente o sotto l'influenza di una serie fattori esterni un profago può essere asportato dal cromosoma, cioè spostarsi in uno stato libero, mostrare le proprietà di un fago virulento, che porterà alla formazione di una nuova generazione di corpi batterici - induzione del profago.
La lisogenesi batterica è alla base della conversione fagica (lisogenica). Ciò è inteso come un cambiamento nei tratti o nelle proprietà dei batteri lisogeni, rispetto ai batteri non lisogeni della stessa specie. Potrebbe cambiare diverse proprietà- morfologici, antigenici, ecc.
I fagi temperati possono essere difettosi, incapaci di formare una progenie fagica al di fuori delle condizioni naturali e nell'induzione.
Virione - una particella virale completa, costituita da NK e un guscio proteico
Uso pratico fagi -
- Applicazione in diagnostica. In relazione a un certo numero di specie batteriche, i monofagi vengono utilizzati nella reazione di lizzabilità dei fagi, come uno dei criteri per identificare una coltura batterica, i fagi tipici vengono utilizzati per la tipizzazione dei fagi, per la differenziazione intraspecifica dei batteri. Condotto per scopi epidemiologici, per stabilire la fonte dell'infezione e le modalità di eliminazione
- Per il trattamento e la prevenzione di numerose infezioni batteriche: infezioni di tipo addominale, da stafilococco e da streptococco (compresse acidoresistenti)
- Vengono utilizzati i batteriofagi delle zone temperate Ingegneria genetica come vettore in grado di introdurre materiale genetico in una cellula vivente.
Genetica dei batteri
Il genoma batterico è costituito da elementi genetici capaci di autoreplicarsi - repliconi. I repliconi sono cromosomi e plasmidi batterici. Il cromosoma batterico forma un nucleoide che non è associato alle proteine in un anello chiuso e trasporta insieme aploide geni.
Anche i plasmidi sono un anello chiuso della molecola di DNA, ma molto più piccolo del cromosoma. La presenza di plasmidi nel citoplasma dei batteri non è necessaria, ma conferiscono un vantaggio nell'ambiente. I grandi plasmidi vengono ridotti insieme al cromosoma e il loro numero nella cellula è piccolo. E il numero di piccoli plasmidi può raggiungere diverse decine. Alcuni plasmidi sono in grado di integrarsi in modo reversibile nel cromosoma batterico in una determinata regione e funzionare come un unico replicone. Tali plasmidi sono chiamati integrativi. Alcuni plasmidi sono in grado di essere trasferiti da un batterio all'altro mediante contatto diretto: plasmidi coniugativi. Contengono geni responsabili della formazione delle pillole F, che formano un ponte coniugativo per il trasferimento del materiale genetico.
I principali tipi di plasmidi sono
F - plasmide congativo integrativo. Il fattore sessuale determina la capacità dei batteri di essere donatori durante la coniugazione
R - plasmidi. Resistente. Contiene geni che determinano la sintesi di fattori che distruggono farmaci antibatterici. I batteri che possiedono tali plasmidi non sono sensibili a molti farmaci. Pertanto, si forma un fattore resistente ai farmaci.
Tox plasmidica - fattori determinanti di patogenicità -
Ent - plasmide - contiene il gene per la produzione di enterotossine.
Hly: distruggi l'eritrocito.
elementi genetici mobili. Questi includono inserti - elementi di inserimento. La designazione generalmente accettata è Is. Si tratta di sezioni di DNA che possono muoversi sia all'interno del replicone che tra di loro. Contengono solo i geni necessari per il proprio movimento.
trasposoni- strutture più grandi che hanno le stesse proprietà dell'Is, ma in più contengono geni strutturali che determinano la sintesi di sostanze biologiche, come le tossine. Gli elementi genetici mobili possono causare inattivazione genetica e danni materiale genetico, fusione dei repliconi e diffusione genica nelle popolazioni batteriche.
variabilità nei batteri.
Tutti i tipi di variabilità sono divisi in 2 gruppi: non ereditario (fenotipico, modificazione) ed ereditario (genotipico).
Modifiche- cambiamenti fenotipici non ereditari di tratti o proprietà. Le modifiche non influenzano il genotipo e quindi non vengono ereditate. Sono risposte adattative al cambiamento di alcune condizioni specifiche. ambiente esterno. Di norma, si perdono nella prima generazione, dopo la cessazione del fattore.
Variabilità genotipica colpisce il genotipo dell'organismo e quindi è in grado di essere trasmesso ai discendenti. La variabilità genotipica si divide in mutazioni e ricombinazioni.
Mutazioni- cambiamenti persistenti ed ereditari nelle caratteristiche o proprietà dell'organismo. La base delle mutazioni è qualitativa o cambiamento quantitativo sequenza di nucleotidi in una molecola di DNA. Le mutazioni possono cambiare quasi tutte le proprietà.
Per origine, le mutazioni sono spontanee e indotte.
Mutazioni spontanee si verifica nelle condizioni naturali dell'esistenza dell'organismo, e indicizzato si presentano come risultato dell'azione diretta del fattore mutageno. In base alla natura dei cambiamenti nella struttura primaria del DNA nei batteri, si distinguono mutazioni genetiche o puntiformi e aberrazioni cromosomiche.
Mutazioni geniche si verificano all'interno di un singolo gene e catturano minimamente un nucleotide. Questo tipo di mutazione può derivare dalla sostituzione di un nucleotide con un altro, dalla perdita di un nucleotide o dall'inserimento di uno in più.
Cromosomico- può influenzare diversi cromosomi.
Potrebbe esserci una delezione - la perdita di un segmento cromosomico, una duplicazione - il raddoppio di un segmento cromosomico. Una rotazione di 180 gradi di un segmento cromosomico è un'inversione.
Qualsiasi mutazione avviene sotto l'influenza di un determinato fattore mutageno. Per loro natura, i mutageni sono fisici, chimici e biologici. Radiazioni ionizzanti, raggi X, raggi UV. Ai mutageni chimici: analoghi delle basi azotate, dell'acido nitroso stesso e persino di alcuni medicinali, citostatici. Al biologico: alcuni virus e transfazoni
Ri combinazione- scambio di parti di cromosomi
Trasduzione – trasferimento di materiale genetico da parte di un batteriofago
Riparazione del materiale genetico - ripristino dei danni derivanti da mutazioni.
Esistono diversi tipi di riparazione
- Fotoriattivazione: questo processo è fornito da uno speciale enzima che viene attivato in presenza di luce visibile. Questo enzima si muove lungo la catena del DNA e ripara i danni. Combina i timeri, che si formano sotto l'azione dei raggi UV. I risultati della riparazione oscura sono più significativi. Non dipende dalla luce ed è fornito da diversi enzimi: prima le nucleasi tagliano la sezione danneggiata della catena del DNA, quindi la DNA polimerasi sintetizza un cerotto sulla matrice della catena complementare rimanente e le ligasi cuciono il cerotto nell'area danneggiata .
Le riparazioni sono soggette a mutazioni genetiche, mentre i cromosomi di solito no
- Ricombinazione genetica nei batteri. Caratterizzato dalla penetrazione di materiale genetico da un batterio donatore in un batterio ricevente con la formazione di un genoma figlia contenente i geni di entrambi gli individui originali.
L'inclusione di un frammento di DNA del donatore nel ricevente avviene per crossover
Tre tipi di trasmissione -
- Trasformazione- il processo mediante il quale viene trasferito un frammento di DNA donatore isolato. Dipende dalla competenza del ricevente e dallo stato del DNA del donatore. Competenza- la capacità di assorbire il DNA. Dipende dalla presenza membrana cellulare destinatario di proteine specifiche e si forma durante determinati periodi di crescita batterica. Il DNA del donatore deve essere a doppio filamento e di dimensioni non molto grandi. Il DNA del donatore penetra attraverso il guscio dei batteri e una delle catene viene distrutta, l'altra viene incorporata nel DNA del ricevente.
- trasduzione- effettuato con l'ausilio di batteriofagi. Trasduzione generale e trasduzione specifica.
Generale - si verifica con la partecipazione di fattori virulenti. Durante l'assemblaggio delle particelle fagiche, la testa del fago può erroneamente includere non il DNA del fago, ma un pezzo del cromosoma batterico. Tali fagi sono fagi difettosi.
specifica- è effettuato da fagi moderati. Durante il taglio, il taglio viene effettuato rigorosamente lungo il confine: vengono inseriti tra determinati geni e li trasferiscono.
- coniugazione- trasferimento di materiale genetico dal batterio del donatore al ricevente, con il loro contatto diretto. Condizione necessaria- la presenza di un plasmide congativo nella cellula donatrice. Durante la coniugazione tramite pili si forma un ponte di coniugazione attraverso il quale il materiale genetico viene trasferito dal donatore al paziente.
Diagnostica genetica
Un insieme di metodi per identificare il genoma di un microrganismo o un suo frammento nel materiale in esame. Il metodo dell'ibridazione NC è stato il primo ad essere proposto. Basato sul principio di complementarità. Questo metodo consente di rilevare la presenza di frammenti di DNA marcatore dell'agente patogeno nel materiale genetico utilizzando sonde molecolari. Le sonde molecolari sono brevi filamenti di DNA complementari a un sito marcatore. Nella sonda viene introdotta un'etichetta: fluorocromo, isotopo radioattivo, enzima. Il materiale del test viene sottoposto ad un trattamento speciale che consente di distruggere i microrganismi, rilasciare il DNA e dividerlo in frammenti a filamento singolo. Successivamente, il materiale viene riparato. Quindi viene rilevata l'attività dell'etichetta. Questo metodo non è altamente sensibile. È possibile identificare l'agente patogeno solo con un numero sufficientemente elevato di esso. Da 10 a 4 microrganismi. È piuttosto complicato tecnicamente e richiede un gran numero di sonde. Non è stato ampiamente utilizzato nella pratica. È stato progettato nuovo metodo - polimerasi reazione a catena-PCR.
Questo metodo si basa sulla capacità del DNA e dell’RNA virale di replicarsi, vale a dire all'autoriproduzione. L'essenza del paziente è la copia ripetuta: l'amplificazione in vitro di un frammento di DNA che è un marcatore per un dato microrganismo. Poiché il processo avviene a temperature sufficientemente elevate di 70-90, il metodo è diventato possibile dopo l'isolamento della DNA polimerasi termostabile da batteri termofili. Il meccanismo di amplificazione è tale che la copiatura delle catene di DNA non inizia in nessun punto, ma solo in determinati blocchi di partenza, per la creazione dei quali vengono utilizzati i cosiddetti primer. I primer sono sequenze polinucleotidiche complementari alle sequenze finali del frammento copiato del DNA desiderato e i primer non solo avviano l'amplificazione, ma anche la limitano. Ora ci sono diverse opzioni per la PCR, 3 fasi sono caratteristiche:
- Denaturazione del DNA (separazione in frammenti di 1 filamento)
- Allegato primer.
- Estensione gratuita dei filamenti di DNA a 2 filamenti
Questo ciclo dura 1,5-2 minuti. Di conseguenza, il numero di molecole di DNA raddoppia 20-40 volte. Il risultato è 10 all'ottava potenza delle copie. Dopo l'amplificazione, viene eseguita l'elettroforesi e isolata sotto forma di strisce. Viene eseguito in un dispositivo speciale chiamato amplificatore.
Vantaggi della PCR
- Fornisce indicazioni dirette della presenza dell'agente patogeno nel materiale in esame, senza isolare una coltura pura.
- Sensibilità molto elevata. In teoria, puoi trovare il primo.
- Il materiale per la ricerca può essere disinfettato immediatamente dopo il campionamento.
- Specificità al 100%.
- Risultati rapidi. Analisi completa- 4-5 ore. Metodo espresso.
È ampiamente utilizzato per la diagnosi di malattie infettive, i cui agenti causali sono organismi non coltivati o difficili da coltivare. Clamidia, micoplasmi, molti virus: epatite, herpes. È stato sviluppato un sistema di test per determinarlo antrace, tubercolosi.
Analisi delle restrizioni- con l'aiuto di enzimi, la molecola del DNA viene divisa secondo determinate sequenze di nucleoidi e i frammenti vengono analizzati in base alla loro composizione. In questo modo puoi trovare siti unici.
Biotecnologie e ingegneria genetica
La biotecnologia è una scienza che, basata sullo studio dei processi vitali degli organismi viventi, utilizza questi bioprocessi, nonché gli stessi oggetti biologici, per la produzione industriale di prodotti necessari all'uomo, per la riproduzione di bioeffetti che non si manifestano nell'uomo condizioni innaturali. Come oggetti biologici, vengono spesso utilizzati microrganismi unicellulari, nonché cellule, animali e piante. Le cellule si riproducono molto rapidamente, il che consente poco tempo aumentare la biomassa del produttore. Attualmente la biosintesi di sostanze complesse, come proteine, antibiotici, è più economica e tecnologicamente più accessibile rispetto ad altri tipi di materie prime.
La biotecnologia utilizza le cellule stesse come fonte del prodotto target, nonché grandi molecole sintetizzate dalla cellula, enzimi, tossine, anticorpi e metaboliti primari e secondari: aminoacidi, vitamine, ormoni. La tecnologia per ottenere prodotti di sintesi microbica e cellulare si riduce a diverse fasi tipiche: la scelta o la creazione di una sede produttiva. Selezione del mezzo nutritivo ottimale, coltivazione. Isolamento del prodotto target, sua purificazione, standardizzazione, forma di dosaggio. Ingegneria genetica si riduce alla creazione di un prodotto target necessario per una persona. Il gene bersaglio risultante viene fuso con un vettore e il vettore può essere un plasmide e inserito nella cellula del ricevente. Destinatario - batterio - coli, lievito. I prodotti target sintetizzati dai ricombinanti vengono isolati, purificati e utilizzati nella pratica.
L'insulina è stata la prima ad essere creata interferone umano. Eritropoietina, ormone della crescita, anticorpi monoclonali. Vaccino contro l’epatite B.
Il batteriofago gi o fago (dall'altro greco φᾰγω “divoro”) sono virus che infettano selettivamente le cellule batteriche. Molto spesso, i batteriofagi si moltiplicano all'interno dei batteri e ne causano la lisi. Di norma, un batteriofago è costituito da un involucro proteico e dal materiale genetico di un acido nucleico a filamento singolo o doppio (DNA o, meno comunemente, RNA). Il numero totale di batteriofagi in natura è approssimativamente uguale a forza totale batteri (1030 - 1032 particelle). I batteriofagi sono attivamente coinvolti nel ciclo sostanze chimiche ed energia, hanno un effetto marcato sull'evoluzione di microbi e batteri. La struttura di un tipico miovirus batteriofago.
La struttura dei batteriofagi 1 - testa, 2 - coda, 3 - acido nucleico, 4 - capside, 5 - "collare", 6 - copertura proteica della coda, 7 - fibrilla della coda, 8 - spine, 9 - piastra basale
I batteriofagi differiscono in struttura chimica, tipo di acido nucleico, morfologia e natura dell'interazione con i batteri. A misura virus batterici centinaia e migliaia di volte più piccole delle cellule microbiche. Una tipica particella fagica (virione) è costituita da una testa e una coda. La lunghezza della coda è solitamente 2-4 volte il diametro della testa. La testa contiene materiale genetico - RNA o DNA a filamento singolo o doppio con l'enzima trascrittasi in uno stato inattivo, circondato da un guscio proteico o lipoproteico - un capside che preserva il genoma all'esterno della cellula. L'acido nucleico e il capside insieme costituiscono il nucleocapside. I batteriofagi possono avere un capside icosaedrico assemblato da copie multiple di una o due proteine specifiche. Di solito gli angoli sono costituiti da pentameri della proteina e il supporto di ciascun lato è costituito da esameri della stessa proteina o di una simile. Inoltre, i fagi possono avere forma sferica, a forma di limone o pleomorfa. La coda, o processo, è un tubo proteico - una continuazione del guscio proteico della testa, alla base della coda c'è un'ATPasi che rigenera energia per l'iniezione di materiale genetico. Esistono anche batteriofagi con processo breve, senza processo e filamentosi.
Sistematica dei batteriofagi Un gran numero di batteriofagi isolati e studiati determina la necessità della loro sistematizzazione. A farlo è il Comitato internazionale per la tassonomia dei virus (ICTV). Allo stato attuale, secondo Classificazione internazionale e nomenclatura dei virus, i batteriofagi sono suddivisi in base al tipo di acido nucleico e alla morfologia. SU questo momento distinguere diciannove famiglie. Di questi, solo due contengono RNA e solo cinque famiglie sono avvolte. Delle famiglie di virus contenenti DNA, solo due famiglie hanno genomi a filamento singolo. In nove famiglie contenenti DNA, il genoma è rappresentato da DNA circolare, mentre nelle altre nove è lineare. Nove famiglie sono specifiche solo per i batteri, le restanti nove sono specifiche per gli archaea e (Tectiviridae) infetta sia i batteri che gli archaea.
Interazione di un batteriofago con cellule batteriche In base alla natura dell'interazione di un batteriofago con una cellula batterica, si distinguono i fagi virulenti e temperati. I fagi virulenti possono solo aumentare di numero attraverso il ciclo litico. Il processo di interazione di un batteriofago virulento con una cellula consiste in diverse fasi: adsorbimento del batteriofago sulla cellula, penetrazione nella cellula, biosintesi dei componenti fagici e loro assemblaggio e uscita dei batteriofagi dalla cellula. I batteriofagi inizialmente si attaccano ai recettori fago-specifici presenti sulla superficie cellula batterica. La coda del fago, con l'aiuto di enzimi posti alla sua estremità (principalmente lisozima), scioglie localmente la membrana cellulare, si contrae e il DNA contenuto nella testa viene iniettato nella cellula, mentre l'involucro proteico del batteriofago rimane all'esterno . Il DNA iniettato provoca una completa ristrutturazione del metabolismo cellulare: si arresta la sintesi del DNA batterico, dell'RNA e delle proteine. Il DNA del batteriofago inizia a essere trascritto utilizzando il proprio enzima trascrittasi che, dopo essere entrato nella cellula batterica, viene attivato. Sintetizzato prima presto, poi tardi e. RNA che entra nei ribosomi della cellula ospite, dove vengono sintetizzate le proteine del batteriofago precoci (DNA polimerasi, nucleasi) e tardive (proteine del capside e della coda, lisozima, enzimi ATPasi e trascrittasi). La replicazione del DNA del batteriofago avviene secondo un meccanismo semi-conservativo e viene effettuata con la partecipazione delle proprie DNA polimerasi. Dopo la sintesi delle proteine tardive e il completamento della replicazione del DNA, avviene il processo finale: la maturazione delle particelle fagiche o la combinazione del DNA fagico con una proteina dell'involucro e la formazione di particelle fagiche infettive mature.
Ciclo vitale dei batteriofagi temperati e virulenti fasi iniziali le interazioni con una cellula batterica hanno lo stesso ciclo. Adsorbimento dei batteriofagi sui recettori cellulari fago-specifici. Iniezione di un acido nucleico fagico in una cellula ospite. Co-replicazione degli acidi nucleici fagici e batterici. Divisione cellulare. Inoltre, il batteriofago può svilupparsi secondo due modelli: lisogenico o litico. I batteriofagi temperati dopo la divisione si trovano in uno stato di profase (via lisogenica).I batteriofagi virulenti si sviluppano secondo un modello politico: l'acido nucleico del fago dirige la sintesi degli enzimi fagici, utilizzando per questo l'apparato di sintesi proteica del batterio. Il fago in un modo o nell'altro inattiva il DNA e l'RNA dell'ospite e gli enzimi fagici lo scindono completamente; L'RNA fagico "sottomette" il meccanismo cellulare della sintesi proteica. L'acido nucleico fagico si replica e dirige la sintesi di nuove proteine dell'involucro. Nuove particelle fagiche si formano come risultato dell'autoassemblaggio spontaneo del guscio proteico (capside) attorno all'acido nucleico del fago; sotto il controllo dell'RNA fagico, viene sintetizzato il lisozima. Lisi cellulare: la cellula esplode sotto l'influenza del lisozima; vengono rilasciati circa 200-1000 nuovi fagi; i fagi infettano altri batteri.
Applicazione In medicina Uno degli ambiti di utilizzo dei batteriofagi è la terapia antibatterica, alternativa all'accoglienza antibiotici. Ad esempio, vengono utilizzati batteriofagi: streptococco, stafilococco, klebsiella, dissenteria e irrigazione, piobatteriofago, coli, proteo e coliproteo e altri. 13 registrati e applicati in Russia preparazioni mediche basato sui fagi. Attualmente vengono utilizzati per trattare le infezioni batteriche a cui non sono sensibili trattamento tradizionale antibiotici, soprattutto nella Repubblica della Georgia. Di solito, l'uso dei batteriofagi ha più successo degli antibiotici dove sono presenti membrane biologiche rivestite di polisaccaridi, attraverso le quali gli antibiotici di solito non penetrano. Attualmente uso terapeutico i batteriofagi non sono stati accettati in Occidente, sebbene i fagi siano usati per uccidere i batteri che causano intossicazioni alimentari, come la listeria. In molti anni di esperienza nella quantità grande città e nelle aree rurali, è stata dimostrata un'efficacia terapeutica e profilattica insolitamente elevata del batteriofago dissenterico (P. M. Lerner, 2010). In Russia i preparati terapeutici contro i fagi vengono preparati da molto tempo; i fagi sono stati trattati anche prima degli antibiotici. Negli ultimi anni, i fagi sono stati ampiamente utilizzati dopo le inondazioni di Krymsk e Khabarovsk per prevenire la dissenteria.
In biologia I batteriofagi vengono utilizzati nell'ingegneria genetica come vettori per il trasferimento di segmenti di DNA; è anche possibile il trasferimento naturale di geni tra batteri mediante determinati fagi (trasduzione). I vettori fagici vengono solitamente creati sulla base di un batteriofago temperato λ contenente una molecola di DNA lineare a doppio filamento. I bracci sinistro e destro del fago contengono tutti i geni necessari per il ciclo litico (replicazione, riproduzione). La parte centrale del genoma del batteriofago λ (contiene geni che controllano la lisogenia, cioè la sua integrazione nel DNA di una cellula batterica) non è essenziale per la sua riproduzione ed è di circa 25mila paia di basi. Questa parte può essere sostituito da un frammento di DNA estraneo. Tali fagi modificati attraversano il ciclo litico, ma la lisogenia non avviene. I vettori basati sul batteriofago λ vengono utilizzati per clonare frammenti di DNA eucariotico (cioè geni più grandi) fino a 23 kb di dimensione. Inoltre, i fagi senza inserti sono inferiori a 38 kbp. o, al contrario, con inserti troppo grandi - più di 52 kb. non si sviluppano e non infettano i batteri. Poiché la riproduzione dei batteriofagi è possibile solo nelle cellule viventi, i batteriofagi possono essere utilizzati per determinare la vitalità dei batteri. Questa direzione ha grandi prospettive, poiché uno dei problemi principali in vari processi biotecnologici è la determinazione della vitalità delle colture utilizzate. Utilizzando il metodo di analisi elettro-ottica delle sospensioni cellulari, è stato dimostrato che è possibile studiare le fasi di interazione tra una cellula fago-microbica
E anche in medicina veterinaria per: prevenzione e cura malattie batteriche uccelli e animali; trattamento delle malattie infiammatorie purulente delle mucose degli occhi, della cavità orale; prevenzione delle complicanze purulento-infiammatorie in caso di ustioni, ferite, interventi chirurgici; nell'ingegneria genetica: per la trasduzione - il trasferimento naturale di geni tra batteri; come vettori che trasferiscono sezioni di DNA; utilizzando i fagi è possibile costruire cambiamenti diretti nel genoma del DNA ospite; v Industria alimentare: in grandi quantità, gli agenti contenenti fagi stanno già trasformando carne e pollame pronti al consumo; i batteriofagi sono utilizzati nella produzione di prodotti alimentari a base di carne, pollame, formaggi, prodotti vegetali, ecc.;
v agricoltura: irrorazione di preparati fagici per proteggere piante e colture dalla decomposizione e dalle malattie batteriche; proteggere il bestiame e il pollame da infezioni e malattie batteriche; per la sicurezza ambientale: trattamento antibatterico di semi e piante; pulizia dei locali delle imprese di trasformazione alimentare; sanificazione spazi e attrezzature di lavoro; prevenzione dei locali ospedalieri; svolgimento di attività ambientali
Pertanto, oggi i batteriofagi sono molto popolari nella vita umana e animale. Nelle imprese sono state delineate una serie di aree prioritarie per lo sviluppo e la produzione di batteriofagi terapeutici e profilattici, che sono correlate con le nuove tendenze globali emergenti. Vengono creati e introdotti nuovi farmaci per curare molte malattie. Batteriologi, virologi, biochimici, genetisti, biofisici, biologi molecolari, oncologi sperimentali, specialisti in ingegneria genetica e biotecnologia sono impegnati nello studio e nell'uso dei batteriofagi.
batteriofagi dentro pratica medica utilizzato nella diagnosi, nel trattamento e nella prevenzione delle malattie infettive.
A. Nella diagnostica, il batteriofago viene utilizzato nell'implementazione del metodo di ricerca culturale per determinare il tipo di coltura pura isolata, nonché per la sua tipizzazione. Il metodo descritto di seguito per utilizzare un batteriofago per indicare la presenza di un certo tipo di batteri in un materiale patologico senza isolarlo in una coltura pura non è molto diffuso.
1. La reazione di aumento del titolo dei fagi si basa sulla capacità di uno specifico batteriofago di replicarsi solo nelle cellule batteriche della sua “propria” specie. Viene eseguito secondo il seguente principio. Una certa quantità di un batteriofago specifico viene aggiunta al materiale patologico, viene incubata in un termostato e quindi viene nuovamente determinata la quantità di fago. Se è aumentato, significa che il batteriofago ha "trovato" cellule della sua "propria" specie per la replicazione, quindi nel materiale patologico sono presenti batteri della specie desiderata.
2. Nel processo di identificazione di una coltura pura, vengono utilizzate specie e tipo di batteriofagi.
UN. I batteriofagi delle specie vengono utilizzati per l'indicazione dei fagi. La coltura pura isolata viene seminata con un prato su piastra di agar e su di essa viene fatta cadere una goccia del batteriofago della specie. Se la coltura appartiene alla specie desiderata, nel luogo di applicazione della goccia non si verificherà alcuna crescita, altrimenti si osserverà una crescita batterica nel luogo di applicazione della goccia fagica. A volte, dopo l'applicazione del batteriofago, la piastra di Petri della piastra di agar viene inclinata, consentendo alla goccia di scorrere lungo il bordo della piastra (motivo per cui questo metodo è chiamato "goccia a goccia").
B. I batteriofagi tipici vengono utilizzati per la tipizzazione dei fagi. Il principio del metodo è il seguente.
1. Il ceppo da tipizzare viene seminato con un prato su plate agar.
2. Quindi, gocce di batteriofagi tipici vengono lasciate cadere sulla superficie seminata (ciascuno nel proprio quadrato, contrassegnato in anticipo, ad esempio, con un glassgraph sul fondo di una capsula Petri).
3. La piastra di inoculazione viene incubata in un termostato.
4. L'esperienza viene presa in considerazione registrando "punti sterili" o "placche" - luoghi di mancata crescita nel sito di applicazione di una goccia di batteriofago, a cui è sensibile questa opzione batteri.
5. Fagovar (fagotipo) viene designato elencando i fagi tipici che lisano questa variante.
B. L'uso di batteriofagi (di solito specie) per il trattamento è indicato come terapia fagica. Ai fini del trattamento, i batteriofagi vengono applicati localmente (sotto forma di irrigazione della superficie interessata, iniezione in un focus locale processo patologico ecc.), poiché la loro somministrazione parenterale porta allo sviluppo di una risposta immunitaria verso una proteina fagica estranea. Se un batteriofago terapeutico viene utilizzato per via orale (per trattare infezioni intestinali), allora è meglio utilizzare il farmaco sotto forma di compresse, rivestite con un guscio resistente agli acidi che si dissolve nell'ambiente alcalino dell'intestino - i batteriofagi sono molto sensibili al pH basso e vengono rapidamente inattivati in ambiente acido stomaco.
B. Profilassi dei fagi: l'uso di un batteriofago (di solito anche una specie fagica) per prevenire lo sviluppo infezione batterica. Attualmente utilizzato per la prevenzione delle emergenze tifo e dissenteria (la profilassi d'emergenza si riferisce a un insieme di misure per prevenire lo sviluppo della malattia dopo che l'atto di infezione è già avvenuto, cioè l'agente patogeno è entrato nel corpo del paziente).
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